岳　勝，朱　平，岳　磊，喬國華

(鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院急診科，河南 洛陽　471000)

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急性肺損傷大鼠呼吸膜AQP1和AQP5的表達(dá)

岳勝，朱平，岳磊，喬國華

(鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院急診科，河南 洛陽471000)

目的確定水通道蛋白AQP1及AQP5是否在大鼠肺泡毛細(xì)血管膜(呼吸膜)表達(dá),進(jìn)而研究急性肺損傷(ALI)大鼠AQP1和AQP5的表達(dá)調(diào)節(jié)及激素干預(yù)的作用。方法采用親和的抗人AQP1和AQP5抗體,應(yīng)用免疫組化及免疫電鏡的方法研究AQP1及AQP5在呼吸膜的分布。選用肺泡內(nèi)灌注脂多糖(LPS)制作大鼠ALI動(dòng)物模型,研究ALI時(shí)呼吸膜AQP1及AQP5的變化。結(jié)果免疫染色顯示AQP1主要表達(dá)于正常肺組織的微血管內(nèi)皮,而AQP5主要表達(dá)于肺泡I型上皮細(xì)胞。免疫組化分析進(jìn)一步表明LPS灌注后4h～48hAQP1及AQP5在呼吸膜的表達(dá)均下降;AQP1蛋白于LPS灌注后24h及激素干預(yù)后有部分恢復(fù)(P<0.05),而AQP5無這種恢復(fù)現(xiàn)象。結(jié)論 ALI時(shí)AQP1及AQP5在呼吸膜的表達(dá)減少,提示ALI時(shí)AQP1和AQP5的下降表達(dá)可能與其液體轉(zhuǎn)運(yùn)的異常有關(guān)。

水通道蛋白1，水通道蛋白5，急性肺損傷，激素

臨床中，肺水腫的形成涉及肺間質(zhì)和毛細(xì)血管的液體轉(zhuǎn)運(yùn)，近年來關(guān)于肺組織中液體轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制的研究顯示，水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一組在哺乳動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)的水選擇通道的分子家族,它們可以增強(qiáng)漿膜面水通透力的功能，因而可以提供快速液體轉(zhuǎn)運(yùn)的通路[1，2]。在一些病理?xiàng)l件下，其可影響和破壞肺組織流體的運(yùn)輸，造成充血性心力衰竭、呼吸窘迫綜合征、肺水腫損傷等。目前，涉及到水通道蛋白調(diào)節(jié)急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的研究還很少。本研究探討了水通道蛋白家族成員AQP1和AQP5在大鼠肺泡毛細(xì)血管膜的表達(dá)，并研究內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷(ALI)大鼠模型中AQP1和AQP5的表達(dá)調(diào)節(jié)及激素干預(yù)的作用。

1　材料和方法

1.1動(dòng)物

雄性SD大鼠共45只，均購自上海交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(SCXK(滬) 2013-0013)，體質(zhì)量(230±15)g，所有大鼠均在鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(SYXK (豫) 2011-0076)的清潔環(huán)境下飼養(yǎng)觀察，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后使用。

1.2試劑和儀器

山羊抗人AQP1多克隆抗體，大鼠抗人AQP5單克隆抗體，小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自美國Sigma公司，免疫組化S-P試劑盒，DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術(shù)公司。RPMI Medium 1640培養(yǎng)基，Western-blot轉(zhuǎn)印儀，蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司。另備24孔板、OMEM培養(yǎng)液、DMSO、酶標(biāo)儀、漩渦振蕩器、移液槍等。

1.3急性肺損傷動(dòng)物模型的制備

將SD大鼠隨機(jī)分為3組，即NS組(對(duì)照組)(n=10)，脂多糖(LPS)組(n=20)和激素組(n=15)。將3組大鼠均用七氟烷麻醉，暴露氣管，將NS對(duì)照組(n=10)按0.5 mL/kg NS灌注大鼠氣管，12 h后觀察其生命體征和肺組織變化。將LPS (E. coli serotype 055: B5 LPS, Sigma, USA)按200 μg/kg溶于無菌NS，使用25號(hào)針頭予大鼠0.5 mL/kg氣管注射，觀察氣管注射LPS后4 h、12 h、24 h和48 h等不同階段(n=5)的大鼠肺組織變化，激素組大鼠給予0.5 mL/kg LPS(200 μg/kg)氣管內(nèi)注射,并同時(shí)給予甲基強(qiáng)的松龍(30 mg/kg)尾靜脈注射。觀察注射后4 h、12 h、24 h等不同階段(n=5)的大鼠肺組織變化。

