張群英 王黎 陳祖云 陳歡? 方序

產(chǎn)褥期陰道微生態(tài)研究

張群英 王黎 陳祖云 陳歡? 方序

目的 應(yīng)用細(xì)菌基因測(cè)序技術(shù)了解陰道內(nèi)微生物種群的分布情況。方法 采集10例產(chǎn)褥期婦女陰道分泌物（pH值、清潔度、膿球、滴蟲(chóng)、霉菌等）測(cè)定雌激素，提取微生物總基因組，擴(kuò)增16S rRNA 測(cè)序。另選擇正常育齡婦女為對(duì)照，比較兩組結(jié)果了解產(chǎn)褥期陰道微生態(tài)情況，菌種組成情況和生理情況。結(jié)果 正常婦女陰道中的乳桿菌屬（Lactobacillus）的含量是產(chǎn)褥期婦女的>100倍，早期產(chǎn)婦，乳酸桿菌顯著下降，這導(dǎo)致其抵抗力下降。不動(dòng)桿菌屬在產(chǎn)婦早期的的陰道中含量上升，表明其抵抗力下降。結(jié)論 產(chǎn)褥期孕婦的微生態(tài)呈現(xiàn)一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，早期產(chǎn)褥婦女與正常婦女有顯著差異，而在產(chǎn)褥后期的微生態(tài)基本與正常婦女一致。16S rRNA測(cè)序可以較好的揭示陰道微生態(tài)的變化，其有希望成為一個(gè)新的、系統(tǒng)的評(píng)估手段。不僅可以分析產(chǎn)婦陰道微生態(tài)的恢復(fù)情況，還能用于檢測(cè)和評(píng)估其綜合情況。

陰道微生態(tài) 16S rRNA 高通量測(cè)序 乳酸桿菌 不動(dòng)桿菌

正常陰道內(nèi)有多種細(xì)菌存在，這種微生態(tài)的形成對(duì)阻止泌尿生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生起著至關(guān)重要的作用，如乳酸桿菌維持陰道正常的酸性環(huán)境，抑制其它病原體生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)褥期婦女陰道微生態(tài)失調(diào)占75.31%，陰道炎占9.1%［1］。陰道微生態(tài)的評(píng)價(jià)方法中，宏基因技術(shù)相比傳統(tǒng)的培養(yǎng)有明顯的優(yōu)越性［2］。為更好的了解我國(guó)婦女在產(chǎn)褥期陰道微生態(tài)的變化，作者采集產(chǎn)褥期婦女和正常育齡婦女的陰道分泌物，應(yīng)用細(xì)菌基因測(cè)序技術(shù)以期了解陰道內(nèi)微生物種群的分布情況。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2013年9月至2014年11月本院10例產(chǎn)褥期婦女（產(chǎn)后6～8周）陰道分泌物（標(biāo)記為T(mén)）為觀察組，年齡25～38歲，平均年齡33.5歲。以6周為界，＜42d為產(chǎn)褥期早期（6例），42～56d為產(chǎn)褥期晚期（4例）。另收集正常育齡婦女的陰道分泌物（10例，標(biāo)記為N）為對(duì)照組，年齡21～47歲，平均年齡35歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有入選婦女近＜3d均無(wú)性生活；無(wú)陰道分泌物異常、接觸性出血；無(wú)宮頸手術(shù)史、無(wú)妊娠；無(wú)盆腔放射治療史；年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法 （1）標(biāo)本采集：所有婦女均用無(wú)菌刮板及長(zhǎng)棉簽從陰道上1/3處獲取陰道分泌物。（2）無(wú)菌刮板檢測(cè)pH值、清潔度、膿球、滴蟲(chóng)、霉菌等檢查和雌激素測(cè)定。（3）DNA提取：長(zhǎng)棉簽采集的微生物懸浮于0.5ml滅菌PBS溶液中，加入50μl溶菌酶（10mg/ml），6μl變?nèi)芫兀?5000 U/ ml；Sigma-Aldrich），3μl溶葡球菌酶（4000 U/ ml；Sigma-Aldrich），和41μl TE50緩沖液（10 mM Tris·HCL和50 mM EDTA，pH 8.0），37℃消化1h。然后利用細(xì)菌基因組提取試劑盒（Cat No. D-6000A，Gentra，USA）提取DNA。（4）高通量16S rDNA測(cè)序： 對(duì)細(xì)菌的V4區(qū)，利用Miseq進(jìn)行測(cè)序，擴(kuò)增引物為：F：5'-AYTGGGYDTAAAGNG-3'，R：5'-TACNVGGGTATCTAATCC-3'，采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行。（5）測(cè)序結(jié)果的分析：測(cè)序所得結(jié)果根據(jù)不同的Barcode對(duì)序列的來(lái)源進(jìn)行分類，舍棄無(wú)連接的序列。對(duì)連接上的序列進(jìn)行過(guò)濾（連續(xù)相同堿基＜6，模糊堿基N＜1），獲得最終序列［2］。應(yīng)用QIIME，根據(jù)序列的相似度，將序列歸為多個(gè)OTU（操作分類單元）［3］，同時(shí)應(yīng)用mothur軟件中的uchime的方法去嵌合體序列［4］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 QIIME調(diào)用uclust對(duì)序列進(jìn)行聚類，選取每個(gè)類最長(zhǎng)的序列為代表序列。采用blast的方法對(duì)silva數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得每個(gè)OTU分類學(xué)信息。OTU產(chǎn)出后，統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品含有OTU情況及每個(gè)OTU中含有序列的數(shù)目，并采用T-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)差異OTU。

