許慧芳，王俊力，邱昕，萬小林，陳國華

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·論著·

不同來源內皮細胞生物學性狀的比較

許慧芳，王俊力，邱昕，萬小林，陳國華

目的：比較大鼠胸主動脈來源的成熟內皮細胞和骨髓間充質干細胞（MSCs）來源的內皮細胞生物學性狀及各自Akt表達的情況。方法：分離培養(yǎng)大鼠胸主動脈來源內皮細胞，誘導MSCs分化為內皮細胞，對2組細胞的細胞形態(tài)、增殖能力、成管能力進行比較，通過Western blotting比較其表面標記表達情況及Akt表達情況。結果：MSCs來源的內皮細胞形態(tài)學與成熟內皮細胞不盡相同，增殖能力和成管能力均強于后者。2組細胞均可表達內皮細胞的表面標記，但成熟內皮細胞表達強于分化而來的內皮細胞（P<0.05）。Akt表達在分化而來的內皮細胞明顯高于成熟內皮細胞（P<0.05）。結論：MSCs分化而來的內皮細胞和成熟內皮細胞存在生物學性狀和Akt表達差異。

內皮細胞；骨髓間充質干細胞；Akt

內皮損傷所致的內皮功能失調是動脈粥樣硬化的始動因素，血管受損部位內皮化推遲及炎癥細胞浸潤、平滑肌細胞遷移和過度增殖可促進血栓形成及新內膜增生，導致靶血管狹窄發(fā)生[1]，快速再內皮化對于恢復正常血管功能和調節(jié)新生血管內膜增生有至關重要的作用。成熟內皮細胞在損傷區(qū)域的再生緩慢，大多數情況下，新生的內皮細胞增殖、遷移、再排序是一個不完整的過程[2]。近年來有很多研究聚焦于內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）[3]和干細胞來源內皮細胞，證實兩者對于血管再生和再內皮化的作用，這提示干細胞來源的前體細胞或內皮細胞可能是移植修復內皮損傷的突破口。Akt又稱作蛋白激酶B（proteinkinase B，PKB）[4]，是PI3K重要的下游分子，其中Akt1促進細胞存活和增殖，可能在促進受損動脈快速再內皮化中起重要作用。本研究探討成熟內皮細胞和骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）分化的內皮細胞生物學性狀的差異，以及各自Akt表達的不同。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 健康SD大鼠，雌雄不限，體質量200～250 g，由同濟醫(yī)學院動物中心提供。1.1.2主要試劑與儀器 DMEM/F12（購于美國Hyclon公司）；胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA消化液、膠原酶Ⅰ（購于美國Gibco公司）；重組大鼠血管內皮生長因子（recombinant vascular endothelial growth factor，rVEGF，購于以色列Prospec公司）；小鼠抗血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、血管內皮生長因子受體2（kinase insert domain receptor，KDR）、內皮型一氧化氮合酶（endothelialnitric oxide synthase，Enos）、磷酸化Akt（P-Akt）抗體及羊抗小鼠IgG二抗（購于美國Santa Cruz公司）；基質膠（購于美國BD公司）。

1.2方法

1.2.1大鼠胸主動脈內皮細胞原代培養(yǎng)及傳代和免疫熒光鑒定 大鼠頸部脫臼處死，消毒。無菌操作環(huán)境中剪開大鼠胸骨，取約2 cm左右的胸主動脈，去除外膜及脂肪組織。在培養(yǎng)基中將手術線穿過動脈管并封住血管的兩端，加入適量膠原酶Ⅰ，在37℃、5%CO2環(huán)境中消化約30 min。加入胎牛血清終止消化，去除兩端，將血管剪成3～4個1×1 mm2大小的組織塊分別放入六孔培養(yǎng)板中，加入培養(yǎng)液（90%DEME/F12+10%FBS）培養(yǎng)約3 d。更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)直至細胞長滿培養(yǎng)皿底部，消化并按1∶3傳代培養(yǎng)。傳代前以血細胞計數板計算細胞總數。免疫熒光鑒定：在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min；PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗（VWF）并放入濕盒，4℃孵育過夜；加熒光二抗：PBST浸洗爬片滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中孵育1 h，PBST浸洗切片；復染核：滴加DAPI避光孵育5 min，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI；封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.2大鼠MSCs培養(yǎng) 大鼠脫臼處死，消毒。在無菌環(huán)境下取大鼠的脛骨和股骨，用5 mL注射器吸取適量DEME/F12沖出骨髓，去除大的雜質后倒入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，吸取培養(yǎng)基進行吹打懸浮后分瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)基為90%DEME+10%FBS。待細胞長滿瓶底后傳代。