1.4樣本檢測

將大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)，頸動(dòng)脈插管監(jiān)測血壓。將大鼠放血處死，暴露肺組織和氣管。采用2.5 mL的37℃無菌無熱原的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)進(jìn)行經(jīng)右主氣管進(jìn)行灌洗肺組織，共計(jì)9次。丟棄第1次的灌洗液，將其他8個(gè)2.5 mL灌洗液餾分回收和匯總。使用標(biāo)準(zhǔn)法計(jì)算其總細(xì)胞數(shù)。

將細(xì)胞固定并行HE染色。將BAL在1 000 r/min離心10 min，并收集。BAL中的白蛋白濃縮5倍并用溴甲酚綠法測定。右下肺部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，每個(gè)肺切片常規(guī)用蘇木精染色處理，光鏡下觀察。對(duì)大鼠左上肺行免疫組化研究，通過電子顯微鏡和免疫電子顯微鏡檢查，左肺的其余部分進(jìn)行稱量，獲得肺濕重，然后將其放置于60℃溫箱內(nèi)干燥脫水5 d。待其重量不再變化時(shí)稱其干重。

1.5免疫組織化學(xué)和免疫電鏡觀察

AQP1和AQP5在肺組織中的表達(dá)：(1)免疫組化染色：按試劑盒說明書操作?？笰QPI抗體濃度1∶ 1000，抗AQP5抗體濃度1∶ 1000。圖像分析測AQP1和AQP5陽性染色的平均吸光度(A)。(2)免疫電鏡染色：擾AOP5抗體濃度1∶ 1000。(3)肺組織胞膜蛋白AOP1及AQP5分析：免疫印跡法一抗 (抗AQP1抗體1∶ 1000：抗AQP5抗體，1∶ 500)，4℃過夜孵育，二抗(堿性磷酸酶標(biāo)記，1∶ 2000)孵育后顯色。陽性顯色為棕黃色,經(jīng)UVP掃描儀掃描成像，計(jì)算曲線下面積的A值。

1.6免疫組化染色結(jié)果判定

AQP1和AQP5在肺組織中的表達(dá)強(qiáng)度依陽性細(xì)胞數(shù)分為四級(jí):(1)陰性(-):陽性細(xì)胞數(shù)<5%;(2)弱陽性(+):陽性細(xì)胞數(shù)5%～20%;(3)陽性(++):陽性細(xì)胞數(shù)20%～60%;(4)強(qiáng)陽性(+++):陽性細(xì)胞數(shù)>60%。

1.7Western-blot檢測各組肺組織中 AQP1和AQP5蛋白含量

各組肺組織塊稱重，加入蛋白裂解液以及PMSF(50 μL PMSF + 3 mL 蛋白裂解液)，用勻漿器研磨組織；4℃裂解30 min，置入4℃恒溫離心機(jī)，以離心半徑10 cm、12 000 r/min 離心15 min。收集上清液，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。將樣品蛋白8 μg在 5%～17%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)PVDF 膜，PBS 液加0.05% Tween-20 (PBS-T)洗滌，2% 脫脂奶粉室溫封閉2 h；再用PBS-T洗膜，加AQP1和AQP5一抗，4℃孵育過夜，PBS-T 洗滌，二抗(羊抗兔/鼠 IgG)室溫孵育 2 h，PBS-T 洗膜，用 ECL 方法在暗室顯影，X線片曝光。采用Image Pro Plus 圖像分析軟件分析結(jié)果。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0軟件：計(jì)數(shù)資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用方差分析，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　LPS組各階段BALF中PMN%和肺組織中AQP1和AQP5含量

注：*P<0.05, vs. NS 對(duì)照組;#P<0.05, vs. LPS 4 h～12 h 組.

Note：*P<0.05, vs. the NS control group;#P<0.05, vs. the LPS 4-12 h groups.