2 結(jié)果

2.1 陰道微生態(tài)狀況 觀察組中，陰道微生態(tài)正常6例（60.00%）；陰道微生態(tài)失調(diào)4例（40.00%）。包括BV患者3例（75.00%）；外陰陰道假絲酵母菌?。╒VC）患者1例（25.00%）。對(duì)照組中，陰道微生態(tài)正常7例（70.00%）；其余為陰道微生態(tài)失調(diào)3例（30.00%），包括BV患者2例（66.67%）；外陰陰道假絲酵母菌病（VVC）患者1例（33.33%）；兩組年齡及陰道分泌物pH值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。觀察組雌激素均值為99.94pmol/L，對(duì)照組雌激素均值為522.84pmol/L，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 陰道微生態(tài)菌群狀況 （1） 測(cè)序情況統(tǒng)計(jì)：本資料對(duì)20例樣本的16S rDNA進(jìn)行測(cè)序，其中N3和N5兩個(gè)樣本測(cè)序失敗，未納入后期分析（見(jiàn)表1）。（2）陰道微生態(tài)菌種在產(chǎn)褥期和正常生育期的OTU數(shù)目統(tǒng)計(jì)：應(yīng)用QIIME，根據(jù)序列的相似度＞97%歸為一個(gè)OTU。結(jié)果發(fā)現(xiàn)絕大部分的OTU在正常婦女和產(chǎn)褥期婦女中均有檢測(cè)，占全部OTU的63%。在正常樣本中特異性檢測(cè)到OTU189個(gè)，而在產(chǎn)褥期樣本中特異性檢測(cè)到318個(gè)。（3）陰道微生態(tài)菌種在產(chǎn)褥期和正常生育期的生物多樣性分析：在群落豐富度的指數(shù)（Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)）的分析發(fā)現(xiàn)，兩組樣本無(wú)差異，同時(shí)用群落多樣性的指數(shù)（Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)）也未發(fā)現(xiàn)差異。結(jié)果表明無(wú)論是產(chǎn)褥期的婦女，還是正常的婦女，其陰道微生態(tài)的生物多樣性不會(huì)有顯著性的變化，起變化的可能僅是部分菌在數(shù)量上的差異（見(jiàn)表2）。（4）兩組樣本的主成分分析：采用偏最小二乘方判別分析（PLS-DA）過(guò)濾與模型分類不相關(guān)信號(hào)即正交信號(hào)，獲得PLSDA模型，其模型質(zhì)量參數(shù)為，R2X=0.423，R2Y=0.9，Q2=0.138。結(jié)果顯示，正常樣本很好的聚為一類，而產(chǎn)褥期的婦女則分為三組，Ⅰ組（T1和T4），Ⅱ組（T2，T5，T6，T7），以及Ⅲ組（T3，T8，T9，T10）。Ⅲ組和正常孕婦聚為一類。（5） 產(chǎn)褥期和正常生育期主要的差異菌：根據(jù)PCA的分析結(jié)果，為避免干擾，將除Ⅲ組之外的產(chǎn)褥期的樣本（即Ⅰ和Ⅱ組）和正常樣本進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)差異的菌屬。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，健康婦女陰道常駐菌包括乳桿菌（lactobacillus）、假絲酵母菌、B族鏈球菌（Group B Streptococcus）、表皮葡萄球菌（staphylococcus）、梭狀桿菌（Clostridium Septicum）、糞鏈球菌（Streptococcus faecalis）、消化球菌（peptococcus）、類桿菌（bacteroid），而過(guò)路菌主要為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、腸桿菌（enterobacteria）、丙酸桿菌（Propionibacterium）、消化鏈球菌（peptostreptococcus）和韋榮球菌（Veillonella）［4］。本資料中兩組主要的差異微生物（見(jiàn)表3）。正常婦女的陰道中的乳桿菌屬的含量是產(chǎn)褥期婦女的＞100倍。進(jìn)一步分析乳酸桿菌的種類（見(jiàn)表4），此次試驗(yàn)中主要鑒定到的乳桿菌屬為L(zhǎng)actobacillus iners和s-未能鑒定的種，這兩種菌的含量和在產(chǎn)褥期孕婦中顯著降低，另外鑒定到的Lactobacillus brevis和Lactobacillus coleohominis差異不顯著，原因可能與其含量較少相關(guān)。在產(chǎn)褥期婦女樣本中Clostridiales，Peptoniphilus，Acinetobacter等幾類菌有顯著的升高（見(jiàn)表2）。

