姚勇芳,趙　鑫,廖延智

(廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東廣州 510300)

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茶源酵母菌吸附茶多酚條件及機(jī)理初步分析的研究

姚勇芳,趙鑫*,廖延智

(廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東廣州 510300)

本實(shí)驗(yàn)主要研究茶源酵母菌富集茶多酚的吸附機(jī)理和條件。以吸附率及酵母菌數(shù)為指標(biāo),研究死活酵母吸附差異、吸附方式以及活酵母對(duì)茶多酚吸附條件。結(jié)果表明:茶源酵母對(duì)茶多酚吸附能力不同;編號(hào)C的酵母菌表面結(jié)構(gòu)上擁有更具優(yōu)勢(shì)的氫鍵基團(tuán),帶正電量較多,細(xì)胞表面的范德華力特性強(qiáng),與茶多酚中的酚類基團(tuán)有更大吸附作用,對(duì)茶多酚的吸附率最高,達(dá)到15.49%?；罱湍肝讲瓒喾幽芰︼@著性強(qiáng)于死酵母?；罱湍竿ㄟ^物理性吸附使茶多酚附著于酵母細(xì)胞表面,通過主動(dòng)吸附為主進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。茶多酚吸附率與酵母菌生長(zhǎng)量密切相關(guān),培養(yǎng)20 h,酵母菌與吸附率達(dá)到最高;培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為200 r/min,培養(yǎng)溫度33 ℃,培養(yǎng)基pH為4.0,添加10 mL的30 mg/mL茶多酚溶液時(shí),酵母菌對(duì)茶多酚吸附率達(dá)到21.03%。通過實(shí)驗(yàn)研究,能夠?yàn)楦缓瓒喾討?yīng)用于食品藥品行業(yè)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

茶源酵母菌,茶多酚,吸附機(jī)理,吸附條件

酵母細(xì)胞具有很好的吸附性能,能吸附重金屬、酚類化合物、硫代化合物、芳香族化合物等,酵母細(xì)胞吸附重金屬的特性已廣泛地應(yīng)用于污水處理[1-2],其表面的強(qiáng)吸附能力,也可用于食品生產(chǎn)中,用于改善食品的風(fēng)味及口感,提高其穩(wěn)定性,如Pradelles等[3]采用酵母細(xì)胞吸附去除紅酒中的4-乙基苯酚,降低了紅酒的辛辣味,提高了穩(wěn)定性。

茶酵母是來源于低溫發(fā)酵制作烏龍茶時(shí),發(fā)酵液底部的沉淀,經(jīng)洗凈、消毒、干燥等再制造而成。它含有茶葉所有營(yíng)養(yǎng)的精華包括咖啡因、茶堿、兒茶素、黃酮,茶氨酸、天冬氨酸等30多種氨基酸以及鉀、磷、鈣等30種無機(jī)元素。茶多酚(Tea Polyphenols,TP)是茶葉中一類主要的化學(xué)成分。從天然茶葉中提取的茶多酚類物質(zhì)具有抗氧化、抗誘變、抗輻射、抗癌[4]、抗菌、清除自由基[5]等多種功效。茶多酚的常規(guī)提取方法有溶劑浸提法、金屬離子沉淀法、樹脂吸附分離法、超臨界流體萃取法、超聲波浸提法及微波浸提法[6]。酵母細(xì)胞可以作為酚類物質(zhì)的承載體,將其從某個(gè)體系中吸附去除或胞裂釋放于另一個(gè)體系,從而有效提取茶多酚,但目前相關(guān)研究報(bào)道極少。

茶多酚及其衍生物的開發(fā)和利用,已引起國(guó)內(nèi)外茶學(xué)、藥學(xué)及食品行業(yè)等研究領(lǐng)域人士的極大關(guān)注,有必要對(duì)其吸附機(jī)理及其吸附的影響因素進(jìn)行深入研究。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)茶源性酵母細(xì)胞對(duì)茶多酚的吸附機(jī)理及富集條件影響因素研究,為富含茶多酚酵母應(yīng)用于食品藥品行業(yè)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

