甄玉萍,裴世春,高建偉,王　巖,郝　廣

(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 161006)

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禾谷鐮刀菌發(fā)酵液中玉米赤霉烯酮毒素的提取及純化研究

甄玉萍,裴世春*,高建偉,王巖,郝廣

(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 161006)

本研究旨在通過(guò)不同萃取劑和層析柱的使用,從禾谷鐮刀菌發(fā)酵液中提取、純化玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)毒素,以期獲得較高純度的毒素。采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS)分析方法對(duì)其效果進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果表明:在單一的萃取劑中,苯的萃取效果最佳,其得率可達(dá)到73.20%;采用Daisogel反相層析柱進(jìn)行純化,得率可達(dá)到69.30%,且樣品中的雜峰數(shù)目明顯減少,由此證明該方法對(duì)毒素純化效果較好。本研究對(duì)發(fā)展高純度ZEN毒素的制備技術(shù)具有一定的指導(dǎo)意義和參考價(jià)值。

真菌毒素,玉米赤霉烯酮,禾谷鐮刀菌,提取,純化

玉米、水稻等糧食作物久置及儲(chǔ)存不當(dāng)易產(chǎn)生玉米赤霉烯酮毒素[1-2],該毒素是一種2,4-二羥基苯甲酸內(nèi)酯類(lèi)化合物,其分子式為C18H22O5,該毒素的產(chǎn)毒菌株主要是鐮刀菌屬(Fusarium)的菌株,如禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、三線鐮刀菌(Fusariumtricinctum)等,因該毒素具有生殖發(fā)育和免疫毒性,潛在威脅人類(lèi)健康而備受研究者們的關(guān)注[3-6]。然而,現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的機(jī)構(gòu)用于大量研制生產(chǎn)高純度的玉米赤霉烯酮毒素,現(xiàn)有的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品均來(lái)自國(guó)外進(jìn)口,價(jià)格相當(dāng)昂貴,如何獲取高純度的毒素以便進(jìn)一步研究成為亟待解決的問(wèn)題。禾谷鐮刀菌是最為常見(jiàn)的產(chǎn)玉米赤霉烯酮毒素的菌株,通過(guò)對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)可以大量產(chǎn)玉米赤霉烯酮毒素[7-10]。本研究在前期培養(yǎng)產(chǎn)玉米赤霉烯酮毒素的禾谷鐮刀菌菌液的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上[10],對(duì)菌液中的毒素進(jìn)行提取和純化,以期為制備高純度的玉米赤霉烯酮毒素并將其國(guó)產(chǎn)化奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚天津市富宇精細(xì)化工有限公司;正己烷、乙酸乙酯天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;苯、乙腈(色譜純)天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品美國(guó)sigma公司;110250 5B-05-3-3禾谷鐮刀菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(Fusariumboothii)荷蘭生物科技公司;柱層層析硅膠青島鼎康硅膠有限公司;Daisogel反相填料DAISO CO.,LTD.;Hopes C18-SPE北京華盛譜信儀器有限責(zé)任公司。

Acquity 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS)儀(光電二極管陣列檢測(cè)器、Masslynx4.1工作站)美國(guó)Waters公司;循環(huán)水真空泵予華儀器有限責(zé)任公司;RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠;KH5200E型超聲波清洗器昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;TZ-A臺(tái)式振蕩器上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;ZHJH-C1109B超凈工作臺(tái)上海智城分析儀器制造有限公司;BSZ-100自動(dòng)部分收集器上海青浦滬西儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)酵液的培養(yǎng)選用500 mL的搖瓶,按照每升超純水含C6H12O660 g、KNO31.5 g、NaNO36.0 g、MgSO40.5 g、K2HPO4·3H2O 1.0 g、KCl 0.5 g、Fe2(SO4)30.025 g、酵母浸出膏1.0 g、蛋白胨20 g的配方進(jìn)行培養(yǎng)基的配制,將標(biāo)準(zhǔn)菌株活化后,在超凈工作臺(tái)內(nèi)用直徑為2 cm的打孔器取活化菌種的外圈菌餅,接種到滅菌后的液體培養(yǎng)基內(nèi),放在振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),搖動(dòng)速度為92 r/min,每日進(jìn)行10 h光照、14 h黑暗的培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間為20 d,培養(yǎng)溫度為22.9 ℃[7-12]。