表1 樣品序列數(shù)統(tǒng)計(jì)表

表2 生物多樣性指標(biāo)

表3 兩組婦女陰道中菌屬比較

表4 兩組婦女的陰道中乳桿菌屬比較

3 討論

正常婦女的微生態(tài)一致性較好，基本歸為一類，表明在正常婦女的陰道微生態(tài)以相當(dāng)穩(wěn)定的形式存在。相對(duì)于正常孕婦，產(chǎn)褥期孕婦的陰道微生態(tài)卻以3組形式存在，結(jié)合采樣時(shí)間，作者分析Ⅲ組的采樣時(shí)間為產(chǎn)褥期的后期，因此，其微生態(tài)的結(jié)構(gòu)特征已經(jīng)傾向于正常婦女，而Ⅰ組和Ⅱ組為相對(duì)早期，因此，其微生態(tài)與正常婦女有顯著差異。表明婦女在產(chǎn)后，其陰道微生態(tài)也存在一個(gè)逐漸修復(fù)的過(guò)程，這是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，而這種修復(fù)的機(jī)制目前尚未明確。

產(chǎn)褥期婦女和正常婦女陰道乳桿菌的差異表明，早期產(chǎn)褥期婦女的陰道微生態(tài)有明顯的改變。陰道的健康和乳桿菌的數(shù)量變化及pH變化均密切相關(guān)［5］。乳桿菌是陰道正常菌群中最重要的益生菌成員，其能維持陰道內(nèi)較低的酸度，從而抑制部分病原菌的生長(zhǎng)，維持陰道自凈及抗感染中起著關(guān)鍵作用，乳桿菌數(shù)量的下降和pH上升會(huì)提升早產(chǎn)以及感染性傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)。因此，產(chǎn)褥期的婦女尤其要注意避免引起產(chǎn)褥期菌群失調(diào)的行為，如產(chǎn)褥期性生活行為、不良陰道清潔方式等［6］。