普洱茶(用于分離酵母菌)廣州三支葉貿(mào)易有限公司;茶多酚河南天成生物科技有限公司。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基:稱馬鈴薯(洗凈去皮)200 g取切塊,加適量水煮沸2 min打漿2 min,沖洗勻漿機(jī)并定容到1000 mL,加入葡萄糖20 g,溶化分裝,121 ℃滅菌20 min,待用。

虎紅培養(yǎng)基廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

10%的福林酚試劑廣州翔博生物科技有限公司;7.5%碳酸鈉溶液廣州正和公司;500 mg/kg農(nóng)用鏈霉素東莞國(guó)豐生物科技有限公司;磷酸鹽緩沖鹽廣州市都博化工有限公司;三氯甲烷、十六烷、無水乙醚、正己烷廣州市櫧鑫化工有限公司,所用試劑為分析純配制。

SE6027型電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HPX-9162 MBE型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱日本Yamato公司;SPX-150C型恒溫恒濕培養(yǎng)箱日本Yamato公司;SW-CJ-2D型紫外超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司;SC-3614高容量低速離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;QYC-200 恒溫培養(yǎng)搖床上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;S22PC可見分光光度計(jì)上海棱光技術(shù)有限公司;AB204-N電子分析天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DK-S26數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;YXQ-3OSH高壓滅菌鍋上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;勻漿機(jī)天津泰斯特儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1茶多酚檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程研究

1.2.1.1茶多酚標(biāo)準(zhǔn)系列茶多酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:稱取(0.110±0.001)g茶多酚,于100 mL容量瓶中溶解并定容到刻度,搖勻(現(xiàn)配)。采用移液管分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、7.0、10.0 mL于50 mL容量瓶中,分別用水定容到刻度,搖勻。

1.2.1.2測(cè)定移取茶多酚工作液,水(空白對(duì)照),測(cè)試液各1.0 mL于50 mL容量瓶?jī)?nèi),分別加入5.0 mL的10%福林酚,反應(yīng)5 min,加入4.0 mL 7.5% Na2CO3,加水定容至刻度,搖勻,室溫下放置1 h,用10 mm比色皿在765 nm波長(zhǎng)下,采用可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度,以吸收度A對(duì)系列濃度c(μg/mL)作回歸,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.2茶源酵母菌吸附茶多酚機(jī)理的研究

1.2.2.1吸附茶多酚的茶源酵母菌篩選普洱茶用無菌杯2～8 ℃冷藏2 h后用勻漿機(jī)磨粉,80～200目過篩收集。無菌水稀釋涂布到裝有500 mg/kg農(nóng)用鏈霉素的虎紅培養(yǎng)基平板上。挑選酵母菌典型特征菌落,40倍鏡檢,劃線分離,分別編號(hào),收集虎紅斜面培養(yǎng)基。分別挑取2環(huán)不同酵母菌斜面接入裝有100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的錐形瓶中,同時(shí)加入10 mL 50 mg/mL過濾除菌的茶多酚溶液,于28 ℃ 200 r/min的搖床中培養(yǎng)20 h,采用福林酚法測(cè)茶多酚吸光度,計(jì)算吸附率,篩選具有吸附茶多酚能力的酵母菌。酵母菌菌落總數(shù)依據(jù)GB 4789.15-2010方法。茶多酚吸附率測(cè)定:取適量茶多酚土豆培養(yǎng)液于離心管,3500 r/min離心15 min,取上清液,用水稀釋至100 mL,測(cè)定參照1.2.1測(cè)定吸光度。

式中,A:樣品測(cè)試液吸光度;V:樣品體積,100 mL;d:稀釋因子(通常為1 mL稀釋成100 mL,則其稀釋因子為100);SLOPEstd:茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率;V1:上清液體積,mL。

式中a:吸附前溶液的茶多酚含量;b:吸附后溶液的茶多酚含量。

1.2.2.4茶源酵母菌吸附茶多酚方式研究取3瓶裝有100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的錐形瓶,包扎滅菌。冷卻后向其中兩瓶接種2環(huán)酵母菌C,28 ℃搖床培養(yǎng)20 h后,其中1瓶加入10 mL 50 mg/mL經(jīng)過濾除菌的茶多酚溶液;另外1瓶進(jìn)行加熱煮沸,滅活酵母菌,再加入10 mL 50 mg/mL經(jīng)過濾除菌的茶多酚溶液,兩瓶平行于28 ℃靜置20 h后檢測(cè)茶多酚吸光度,比較死酵母、活酵母對(duì)茶多酚吸附區(qū)別。同時(shí),將10 mL 50 mg/mL過濾除菌的茶多酚溶液加入第3瓶馬鈴薯葡萄糖滅菌培養(yǎng)基中,28 ℃靜置20 h,檢測(cè)茶多酚吸光度,作為酵母吸附對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.2.3茶源酵母菌吸附茶多酚條件研究