2　結(jié)果

2.1肺損傷的嚴(yán)重程度

3組中所有大鼠均存活。LPS組大鼠呼吸正常，和NS對(duì)照組大鼠的平均動(dòng)脈壓95±2.6 mmHg比較，LPS組大鼠的平均動(dòng)脈壓明顯降低，4 h和12 h的平均動(dòng)脈壓分別為68±6.6 mmHg和71±6.8 mmHg，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。24 h和48 h大鼠的平均動(dòng)脈壓分別為83±10.4 mmHg和87±7.9 mmHg，雖有部分恢復(fù)，但和NS對(duì)照組大鼠相比，差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

LPS灌注后，大鼠的肺濕干重比在顯著增加4 h和12 h時(shí)顯著增加，分別為6.73±0.68和6.50±0.59，和NS對(duì)照組大鼠(4.48±0.37)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。和NS對(duì)照組大鼠(4.48±0.37)比較，LPS組大鼠24 h和48 h時(shí)肺濕干重比的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2LPS組的組織學(xué)檢查

組織學(xué)檢查顯示，LPS注入大鼠氣管后，4 h和12 h后，大鼠肺間質(zhì)水腫，肺組織明顯中性粒細(xì)胞浸潤。電鏡顯示大鼠肺組織Ⅰ型肺泡上皮腫脹，細(xì)胞膜突出像是肺泡腔空間的泡沫，同時(shí)，Ⅱ型細(xì)胞絨毛干枯脫落。在24 h和48 h后，在肺組織中檢測到類似的組織學(xué)變化，在脂多糖灌注后，肺間質(zhì)水腫緩解。電鏡觀察肺泡毛細(xì)管膜尚連續(xù)，但厚度不均勻。

2.3AQP1和AQP5在正常肺組織細(xì)胞中的分布

在NS對(duì)照組，免疫標(biāo)記法顯示AQP1主要分布在肺組織微血管的內(nèi)皮細(xì)胞膜，以及少部分分布在肺上皮細(xì)胞膜(圖1)。檢測顯示AQP5主要表達(dá)在I型肺泡膜上表達(dá)(圖2)，但不在II型肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)分布。免疫電鏡顯示AQP1在微血管內(nèi)皮細(xì)胞的頂端和基底膜上，而AQP5主要存在于I型肺泡上皮細(xì)胞的頂膜(圖3)。

2.4不同組間AQP1和AQP5的表達(dá)

氣管內(nèi)灌注LPS 4 h～48 h后，免疫組化分析大鼠肺組織中AQP1和AQP5的表達(dá)。與NS對(duì)照組比較，LPS組AQP1和AQP5在細(xì)胞中表達(dá)的位置和特異性染色的細(xì)胞類型不變。但是，和NS對(duì)照組比較，LPS組各個(gè)階段的AQP1表達(dá)均降低(圖1和4)。與4 h～12 h階段的LPS組大鼠相比，24 h～48 h后，LPS組大鼠的AQP1表達(dá)部分恢復(fù)(表1)。另一方面，LPS組大鼠肺組織AQP5表達(dá)4 h～48 h各個(gè)階段均有所降低，24 h～48 h后也沒有任何的恢復(fù)(圖5)。

此外，結(jié)果顯示，和LPS組相比，激素組大鼠在氣管內(nèi)灌注LPS聯(lián)合甲基強(qiáng)的松龍的注射4 h～12 h后，大鼠肺組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞AQP1的表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但Ⅰ型肺泡細(xì)胞中AQP5的表達(dá)則不受甲基強(qiáng)的松龍的影響(表1)。此外，激素組大鼠在注射甲基強(qiáng)的松龍4 h～12 h后，BAL液中白蛋白濃度和PMN%顯著下降，證明激素組肺泡毛細(xì)血管膜通透性部分恢復(fù)。

圖1　NS組AQP1主要在肺組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)(箭頭示，SABC，×40)Fig.1　The expression of AQP1 in NS group was mainly expressed in microvascular endothelial cells in the lung tissue. Arrowhead indicates SABC.×40

圖3　免疫電鏡顯示，I型肺泡上皮細(xì)胞頂膜型中表達(dá)AQP5。(箭頭示，SABC，標(biāo)尺=20 μm)Fig.3　AQP5 is expressed in the apical membrane of type I alveolar epithelial cells, shown by immunoelectron microscopy. Arrowhead indicates SABC. Bar=20 μm

圖5　免疫組化顯示：氣管內(nèi)灌注LPS 12 h后，I型肺泡細(xì)胞AQP5表達(dá)降低。(箭頭示，SABC，×40)Fig.5　Immunohistochemistry shows that the expression of AQP5 in type I alveolar cells is decreased at 12 h after LPS perfusion LPS. Arrowhead indicates SABC. ×40)