1.2.2ZEN毒素的提取對(duì)培養(yǎng)基滅菌后,采用UPLC法對(duì)發(fā)酵液中的毒素含量進(jìn)行測(cè)定,經(jīng)多次測(cè)定,結(jié)果取其平均值249.8 μg/L,因ZEN不溶于水,易溶于乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑,故先用正己烷和石油醚進(jìn)行脫脂和去除小分子雜質(zhì),然后選擇乙醚、氯仿、苯、乙酸乙酯、二氯甲烷五種有機(jī)溶劑分別作為萃取劑對(duì)菌液中的毒素進(jìn)行萃取,按照2∶1的體積配比(即每100 mL 菌液用200 mL萃取劑)進(jìn)行萃取,萃取后非有機(jī)溶劑層按照2∶1的體積配比再次進(jìn)行萃取。合并兩次萃取液,放入旋蒸瓶中進(jìn)行旋蒸。待旋蒸完畢后,用乙腈定容至5 mL進(jìn)行檢測(cè)[13-15],測(cè)得結(jié)果為ZEN的濃度,該濃度乘以體積5 mL即為萃取100 mL菌液所得毒素質(zhì)量,用該質(zhì)量與之前測(cè)定的100 mL菌液中ZEN的質(zhì)量做比,即為用萃取劑萃取ZEN的得率[16-19]。

1.2.3ZEN毒素的純化

1.2.3.1柱層層析硅膠柱的制備及毒素的純化稱(chēng)量一定質(zhì)量的硅膠放入燒杯內(nèi),在燒杯中加入適量的正己烷用玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆蜓b入柱內(nèi),讓硅膠依靠重力和洗脫劑的帶動(dòng),在柱內(nèi)自由沉降,待沉降完全后打開(kāi)下端活塞,此間要不斷把流出的正己烷加回柱內(nèi)且保持一定的液面,用洗耳球均勻敲打柱子周?chē)员ＷC柱內(nèi)硅膠壓實(shí)無(wú)氣泡并保持硅膠面的水平,最后在硅膠上面加少許脫脂棉,關(guān)閉下端活塞,待用。

打開(kāi)下端活塞,當(dāng)柱內(nèi)溶劑面降至上層脫脂棉與硅膠層界面時(shí),立即用移液管將旋蒸后洗脫下的液體滴加到層析柱內(nèi),用少量氯仿-甲醇淋洗5 mL容量瓶并用移液管滴加到柱內(nèi),當(dāng)頁(yè)面再次降至脫脂棉與硅膠層界面時(shí),緩慢加入氯仿-甲醇(9∶1)進(jìn)行洗脫,共加四次,每次50 mL,洗脫速度控制在0.5 mL/min左右,每50 mL接收至圓底燒瓶?jī)?nèi),用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行旋蒸,乙腈定容至5 mL,多次重復(fù)該實(shí)驗(yàn),測(cè)定結(jié)果取平均值[20-23]。

1.2.3.2Daisogel反相填料的活化及毒素的純化稱(chēng)量適量填料放入燒杯中,加入填料體積三倍的甲醇,用玻璃棒充分?jǐn)嚢?之后每?jī)蓚€(gè)小時(shí)攪拌一次,共攪拌四次后,放于避光處過(guò)夜。裝柱方法同上,將待純化液體緩慢加入層析柱內(nèi),依次分別加入50%、70%、90%、100%的甲醇50 mL。洗脫液用自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集,設(shè)定每20 min自動(dòng)換一次收集試管,按順序進(jìn)行標(biāo)記,對(duì)收集的洗脫液分別進(jìn)行檢測(cè),多次重復(fù)該實(shí)驗(yàn),測(cè)定結(jié)果取平均值[21-24]。

1.2.3.3Hopes C18-SPE小柱的活化及毒素的純化用5 mL甲醇,10 mL超純水對(duì)小柱進(jìn)行活化,然后放置10 min使之充分平衡。將待純化液體加入到柱內(nèi),用小型加壓泵進(jìn)行加壓,使流速保持在2 mL/min,收集洗脫液,多次重復(fù)該實(shí)驗(yàn),測(cè)定結(jié)果取平均值[19,25-26]。

1.2.4UPLC-MS法UPLC條件:色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液,流動(dòng)相B為乙腈;梯度洗脫條件為0～2 min,20% B;2～9 min,20%～95% B;9～9.1 min,95%～100% B;9.1～11 min,100% B;11～11.1 min,100%～20% B,11.1～13 min,20% B;流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;柱溫40 ℃;樣品室溫度4 ℃;柱后分離進(jìn)入質(zhì)譜儀。