1.2.3.1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)茶源酵母菌吸附茶多酚的影響8瓶裝有100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的錐形瓶,分別加入10 mL 50 mg/mL過濾除菌的茶多酚溶液,調(diào)pH至4.0,接種2環(huán)編號(hào)C酵母菌,于28 ℃的搖床中恒溫培養(yǎng),轉(zhuǎn)速200 r/min,分別培養(yǎng)0、4、8、12、16、20、24、28 h后測(cè)定酵母菌數(shù),研究酵母菌生長(zhǎng)曲線,檢測(cè)茶多酚吸光度,計(jì)算培養(yǎng)基茶多酚含量。另準(zhǔn)備8瓶100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基,不加茶多酚溶液,作為對(duì)照,研究酵母菌生長(zhǎng)曲線。

1.2.3.2培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對(duì)茶源酵母菌吸附茶多酚的影響5瓶裝有100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的錐形瓶,各加入10 mL 50 mg/mL過濾除菌的茶多酚溶液,調(diào)pH至4.0,接種2環(huán)編號(hào)C酵母菌,分別100、150、200、250、300 r/min搖瓶培養(yǎng),溫度28 ℃培養(yǎng)20 h。測(cè)定茶多酚吸光度,計(jì)算吸附率,選擇適宜的培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。

1.2.3.3溫度對(duì)茶源酵母菌吸附茶多酚的影響5瓶裝有100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的錐形瓶,各加入10 mL 50 mg/mL過濾除菌的茶多酚溶液,調(diào)pH至4.0,接種2環(huán)編號(hào)C酵母菌,轉(zhuǎn)速為200 r/min,分別在23、28、33、38、43 ℃搖瓶培養(yǎng)20 h,測(cè)定培養(yǎng)基茶多酚吸光度,測(cè)定培養(yǎng)基中茶多酚含量,選擇最適吸附溫度。

1.2.3.4茶多酚濃度對(duì)茶源酵母菌吸附茶多酚的影響吸取10 mL 10、30、50、70、90 mg/mL 過濾除菌的茶多酚溶液分別加入裝有100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基錐形瓶中,調(diào)pH至4.0,分別接種2環(huán)編號(hào)C酵母菌,33 ℃轉(zhuǎn)速為200 r/min搖瓶培養(yǎng)20 h,測(cè)定培養(yǎng)基中茶多酚吸光度,計(jì)算吸附率,選擇最適茶多酚濃度。

1.2.3.5pH對(duì)茶源酵母菌吸附茶多酚的影響5瓶裝有100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的錐形瓶,各加入10 mL 30 mg/mL過濾除菌的茶多酚溶液,調(diào)pH分別至 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0,各接種2環(huán)編號(hào)C酵母菌,33 ℃轉(zhuǎn)速為200 r/min搖瓶培養(yǎng)20 h,測(cè)定培養(yǎng)基中茶多酚吸光度,計(jì)算吸附率,選擇最適茶多酚pH。

1.2.3.6正交設(shè)計(jì)優(yōu)化酵母C的吸附條件考慮到諸多因素對(duì)酵母C的吸附率影響,本文在單因素考察的基礎(chǔ)上,選取影響較顯著的4個(gè)因素作為考察對(duì)象,即培養(yǎng)時(shí)間、溫度、轉(zhuǎn)速以及茶多酚濃度,以吸附率為指標(biāo),通過L9(34)正交設(shè)計(jì)(表1)實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出最佳工藝條件。

表1　正交設(shè)計(jì)水平因素表Table 1　Factor level in orthogonal designing test

2　結(jié)果與分析

2.1茶多酚檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程研究

由圖1可知,茶多酚檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0014x-0.0084,決定系數(shù)R2為0.9992,說明直線與原始數(shù)據(jù)擬合度較好。

