陳弘磊 王偉? 李芳瓊 劉琴 趙桂枝

miR-21 miR-205聯合檢測對非小細胞肺癌的診斷價值

陳弘磊 王偉? 李芳瓊 劉琴 趙桂枝

目的 探討聯合檢測血液中microRNA-205（miR-205）和microRNA-21（miR-21）對非小細胞肺癌的診斷價值。方法 收集27例非小細胞肺癌患者術前及術后血清，并收集29例健康志愿者血清作為對照。應用實時熒光定量PCR 法檢測以上標本中miR-205和miR-21 的表達水平，并分析其與臨床病理特征的相關性，評估m(xù)iR-205和miR-21聯合檢測對非小細胞肺癌的診斷價值。結果 非小細胞肺癌患者術前血清中miR-205和miR-21的表達水平均高于健康人群（P< 0.05），其中23例非小細胞肺癌患者術后血清中miR-205的表達水平較術前明顯降低（P＜0.01），術前與術后miR-21表達水平無顯著性差異（P＞0.05）。而術前血漿中miR-205和miR-21的表達水平與患者淋巴結轉移及Dukes分期存在相關性（P<0.05）。miR-205和miR-21 的受試者（ROC）曲線下面積為0.968，非小細胞肺癌患者和健康人群的敏感度和特異度分別為96.3%和89.7%。結論 血清miR-205和miR-21作為新的生物學指標，兩者聯合檢測對非小細胞肺癌的診斷和預后監(jiān)測有一定價值。

非小細胞肺癌 miR-21 miR-205 聯合檢測

肺癌是一種全球范圍內常見的癌癥，出現臨床表現時已經是晚期，故有較高的致死率［1］。約75%的肺癌患者在確診時已經是晚期或癌細胞已經轉移，因此肺癌患者5年生存率＜15%［2］。miRNA在血清/血漿中可以穩(wěn)定存在，表達量不受各種保存條件、保存時間的影響；且miRNA的表達無年齡、性別差異，具有腫瘤特異性［3］。因此，血清/血漿中miRNAs可能成為一種新的非侵入性腫瘤標志物。2013年10月至2015年至5月作者通過實驗研究，探討聯合檢測血液中miR-205、miR-21對非小細胞肺癌的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 樣本 采集EDTA抗凝血漿樣本，健康對照組29例，男15例，女14例；年齡（46.3±11.2）歲。肺癌組27例，男16例，女11例；年齡（49.6±9.7）歲。病理診斷均為非小細胞肺癌，術前均未進行過化療、放療，1例術后脫落。肺癌患者術前、術后3d分別采集血漿。

1.2 試劑及儀器 血漿miRNA提取采用miRcute miRNA Isolation Kit。反轉錄試劑盒采用TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit。探針由自行設計并合成；反轉錄莖環(huán)引物、PCR擴增引物由自行設計合成。cel-miR-39購自QIAGEN。BioRad CFX實時熒光定量PCR儀。

1.3 血漿miRNA的提取及cDNA制備 使用miRcute miRNA Isolation Kit提取血漿miRNA，使用TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit反轉錄成cDNA。

1.4 PCR反應 miRNA反轉錄為cDNA后，按照下面組分進行PCR反應。循環(huán)參數設置：95℃10min預變性，然后95℃15s 和60℃1min退火延伸40個循環(huán)。熒光通道檢測選擇FAM。單點熒光檢測在60℃。反應體系為20μl，包括檢測試劑混合液（18.5μl）、DSC-Taq DNA聚合酶（0.2μl）、cDNA（1.3μl）。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS軟件。計算術前術后ΔmiR-21、ΔmiR-205的差值xi=Ct（術后ΔmiRNA）-Ct（術前ΔmiRNA），然后計算差值的平均數和標準差，并計算T0，并查表得t0.05。若T0＜t0.05，則術前術后無顯著差異；若T0＞t0.05，則術前術后差異顯著。

2 結果

2.1 肺癌組術前與術后miR-21、miR-205檢測結果比較 miR-21術后與術前比較差異無統(tǒng)計學意義，miR-205術后與術前比較差異有統(tǒng)計學意義。見圖1、圖2、表1。

2.2 兩組術前、術后miR-21、miR-205比較 兩組術前比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01），可用于肺癌的判定；而兩組術后比較，miR-21差異有統(tǒng)計學意義，miR-205差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

圖1 miR-21在術前與術后的表達差異

圖2 miR-205在術前與術后的表達差異

表1 肺癌組術前與術后miR-21、miR-205比較

表2 miR-21、miR-205與正常健康組t-test結果比較

2.3 ROC曲線和cut-off值 從圖3及表3中可知，曲線下面積為0.968，表明miR-21和miR-205聯檢對肺癌的判別有意義（P＜0.001）。根據ROC曲線坐標，選擇敏感度+特異性最大值-1.435作為cut-off值，此時靈敏度為0.963，特異性為0.897。比較Ct計算公式為：Ct（-ΔmiR-21）×0.578 + Ct（-ΔmiR-205）×0.550，若比較Ct ＞ -1.435，則為肺癌；比較Ct ＜ -1.435，則為健康。