1.2.3MSCs誘導分化為內皮細胞 取第 2～3代MSCs，待其長至瓶底80%時開始加入誘導液（97% DMEM/F12+3%胎牛血清+VEGF 50 μg/mL）進行誘導。每隔2 d進行誘導換液，第13天停止誘導，加90% DMEM/F12，10%胎牛血清培養(yǎng)液進行正常培養(yǎng)，按1∶3比例進行傳代。傳代前以血細胞計數板計算細胞總數。按如上所述免疫熒光鑒定其表面標志。

1.2.4內皮細胞成管實驗 取基質膠和24孔培養(yǎng)板，放入冰塊上中待用，吸取約30 μL基底膠在24孔板上鋪膠。取培養(yǎng)中的成熟內皮細胞和新分化內皮細胞，倒掉廢液，加入PBS緩沖液清洗細胞，去除雜質。吸出緩沖液，加入適量胰蛋白酶，在顯微鏡下觀察，當細胞由扁平逐漸變成圓形時加入含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。將消化好的細胞溶液移至離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄上清，重新懸浮細胞。取適量細胞液加入基質膠包被的24孔板中，加入適量培養(yǎng)液。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。自2 h開始，每隔0.5 h在顯微鏡下觀察成管情況，并拍照。

1.2.5Western blotting檢測 提取成熟內皮細胞、新分化內皮細胞、MSCs 3組細胞的總蛋白，測蛋白濃度后，各樣品取50 μg總蛋白上樣電泳，根據蛋白分子量配制6%的PAGE膠電泳。根據預染Marker顯示，判斷目的蛋白得到充分分離后，停止電泳。常規(guī)轉膜，用含5%脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2 h。用封閉液稀釋相應的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜。TBST充分洗滌PVDF 膜5～6次，5 min/次。用封閉液稀釋相應的HRP標記二抗1∶50 000稀釋，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室溫搖床孵育2 h。顯色曝光：TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次。每張膜滴加適量的ECL底物液，孵育數分鐘。

1.3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量結果以（M±s）表示，t檢驗，方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1細胞形態(tài)學觀察

MSCs生長情況：原代細胞接種后，細胞較多較雜，培養(yǎng)液外觀渾濁，經過數次換液后，混雜細胞逐漸去除，可見培養(yǎng)瓶內梭貼壁細胞，后期隨著細胞數目增多，細胞呈輻射狀排列生長。傳代后細胞生長增快，24 h完全貼壁，一般7 d左右可在瓶底完全長滿融合，見圖1A。內皮細胞生長情況：原代內皮細胞培養(yǎng)3 d左右，組織塊周圍開始出現內皮細胞，14 d左右細胞融合成片，形態(tài)一致，大小均勻，邊界清晰，呈典型的“鋪路石樣”鑲嵌排列生長，vWF表達陽性，見圖1B、D。誘導分化的內皮細胞：誘導分化培養(yǎng)液中生長的MSCs，生長旺盛，13 d時觀察細胞，形態(tài)學介于干細胞和成熟內皮細胞之間，梭形生長，有“鋪路石樣”改變趨勢，vWF表達陽性，見圖1C、E。

圖1　細胞形態(tài)學觀察

2.2細胞增殖情況

成熟內皮細胞自第2代開始，細胞增殖到（5～8）× 106個細胞的時間，大約為5～6 d，平均（5.7±0.40）d （n=6）；新分化內皮細胞傳代后計算增殖情況，至（5～8）×106個細胞大約4～5 d，平均（4.4±0.37）d（n=6）；成熟內皮細胞增殖速度低于新分化內皮細胞，有顯著性差異（t=5.782，P<0.001）。

2.3成管實驗結果

在基質膠包被的培養(yǎng)板上，成熟內皮細胞大約6 h可形成管腔樣結構并連接成網狀，見圖2A。新分化內皮細胞需要4 h左右，成管分支更多且粗大，見圖2B。

圖2　內皮細胞成管實驗

2.4Western blotting檢測結果

內皮細胞及新分化的內皮細胞均可表達特異性表面標記Vwf、KDR、eNOS，MSCs幾乎不表達（少量表達eNOS）；與細胞增殖成長相關的Akt表達，則是MSCs>新分化內皮細胞>成熟內皮細胞，見圖3、表1，提示相對成熟內皮細胞，新分化內皮細胞的Akt有更高的表達。