圖1　茶多酚檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1　Standard curve of tea polyphenols detection

2.2茶源酵母菌吸附茶多酚機(jī)理的研究

2.2.1吸附茶多酚茶源酵母菌的篩選研究將普洱茶粉通過鏈霉素虎紅培養(yǎng)基選擇性分離,得到典型酵母菌菌落,如圖2。研究資料表明[9],茶源性酵母菌主要是產(chǎn)生酒精和產(chǎn)酯等生香酵母。如:異型漢遜酵母(Hansenulaanomala),魯氏酵母(Saccharomycesrouxii),球擬酵母(TorulopsisBerlese),釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),酒香酵母屬(Brettanomycessp),假絲酵母屬(Candidarkhout),產(chǎn)膜畢氏酵母(Pichiamembranaefaciens),小橢圓酵母(Saccharomycesmicroellipsoides)等。

圖2　茶源酵母篩選及編號(hào)C酵母菌鏡檢圖片F(xiàn)ig.2　The pictures of tea yeast selection and microscopic examination of serial number C yeast

通過茶多酚吸附能力實(shí)驗(yàn),將吸附能力較強(qiáng)的五種酵母菌,隨機(jī)編號(hào)A～E。酵母細(xì)胞的成分對(duì)其吸附性能有較大影響,不同酵母菌中蛋白質(zhì)和脂類種類及含量不同,新陳代謝能力不同,造成不同酵母菌的吸附能力不同。由圖3可知,編號(hào)C的酵母菌對(duì)茶多酚的吸附率最高,達(dá)到15.49%。

表2　酵母細(xì)胞表面的疏水性Table 2　Cell surface hydrophobicity of yeast

表3　酵母細(xì)胞菌懸液對(duì)不同有機(jī)溶劑的吸附情況Table 3　Adsorption of yeast cell suspension for different organic solvents

圖3　吸附茶多酚的茶源酵母篩選結(jié)果Fig.3　The screening results of tea polyphenols adsorbed tea polyphenols

2.2.2茶源酵母菌細(xì)胞表面疏水性對(duì)吸附的影響非極性分子之間存在有弱的、非共價(jià)的疏水相互作用,它們?cè)谒嘀袨楸荛_水分子而相互聚集。細(xì)胞表面與其它分子的聚集吸附的傾向可用細(xì)胞表面疏水性表示[[10]。采用微生物粘著碳烴化合物法(MATH法)測(cè)得分離得到五種不同茶源酵母細(xì)胞表面疏水性,結(jié)果如表2所示。CSH值越大,表明疏水性越強(qiáng)由表2可見,酵母C的CSH值達(dá)到50.2±3.17,細(xì)胞表面具有強(qiáng)的疏水性。茶源酵母細(xì)胞表面具有可形成氫鍵的基團(tuán)可能是影響細(xì)胞表面疏水性的重要因素,且這些基團(tuán)暴露位點(diǎn)越多,與茶多酚結(jié)合的位點(diǎn)則越多,則該細(xì)胞具有的茶多酚吸附能力則更強(qiáng)[11],酵母細(xì)胞壁存在富含-OH的β-葡聚糖,編號(hào)C的酵母菌對(duì)茶吸附率較高酵母細(xì)胞壁可能原因是該酵母菌在結(jié)構(gòu)上擁有較其他酵母更有優(yōu)勢(shì)的作用基團(tuán),與茶多酚中的酚類基團(tuán)有更大吸附作用力,可通過氫鍵的作用吸附茶多酚。