圖3 ΔmiR-21、-ΔmiR-205ROC曲線

表3 曲線下面積

3 討論

微小RNA（miRNAs）是一類核苷酸序列高度保守、長度為21～23nt的非編碼單鏈RNA，主要參與轉錄后水平的基因調控，介導基因沉默。人類miRNA編碼基因有700多個結合位點，而將近1/3基因的表達調控均有miRNA的參與，涉及細胞分化、增殖與凋亡等生命活動的多個進程。miRNA的表達異常能夠引發(fā)多種疾病，甚至導致腫瘤的發(fā)生［4］。研究表明，大量的miRNA位于與腫瘤相關的基因區(qū)、雜合性丟失區(qū)與擴增區(qū)［5］，且在較多惡性腫瘤（如肺癌、肝癌、結腸癌、卵巢癌等）組織中均有異常表達，提示腫瘤發(fā)生可能與miRNA有密切關聯［6］。

miR-21是miRNA家族中成員之一，成熟的miR-21主要通過與靶mRNA的3'UTP完全或不完全的特異性配對從而影響mRNA的降解，或通過與靶mRNA序列互不配對結合而阻斷其翻譯過程，最終在轉錄后水平上調控基因表達［7］。進而調節(jié)一系列機體重要的生理過程，包括細胞的增殖、分化與凋亡等。近年來對miR-21與腫瘤的大量研究表明，miR-21在多種腫瘤組織中均有異常表達，典型的有肺癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌等［8］；研究顯示miR-21擁有抗凋亡作用，相當于癌基因功能。有研究表明，在非小細胞肺癌患者的血清中，miR-146b、miR-221、let-7a、miR-155、miR-17-5p、miR-27a、miR-106a的表達量顯著下降，而miR-29c的表達量則顯著升高［9］。miR-21、miR-210在NSCLC表達譜中通常表現為顯著下調［10］。Wang 等［11］認為，與健康組比較，非小細胞肺癌患者血清中的miR-21顯著提高。miR-21的高表達水平和淋巴結轉移及淋巴結分期相關。

miR-205是miRNA家族中與腫瘤發(fā)生密切相關的另一成員，核苷酸序列高度保守，位于人第一號染色體LOC642587位點第二內含子中［12］。miR-205在各種腫瘤中的表達水平并不一致，有研究報道，在前列腺癌和乳腺癌等腫瘤組織中miR-205表達明顯下降［13］，而在肺癌組織中表達顯著上調。Markou等應用PCR技術對非小細胞肺癌患者研究中，檢測到腫瘤細胞中miR-205高表達，但表達量與生存率無關［14］。

本資料結果表明，非小細胞肺癌患者術前miR-21、miR-205均明顯升高，采用ROC曲線評估，當cut-off值取-1.435時，靈敏度為96.3%，特異性為89.7%，具有極其良好的對臨床非小細胞肺癌的診斷價值。 肺癌患者術前與術后血漿miR-21差異無統(tǒng)計學意義，而miR-205差異有統(tǒng)計學意義，肺癌患者術前與術后miR-21與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，而miR-205術前差異有統(tǒng)計學意義，術后差異無統(tǒng)計學意義。表明血漿miR-21在肺癌術后3d并未立即下降，而miR-205則會立即下降至正常水平，因此miR-205可能為非小細胞肺癌的一個相關的腫瘤指標，可能比其他miR更加靈敏地反映腫瘤的變化。綜上所述，聯合檢測miR-21、miR205能更有效提高非小細胞肺癌的檢出率，為術后的治療效果提供更可靠的依據，有望為腫瘤診斷、治療及預后過程提供一種新方法。

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Objective To explore the diagnostic value of plasma microRNA-205（miR-205）and microRNA-21（miR-21） in Non-small Cell Lung Cancer. Methods The preoperative plasma specimens from 29 patients with Non-small Cell Lung Cancer and their postoperative （at day 7 after operation） plasma specimens （only 26 cases among them） were collected. At the same time，the plasma specimens from 33 healthy volunteers were used as the controls. The expression of miR-205 and miR-21 in these samples was measured by real-time fl uorescence quantitative-PCR，and its relationship with the clinical characteristics of patients with Non-small Cell Lung Cancer was analyzed. Results The expression level of miR-205 and miR-21 in preoperative plasma from the patients with Non-small Cell Lung Cancer was higher than that from healthy volunteers （P<0.05）. As compared with the preoperative plasma，the expression of miR-205 in postoperative plasma from 23 cases was decreased remarkably （P＜0.01）.however，the expression level of miR-21 in postoperative plasma group and preoperative plasma group didn't signifi cantly differ （P＞0.05）. The expression of miR-205 and miR-21 in preoperative plasma had a signifi cant impact on lymphatic metastasis and Duke's stage （P<0.05）. For discriminating Non-small Cell Lung Cancer patients from healthy volunteers，the area under the receiver operating characteristic curve was 0.968，and the sensitivity and specifi city were 96.3% and 89.7%，respectively. Conclusion Plasma miR-205 and miR-21，as new biomarkers，the combined detection of them may help the diagnosis of non-small Cell Lung Cancer

Non-small Cell Lung Cancer MicroRNAs Diagnosis Plasma MicroRNA-205 MicroRNA-21

·基礎研究·

浙江省公益技術研究社會發(fā)展項目（2013C33199）

310000 浙江中醫(yī)藥大學（陳弘磊）

310012 浙江省立同德醫(yī)院（王偉 李芳瓊 劉琴趙桂枝）