表1　3種細胞表達Vwf、KDR、eNOS、P-Akt比較（M±s）

圖3　細胞表面標記表達檢測

3　討論

血管內膜受損后快速修復，對于預防和治療頸動脈粥樣硬化性狹窄和頸動脈支架成形術術后再狹窄，是關鍵的一步，對于腦卒中預防意義重大[5]。長期以來人們一直認為成熟內皮細胞的增殖遷移能力極其有限，并不適合用于移植，因而內皮細胞直接移植修復血管內膜的研究也鮮有報道。EPCs是內皮細胞的前體。眾多體內和體外試驗均證實EPCs對于血管再生和再內皮化的作用，但EPCs特異性表面標志目前尚缺乏統(tǒng)一的意見。本研究表明，新分化的內皮細胞在形態(tài)學上與成熟內皮細胞存在差異，但可表達公認的內皮細胞表面標記，雖然表達強度與成熟內皮細胞相比略弱。可以以此獲得成分單一，性質穩(wěn)定的內皮細胞，且具有更好的增殖和成管能力。

Akt是PI3K重要的下游分子，目前發(fā)現至少有3種形式的Akt：Akt1、Akt2和Akt3。眾多實驗證實抑制AKT信號途徑可抑制血管再生[6,7]，本研究表明，新分化內皮細胞具有更強增殖和血管形成能力，且Akt表達明顯強于成熟內皮細胞。故推斷2組細胞的差異可能與Akt信號系統(tǒng)有關，而上調Akt表達，可能會使成熟內皮細胞獲得與新分化內皮細胞一樣的增殖能力和成管能力，可進一步設計實驗進行驗證。Akt信號系統(tǒng)是非常復雜的通路，該通路對于內皮細胞增殖能力和成管能力的具體作用機制也有待深入研究。

[1]Kirton JP,Xu Q.Endothelial precursors in vascular repair[J].Microvasc Res,2010,l79:193-199.

[2]Reidy MA,Clowes AW,Schwartz SM.Endothelial regeneration.V.Inhibition of endothelial regrowth in arteries of rat and rabbit[J].Lab Invest, 1983,49:569-575.

[3]崔斌,黃嵐.大鼠脾源性內皮細胞移植在損傷血管內膜修復中的作用[J].第三軍醫(yī)大學學報,2006,28:1553-1556.

[4]Gosen N,She QB.AKT and cancer-is it allmTOR[J].Cancer Cell,2006, 10:254-256.

[5]Chu L,Hao H,Luo M,et al.Ox-LDL modifies the behavior of bone marrow stem cells and impairs their endothelial differentiation via inhibition of Akt phosphorylation[J].J Cell Mol Med,2011,15:423-432.

[6]Sami A,Karsy M.Targeting the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in glioblastoma:novel therapeutic agents andadvances in understanding[J]. Tumour Biol,2013,34:1991-2002.

[7]Polivka J Jr,Janku F.Molecular targets for cancer therapy in the PI3K/AKT/Mtor pathway[J].Pharmacol Ther,2014,142:164-175.（本文編輯：王晶）

Comparison of Biological Characters between Different Sources of Endothelial Cells

XU Hui-fang,WANG Jun-li,QIU Xin,WAN Xiao-lin,CHEN Guo-hua.Department of Neurology,Wuhan Traditional Chinese Medicine Hospital,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China

Objective:To compare the biological characters and Akt expression between rat endothelial cells and mesenchymal stem cells(MSCs)-derived endothelial cells.Methods:The endothelial cells derived from the thoracic aorta of rats were isolated and cultured,and MSCs were induced to differentiate into endothelial cells.The two groups of cells were compared for their morphology,proliferation,tube formation ability,and the expression of surface marker and Akt were exmaine by Western blot.Results:The morphology was different between stem cell-derived endothelial cells and mature endothelial cells.Proliferation and tube formation abilities of stem cell-derived endothelial cells were stronger than the latter.The both groups could express endothelial cells surface markers,but the mature endothelial cells were more intensive(P<0.05).Akt expression in stem cell-derived endothelial cells was significantly higher than that of mature endothelial cells(P<0.05).Conclusion:There were biological and Akt differences between MSCs-derived endothelial cells and mature endothelial cells.

endothelial cells;mesenchymal stem cells;Akt

R741；R321

A

10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.01.001

華中科技大學附屬武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院神經內科

武漢430022

基金課題

武漢市學科帶頭人計劃

（No.20127113045 8）；

湖北省自然科學基金重點項目

（No.CDA061）；

武漢市科技局

（No.201506170101 1618）

2015-01-26

陳國華

cghys2008@126. com