2.2.3酵母細(xì)胞表面給電性的測(cè)定選用三氯甲烷、十六烷、無水乙醚和正己烷四種溶劑測(cè)定CEC,其中三氯甲烷呈酸性,作為電子接受體,而無水乙醚呈堿性,可作為電子給予體;十六烷和正己烷為中性非極性溶劑,十六烷的性質(zhì)與三氯甲烷接近,正己烷的性質(zhì)與無水乙醚相似,但是,十六烷比正己烷表面存在更大的范德華力[12-13]。酵母細(xì)胞菌懸液對(duì)不同有機(jī)溶劑的吸附情況(CEC)如表3表示,從不同茶源細(xì)胞對(duì)三氯甲烷和無水乙醚的吸附情況比較來看,茶源酵母A和B與三氯甲烷(電子接受體)的親和力比與無水乙醚的更強(qiáng),細(xì)胞表面帶負(fù)電,與細(xì)胞本身的正電性相比,茶源酵母B帶負(fù)電量較多。茶源酵母C和D與無水乙醚(電子給予體)親和力更強(qiáng),細(xì)胞表面帶正電,與自身的負(fù)電性相比,茶源酵母D帶正電量較多。茶源酵母E與三氯甲烷和無水乙醚的親和力相近。與本身電荷相互作用相比,C、D、A細(xì)胞表面的范德華力更加顯著,與十六烷的親和力較強(qiáng),而B、E的范德華力比電荷作用力小。細(xì)胞表面的范德華力特性很強(qiáng),也有利于其對(duì)茶多酚的吸附。

結(jié)合表3和圖3結(jié)果,可知酵母細(xì)胞對(duì)茶多酚的吸附性能與細(xì)胞表面的帶電性及范德華力有關(guān),細(xì)胞表面帶正電量大,且范德華力越大,越有利于吸附茶多酚,吸附量可能越大。相反,細(xì)胞帶負(fù)電可能會(huì)對(duì)茶多酚的吸附產(chǎn)生影響,帶負(fù)電量越大,可能越不利于吸附。這與Pradelles等采用酵母吸附紅酒中4-乙基苯酚進(jìn)行吸附機(jī)制的研究結(jié)論一致[3]。

2.2.4茶源酵母菌吸附茶多酚方式研究由圖4可知,由于自動(dòng)氧化引起的茶多酚的損失,不影響死活酵母對(duì)茶多酚吸附能力比較實(shí)驗(yàn)。活酵母菌和死酵母菌對(duì)于茶多酚的吸附能力不同,活酵母菌的吸附率為15.88%±2.45%,而死酵母菌的吸附率僅為5.20%±1.02%,兩者對(duì)于茶多酚的吸附能力具有顯著的差異(p<0.05)?；罱湍讣?xì)胞對(duì)茶多酚的吸附包含了結(jié)構(gòu)吸附(物理吸附)與代謝吸附(化學(xué)吸附),酵母細(xì)胞壁存在富含-OH的β-葡聚糖,可通過氫鍵的作用吸附茶多酚;同時(shí),由于細(xì)胞表面的疏水性、電性以及范德華力等特性,使茶多酚首先以物理吸附的方式附著于酵母細(xì)胞表面[14]。同時(shí)茶多酚受到細(xì)胞內(nèi)部大量蛋白質(zhì)的化學(xué)吸附作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,茶多酚依靠氫鍵或者疏水鍵與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)多點(diǎn)結(jié)合,茶多酚的大量酚羥基與蛋白質(zhì)主鏈的-NHCO,側(cè)鏈上的-OH、-NH2以及-COOH以氫鍵的形式多點(diǎn)結(jié)合[15]。茶多酚進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,以主動(dòng)吸附為主。對(duì)于活體細(xì)胞而言,可以利用細(xì)胞新陳代謝作用提供能量供茶多酚完成主動(dòng)運(yùn)輸過程;而被動(dòng)吸附行為不需要新陳代謝作用提供能量,主要依靠胞內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)與茶多酚的氫鍵作用而進(jìn)行,可以少量地發(fā)生在死亡酵母細(xì)胞上。

圖4　活酵母與死酵母吸附茶多酚能力比較Fig.4 　Comparison of the adsorption of tea polyphenols with live yeast and yeast

2.3茶源酵母菌吸附茶多酚條件研究

2.3.1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)茶源酵母菌吸附茶多酚的影響研究由圖5可知,添加茶多酚的培養(yǎng)基茶源酵母生長(zhǎng)速度優(yōu)于未添加茶多酚的對(duì)照組,20 h生長(zhǎng)量最高,說明適當(dāng)添加茶多酚可以促進(jìn)茶源酵母生長(zhǎng),這與茶源酵母長(zhǎng)期在茶葉中的適應(yīng)特性有關(guān)。