圖2　免疫組織化學(xué)染色顯示AQP5在Ⅰ型肺泡細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(箭頭示SABC，×100)Fig.2　Immunohistochemical staining shows that AQP5 is expressed in type I alveolar cells. Arrowhead indicates SABC. ×100

圖4　免疫組織化學(xué)顯示：氣管內(nèi)灌注LPS 4 h后，肺組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞的AQP1表達(dá)顯著降低。(箭頭示，SABC，×40)Fig.4　Immunohistochemistry shows that the expression of AQP1 in microvascular endothelial cells of lung tissue was significantly decreased at 4 hours after LPS perfusion. Arrowhead indicates SABC. ×40

2.5Western-blot 檢測各組大鼠肺組織AQPl和AQP5蛋白表達(dá)

LPS組大鼠經(jīng)LPS灌注后4 h，AQP1蛋白量減少至NS對(duì)照組的(45.2±4.4)%(P<0.05)。AQP5降至NS對(duì)照組的(68.6±8.9)%(P<0.05，n=5)；24 h后AQPI蛋白量降至NS對(duì)照組的(63.4±5.9)%，AQP5降至NS對(duì)照組的(61.4±4.6)%,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3　討論

水通道蛋白(aquaporins, AQPs)[3]是一種存在生物膜上的分子量為28000的具有通透水分功能的內(nèi)在蛋白。水通道蛋白通過減小水越膜運(yùn)動(dòng)的阻力而使細(xì)胞間水分遷移的速率加快。水通道蛋白的嵌入使生物膜對(duì)水的通透能力大大提高,因此可以通過改變水孔蛋白的活性和調(diào)節(jié)水孔蛋白在膜上的豐度兩種途徑來調(diào)節(jié)膜對(duì)水的通透能力[4]。目前在人類細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)的AQP至少有12種, 均具有選擇性的讓水分子通過的特性。在動(dòng)物中如腎臟、眼、腦中都存在AQP。而在肺組織中有6種AQP表達(dá)，其中AQPl主要分布在肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，AQP5主要分布在肺泡I型細(xì)胞的頂膜面，這種分布表明AQPI、AQP5與肺水的形成和吸收過程密切相關(guān)[5]。

Towne等[6]采用免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色法測銀屑患者的皮膚組織中AQP5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)不同于正常表皮，AQP5在銀屑病皮損和皮損周圍的表皮中表達(dá)下降。使用Tewameter RTM210 和 CorneometerRCM 820 檢測銀屑病患者皮損及周圍的結(jié)果顯示：TEWL增加、水合作用下降。研究者們認(rèn)為，AQP5的表達(dá)是引起銀屑病患者皮損部位的干燥的一個(gè)關(guān)鍵因素。Nakakoshi M等[7]發(fā)現(xiàn)，皮膚鱗狀細(xì)胞癌強(qiáng)表達(dá)AQP5蛋白，以及創(chuàng)傷愈合過程中AQP5對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞起作用等現(xiàn)象，推進(jìn)了深入研究AQP5參與了皮膚腫瘤的過程。研究發(fā)現(xiàn)，暴露于腫瘤誘導(dǎo)劑，AQP5基因敲除鼠未出現(xiàn)皮膚腫瘤，而野生型小鼠則出現(xiàn)多種腫瘤；皮膚乳頭瘤狀細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)AQP5，并與增殖標(biāo)記物K14共定位，這一點(diǎn)與皮膚鱗癌類似。在皮膚腫瘤的發(fā)生過程中，AQP5基因敲除小鼠對(duì)腫瘤誘導(dǎo)劑導(dǎo)致的皮膚腫瘤有明顯的抵抗性[8]。

研究顯示，AQP1主要表達(dá)于肺泡周圍的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在NS對(duì)照組，免疫標(biāo)記法顯示AQP1主要分布在肺組織微血管的內(nèi)皮細(xì)胞膜，以及少部分分布在肺上皮細(xì)胞膜。檢測顯示AQP5主要表達(dá)在I型肺泡膜上表達(dá)，但不在II型肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)分布。免疫電鏡顯示AQP1在微血管內(nèi)皮細(xì)胞的頂端和基底膜上，而AQP5主要存在于I型肺泡上皮細(xì)胞的頂膜。AQPI、AQP5在呼吸膜不同的表達(dá)位置，推測其可能具有不同的生理功能[10]。