臨床標(biāo)本中常能分離到的不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌有醋酸鈣不動(dòng)桿菌、洛菲不動(dòng)桿菌、溶血不動(dòng)桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、瓊氏不動(dòng)桿菌、約翰遜不動(dòng)桿菌，最常見(jiàn)的是鮑曼不動(dòng)桿菌。由不動(dòng)桿菌引起的醫(yī)院內(nèi)感染近10年來(lái)增高的趨勢(shì)明顯，且多是多重耐藥菌株。最常見(jiàn)的分離部位是呼吸道、尿道和傷口，所致的疾病包括肺炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、皮膚和傷口感染、腹膜炎、尿路感染等。在產(chǎn)褥期婦女樣本中發(fā)現(xiàn)這類菌的水平升高，表明產(chǎn)褥期的婦女的陰道抗菌能力的下降。

綜上，通過(guò)婦女陰道的細(xì)菌菌群的豐度信息可以增進(jìn)對(duì)細(xì)菌菌群和健康之間關(guān)系的了解。早期只能通過(guò)qPCR或者培養(yǎng)對(duì)有限的菌群進(jìn)行相對(duì)定量，而現(xiàn)在我們通過(guò)16S rDNA測(cè)序的方式，可以更為直接的獲取相對(duì)完整的陰道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的信息并很好的揭示陰道微生態(tài)的變化，它有希望成為一個(gè)新的、系統(tǒng)的評(píng)估手段。不僅可以分析產(chǎn)婦產(chǎn)褥期陰道單一群落恢復(fù)情況，而且還能用于檢測(cè)和評(píng)估其綜合健康情況。

1 張群英，薛映辛，張艷玲，等.482例產(chǎn)褥期陰道微生態(tài)調(diào)查.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2011，23：552～553.

2 Ravel J， Gaer P， Abdo Z，et al. Aginal microbiome of reproductive-age women. Proc Natl Acad Sci USA， 2011， 108： 4680～4687.

3 Magoc T， Salzberg SL. FLASH： fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinformatics 2011， 27（21）：2957～2963.

4 Caporaso JG， Kuczynski J， Stombaugh J， et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods 2010，7（5）：335～336.

5 Edgar RC， Haas BJ， Clemente JC，et al. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics 2011， 27（16）：2194～2200.

6 李蘭娟.感染微生態(tài)學(xué).北京：人民出版社，2002：422～424.

Objective The use of a bacterial gene sequencing technology to understand the distribution of vaginal microbial populations. Methods Changxing County randomly selected MCH 42-56 days postpartum women for vaginal secretions （pH value，cleanliness，pus ball，trichomoniasis，mold，etc.） inspection and measurement of estrogen and extracted total microbial genome amplified 16S rRNA sequencing. At the same time，randomly selected control group of normal women of childbearing age，for vaginal secretions （pH value，cleanliness，pus ball，trichomoniasis，mold，etc.） inspection and measurement of estrogen extracted total microbial genome sequencing of 16S rRNA amplification. Compare two Results thus understand postpartum vaginal microfl ora： The species composition and physiological condition. Results By sequencing experiments，we found that in women with normal vagina， the content of Lactobacillus （Lactobacillus） is more than 100 times for puerperal women，at an early maternal，their lactobacilli signifi cantly decreased，which caused the decrease in the protective ability. We also found Acinetobacter species of early maternal vaginal content increased，which also caused the decrease of protective ability. Conclusion Postpartum maternal microfl ora present a dynamic process，early and normal have signifi cant differences in their late microecological consistent with normal women. 16S rRNA sequencing may well reveal changes in vaginal microfl ora，which promises to be a new assessment tools，system ，which can be used not only to analyze the recovery of maternal vaginal microfl ora，but to detect and assess its overall situation.

Vaginal microfl ora 16S rDNA High-throughput sequencing Lactobacillus Acinetobacter.

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（2012KYB202）

313100 浙江省長(zhǎng)興縣婦幼保健院 （張群英 王黎 陳祖云）

310012 浙江省微生物研究所（陳歡 方序）