圖5　茶源酵母菌生長(zhǎng)與吸附茶多酚的關(guān)系Fig.5　The relationship between the growth of tea yeasts and the adsorption of tea polyphenols

培養(yǎng)基中茶多酚含量隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降,20 h時(shí)含量最低,此時(shí)酵母菌生長(zhǎng)量最高,說明酵母菌吸附茶多酚有利于增殖。20 h后,酵母菌生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期,部分酵母菌出現(xiàn)自溶現(xiàn)象,導(dǎo)致吸附到胞內(nèi)的茶多酚又暴露出來,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中茶多酚含量略有上升[16]。

2.3.2培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對(duì)茶源酵母菌吸附茶多酚的影響研究由圖6可知,在發(fā)酵液溶氧濃度充足時(shí),酵母菌以好氧生長(zhǎng)為主,菌體增殖迅速。同時(shí),提高轉(zhuǎn)速,茶多酚能夠與酵母菌表面充分接觸,提高活性酵母菌化學(xué)吸附茶多酚的能力。轉(zhuǎn)速為200～300 r/min時(shí),酵母菌吸附茶多酚吸附趨于飽和,吸附率穩(wěn)定。因此,酵母菌吸附培養(yǎng)轉(zhuǎn)速設(shè)置為200 r/min適宜。

2.3.3培養(yǎng)溫度對(duì)茶源酵母菌吸附茶多酚的影響研究由圖7可知,培養(yǎng)溫度在28～38 ℃之間的酵母菌吸附率較高,33 ℃達(dá)到最高。茶源酵母菌來源于發(fā)酵茶,茶葉渥堆過程內(nèi)部溫度高,造成茶源性酵母菌具有較高耐熱性,最適生長(zhǎng)溫度較一般酵母菌(28～30 ℃)比較寬,所以培養(yǎng)基中茶多酚減少與活酵母菌生長(zhǎng)明顯相關(guān)。同時(shí),最適生長(zhǎng)溫度的提高,會(huì)使酵母蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得松散,分子內(nèi)的疏水性基團(tuán)就會(huì)充分的暴露出來,有利于多酚的羥基與之絡(luò)合,更多的酵母蛋白與茶多酚參與絡(luò)合反應(yīng)[17]。

圖6　轉(zhuǎn)速對(duì)酵母菌吸附茶多酚的影響Fig.6　Effect of rotational speed on the adsorption of tea polyphenols by yeasts

圖7　溫度對(duì)茶源酵母菌吸附茶多酚的影響Fig.7　Effect of temperature on the adsorption of tea polyphenols by tea yeasts

2.3.4茶多酚濃度對(duì)茶源酵母菌吸附茶多酚的影響研究由圖8可知,培養(yǎng)基中茶多酚濃度對(duì)酵母菌生長(zhǎng)影響不大,培養(yǎng)基中添加10 mL的30 mg/mL茶多酚溶液時(shí),酵母菌吸附茶多酚的量趨于飽和[7],細(xì)胞中蛋白質(zhì)不能提供充足的空間位點(diǎn)供茶多酚分子絡(luò)合。而繼續(xù)提高培養(yǎng)基中茶多酚的量,酵母菌的吸附總量差異不大,造成吸附率幾乎成線性下降。因此,培養(yǎng)基中添加10 mL 30 mg/mL茶多酚量,較為合適。

圖8　茶多酚濃度對(duì)酵母菌吸附茶多酚的影響Fig.8　Effects of tea polyphenols concentration on the adsorption of tea polyphenols by yeasts

2.3.5pH對(duì)茶源酵母菌吸附茶多酚的影響研究反應(yīng)體系的 pH在一定程度上也會(huì)影響茶源酵母細(xì)胞對(duì)茶多酚的吸附。由于茶多酚溶液在pH>8.0時(shí)極不穩(wěn)定,所以,在本實(shí)驗(yàn)考察的pH范圍為3.0～7.0。由圖9可知,茶源酵母細(xì)胞在pH為3.0～4.0時(shí)對(duì)茶多酚的吸附率能力強(qiáng)于pH為4.5～7.0時(shí)的吸附,可能是因?yàn)椴柙唇湍讣?xì)胞中大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在pH3.0～4.0附近,而在等電點(diǎn)附近1個(gè)pH的范圍內(nèi),蛋白質(zhì)的靜電斥力小于多酚和蛋白質(zhì)之間交聯(lián)的引力[18]。當(dāng) pH在此附近時(shí),有較多的蛋白質(zhì)與茶多酚參與絡(luò)合反應(yīng)。