在本研究中，組織學(xué)檢查顯示，LPS注入大鼠氣管后，4 h和12 h后，大鼠肺間質(zhì)水腫，肺組織明顯中性粒細(xì)胞浸潤。電鏡顯示大鼠肺組織I型肺泡上皮腫脹，細(xì)胞膜突出像是肺泡腔空間的泡沫，同時(shí)，II型細(xì)胞絨毛干枯脫落。在24 h和48 h后，在肺組織中檢測到類似的組織學(xué)變化，在脂多糖灌注后，肺間質(zhì)水腫緩解。電鏡觀察肺泡毛細(xì)管膜尚連續(xù)，但厚度不均勻。氣管內(nèi)灌注LPS 4 h～48 h后，免疫組化分析大鼠肺組織中AQP1和AQP5的表達(dá)。與NS對(duì)照組比較，LPS組AQP1和AQP5在細(xì)胞中表達(dá)的位置和特異性染色的細(xì)胞類型不變。但是，和NS對(duì)照組比較，LPS組各個(gè)階段的AQP1表達(dá)均降低。與4 h～12 h階段的LPS組大鼠相比，24 h～48 h后，LPS組大鼠的AQP1表達(dá)部分恢復(fù)。另一方面，LPS組大鼠肺組織AQP5表達(dá)4 h～48 h各個(gè)階段均有所降低，24 h～48 h后也沒有任何的恢復(fù)。

此外，結(jié)果顯示，和LPS組相比，激素組大鼠在氣管內(nèi)灌注LPS聯(lián)合甲基強(qiáng)的松龍的注射4 h～12 h后，大鼠肺組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞AQP1的表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但Ⅰ型肺泡細(xì)胞中AQP5的表達(dá)則不受甲基強(qiáng)的松龍的影響(表1)。此外，激素組大鼠在注射甲基強(qiáng)的松龍4 h～12 h后，BAL液中白蛋白濃度和PMN%顯著下降，證明激素組肺泡毛細(xì)血管膜通透性部分恢復(fù)。

綜上所述，AQP1和AQP5雖然均是AQP的家族成員，但兩者在結(jié)構(gòu)及功能上均有較明顯的差異，根據(jù)本研究的結(jié)果，我們推測它們?cè)谕瓿梢后w轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中可能通過不同的刺激方式發(fā)揮不同的作用。

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Expression of AQP1 and AQP5 is decreased in the alveolar-capillary membrane in rats with acute lung injury

YUE Sheng, ZHU Ping, YUE Lei, QIAO Guo-hua

(Department of Emergency, Luoyang Central Hospital, the Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Luoyang, Henan 471000, China)

ObjectiveTo determine if aquaporin1 (AQP1) and aquaporin5 (AQP5) are expressed in the alveolar-capillary membrane in rats, and to investigate the changes of AQP1 and AQP5 expression in the rat with acute lung injury. Methods The distribution of AQP1 and AQP5 in alveolar capillary membrane was investigated by immunohistochemistry and immunoelectron microscopy with affinity-purified antibodies to human AQP1 and AQP5. The possibility that alveolar capillary membrane AQP1 and AQP5 undergo altered regulation was studied by a rat model established using intra-tracheal instillation of lipopolysaccharide (LPS). ResultsImmunolabelling showed that AQP1 was stained primarily in the microvascular endothelium of normal lungs, while AQP5 was expressed in type I pneumocytes. Immunohistochemical analysis showed a significant decrease in the expression of AQP1 and AQP5 in injured lungs at 4-48 h after LPS instillation. AQP1 protein was resumed partly at 24 h after LPS instillation and steroid administration, whereas AQP5 was unchanged. ConclusionsThe decreased expressions of AQP1 and AQP5 in injured lungs suggest that both of them may play a role in abnormal fluid transportation.

Aquaporin 1, AQP1; Aquaporin 5, AQP5; Acute lung injury; Fluid transportation; Steroid; Rat

岳勝(1980-)，男，主治醫(yī)師，研究方向：內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠呼吸膜AQP1及AQP5表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究。

研究報(bào)告

R-33

A

1671-7856(2016) 08-0070-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.08.011

2016-05-30