圖9　pH對(duì)茶源酵母菌吸附茶多酚的影響Fig.9　Effect of pH value on the adsorption of tea polyphenols by yeasts

2.3.6正交設(shè)計(jì)優(yōu)化酵母C的吸附條件由表4和表5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明,酵母C對(duì)茶多酚吸附的因素影響順序?yàn)闀r(shí)間(A)>溫度(B)>轉(zhuǎn)速(C)>茶多酚濃度(D),最佳實(shí)驗(yàn)方案為A2B2C2D1,即培養(yǎng)時(shí)間為20 h,培養(yǎng)溫度為33 ℃,攪拌速率為200 r/min,添加10 mL濃度為30 mg/mL茶多酚。

表4　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 4　Projects and results of orthogonal designing test

表5　方差分析表Table 5　ANOVA table

按正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出的最優(yōu)吸附條件,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3批,所得的吸附率分別為21.28%、20.03%、21.78%,平均吸附率為21.03%±0.91%,說明優(yōu)選吸附工藝重現(xiàn)性良好。今后進(jìn)一步對(duì)茶源酵母吸附茶多酚因素研究以及因素水平顯著性差異優(yōu)化的條件設(shè)計(jì)。

3　結(jié)論

茶源酵母對(duì)茶多酚吸附能力不同,編號(hào)C的酵母菌表面結(jié)構(gòu)上擁有更有優(yōu)勢(shì)的氫鍵基團(tuán),帶正電量較多,細(xì)胞表面的范德華力特性強(qiáng),與茶多酚中的酚類基團(tuán)有更大吸附作用。對(duì)茶多酚的吸附率最高,達(dá)到15.49%?；罱湍肝讲瓒喾幽芰︼@著性強(qiáng)于死酵母?；罱湍竿ㄟ^物理性吸附使茶多酚附著于酵母細(xì)胞表面,通過主動(dòng)吸附為主進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。

通過茶多酚吸附優(yōu)化條件研究可知:茶多酚吸附率與酵母菌生長(zhǎng)量密切相關(guān),培養(yǎng)20 h時(shí),酵母菌與吸附率達(dá)到最高;優(yōu)化菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為200 r/min,培養(yǎng)溫度33 ℃,培養(yǎng)基pH4.0,添加10 mL的30 mg/mL茶多酚溶液時(shí),酵母菌對(duì)茶多酚吸附率達(dá)到21.03%。

[1]Tonk S,Nagy B,T?r?k A,et al.Cd(II),Zn(II)and Cu(II)bioadsorption on chemically treated waste brewery yeast biomass:the role of functional groups[J].Acta Chimica Slovenica,2015,62(3):736-746.

[2]Mekoue Nguela J,Sieczkowski N,Roi S,et al.Sorption of grape proanthocyanidins and wine polyphenols by yeasts,inactivated yeasts,and yeast cell walls[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2015,63(2):660-670.

[3]Pradelles R,Vichi S,Alexandre H,et al.Influence of the drying processes of yeasts on their volatile phenol sorption capacity in model wine[J].International Journal of Food Microbiology,2009,135(2):152-157.

[4]王岳飛,唐德松,樸宰日,等.茶多酚對(duì)荷瘤小鼠輻射損傷的影響[J].中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志,2004,24(3):263-264.

[5]Tenore G C,Daglia M,Ciampaglia R,et al.Exploring the nutraceutical potential from black,green and white Tea infusions-an overview[J].Current Pharmaceutical Biotechnology,2015,16(3):265-271.

[6]Both S,Chemat F,Strube J.Extraction of polyphenols from black tea-conventional and ultrasound assisted extraction[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2014,21(3):1030-1034.

[7]黃翔峰,方正,黃薇,等.MATH法表征環(huán)境微生物細(xì)胞表面疏水性的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào),2015,42(1):200-206.

[8]黨坦,方俊,蔣紅梅,等.粗飼料體外發(fā)酵特性及對(duì)微生物細(xì)胞膜界面物理化學(xué)特性的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2015,27(1):124-132.

[9]趙龍飛,周紅杰.酵母菌在普洱茶品質(zhì)形成中的作用初探[J].茶苑,2003(2):4-6.

[10]Nieto-Rojo R,Ancín-Azpilicueta C,Garrido J J.Sorption of 4-ethylguaiacol and 4-ethylphenol on yeast cell walls,using a synthetic wine[J].Food Chemistry,2014,152(2):399-406.

[11]劉寅,王淼.預(yù)處理方式對(duì)酵母細(xì)胞吸附茶多酚性能的影響[J].食品科學(xué),2011,32(6):38-44.

[12]Vernhet A,Bellon-Fontaine M N.Role of bentonites in the prevention of Saccharomyces cerevisiae adhesion to solid surfaces[J].Colloids & Surfaces B Biointerfaces,1995,3:255-262.

[13]Bellon-Fontaine M N,Rault J,Oss C J V.Microbial adhesion to solvents:a novel method to determine the electron-donor/electron-acceptor or Lewis acid-base properties of microbial cells[J].Colloids & Surfaces B Biointerfaces,1996,7(1):47-53.

[14]Strandberg G W,Shumate S E,Parrott J R.Microbial cells as biosorbents for heavy metals:accumulation of Uranium by Saccharomyces cerevisiae and Pseudomonas aeruginosa[J]. Appl.Environ.Microbiol.;(United States),1981,41:1(1):237-245.

[15]崔龍哲,周俊偉,吳桂萍.廢啤酒酵母吸附水中苯酚的性能及機(jī)理[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2010,29(1):14-17.

[16]Vasserot Y,Caillet S,Maujean A.Study of anthocyanin adsorption by yeast lees.Effect of some physicochemical parameters[J].American Journal of Energy and Viticulture,1997,48(4):433-437.

[17]Lubbers S,Charpentier C,Feuillat M,et al.Influence of yeast walls on the behavior of aroma compounds in a model wine[J]. American Journal of Enology and Viticulture,1994,45(1):29-33.

[18]Jakobek L.Interactions of polyphenols with carbohydrates,lipids and proteins[J].Food Chemistry,2015,175(5):556-567.

Study on the mechanism and conditions of adsorption of Yeast cells from fermented tea towards tea polyphenols

YAO Yong-fang,ZHAO Xin*,LIAO Yan-zhi

(Guangdong Industry Technical College,Guangzhou 510300,China)

The mechanism and conditions of adsorption of yeast cells from fermented tea towards tea polyphenols were studied.With the determination of adsorption rate and yeast colony counts as indicators,the difference adsorption mode of tea polyphenols about between live and dead yeast and the adsorption conditions of live yeast were investigated.The results were as follows:the tea yeast had different adsorption capacity for tea polyphenols.Yeast C had more advantage of hydrogen bonding groups on the surface of the structure.The Van Edward force was strong because of the more positive charge of the surface,which lead to more adsorption effect with phenolic groups in tea polyphenols.The adsorption rate of tea polyphenols was higher,reaching to 15.49%.The adsorption ability to tea polyphenols of live yeast was significantly stronger than dead yeast.The adsorption rate of tea polyphenols was closely related to the growth of yeast.The highest adsorption rate was obtained when cultured for 20 h.Yeast gained the highest adsorption rate of tea polyphenols in the optimized culture condition:the rotation speed was 200 r/min,the temperature was 33 ℃,pH was 4.0,and the 10 mL tea polyphenols solution(30 mg/mL)was added.This results may provide some scientific basis for the food and drug industry.

tea yeast;tea polyphenols;adsorption mechanism;adsorption conditions

2015-11-02

姚勇芳(1976-),男,教授,碩士研究生,研究方向：食品生物技術(shù),E-mail:809833140@qq.com。

趙鑫(1982-),男,博士研究生,講師,研究方向：食品生物技術(shù),E-mail:zhaoxin.gy@qq.com。

廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2012B091100402)；廣東省創(chuàng)新強(qiáng)校工程專項(xiàng)資金項(xiàng)目(1A20201)。

TS201

A

1002-0306(2016)09-0179-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.027