質(zhì)譜條件:電離方式為電噴霧電離(electron spray ionization,ESI)源;檢測(cè)方式為負(fù)離子[M-H]-模式;錐孔電壓40 V;毛細(xì)管電壓3.0 kV;離子源溫度為100 ℃;脫溶劑氣流速600 L/h;反吹氣流量 10 L/h;質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1200。

2　結(jié)果與分析

2.1萃取劑的選擇

5種不同有機(jī)溶劑作為萃取劑對(duì)毒素的萃取效果如表1所示,從表中可看出,苯作為萃取劑對(duì)菌液中ZEN毒素的萃取效果最佳,顯著高于其他各種萃取劑的得率(p<0.05)。當(dāng)以苯作為萃取劑時(shí),100 mL菌液經(jīng)過(guò)提取濃縮后的體積為5 mL,其濃度為3640.05 μg/L,質(zhì)量為18.20 μg,其得率可達(dá)到73.20%。

表1　不同萃取劑對(duì)菌液中ZEN毒素的萃取效果及其得率Table 1　Different extraction solvent for the extraction effect of ZEN and its yield

注:原菌液中ZEN的濃度為249.8 μg/L;同列小寫(xiě)字母不同表示不同萃取劑對(duì)ZEN毒素萃取效果的差異顯著性(p<0.05)。

表2　不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇洗脫ZEN毒素的效果(μg)Table 2　Different volume fraction of methanol elution of ZEN(μg )

注:同行大寫(xiě)字母不同表示甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)ZEN毒素洗脫效果的差異顯著性(p<0.05);同列小寫(xiě)字母不同表示洗脫次數(shù)對(duì)ZEN毒素洗脫效果的差異顯著性(p<0.05)。

2.2柱層層析硅膠柱純化毒素效果的研究

按照1.2.3.1中方法所做實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示,隨著洗脫液的增加,ZEN的產(chǎn)量先增加,后保持不變,表明當(dāng)洗脫液達(dá)到200 mL時(shí),已達(dá)到洗脫的最大值,從圖中可看出柱層層析硅膠柱純化后毒素的含量為9.01 μg,與純化前毒素的質(zhì)量做比,其得率為49.52%。

圖1　柱層層析硅膠柱純化毒素的效果Fig.1　The effect of the mycotoxin purification for layer chromatography silica gel column

2.3Daisogel反相層析柱純化毒素效果的研究

將Daisogel反相填料活化后裝柱,用不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇對(duì)萃取后的溶液進(jìn)行洗脫,洗脫結(jié)果如表2所示。

將表2中用不同體積分?jǐn)?shù)下的甲醇所洗脫下的ZEN毒素的測(cè)定值全部相加,得到的數(shù)據(jù)為12.45 μg,由此可知,采用Daisogel反相層析柱純化的毒素質(zhì)量為12.45 μg,經(jīng)計(jì)算,其得率為68.39%。

分析表中數(shù)據(jù)可知,90%的甲醇其洗脫效果最好,占總得率的54.14%,故改用90%的甲醇200 mL重復(fù)進(jìn)行純化實(shí)驗(yàn),調(diào)整自動(dòng)部分收集器,每40 min轉(zhuǎn)動(dòng)一次,收集洗脫液按順序編號(hào)進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

圖2　90%甲醇洗脫ZEN毒素的效果Fig.2　The effect of 90% methanol elution of ZEN注:編號(hào)1為第一個(gè)40 min后收集的洗脫液所測(cè)得的 ZEN產(chǎn)量,編號(hào)2為第二個(gè)40 min后收集的洗脫液 所測(cè)得的ZEN產(chǎn)量,后續(xù)編號(hào)所代表的含義依此類(lèi)推。

經(jīng)過(guò)對(duì)圖2中所得結(jié)果進(jìn)行分析可知,用90%的甲醇洗脫ZEN毒素,其產(chǎn)量為12.61 μg,得率為69.30%,該結(jié)果與用不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇洗脫毒素的效果相比有所提高。且從圖2中可以看出,第9次收集的純化液中,毒素含量已經(jīng)極少,到第10次,已不能檢測(cè)到毒素,因此,選擇前8次的90%的甲醇作為洗脫劑,即將洗脫劑的體積減小至160 mL。

2.4Hopes C18-SPE純化毒素效果的研究

按照1.3.3.3中方法將收集得到的洗脫液進(jìn)行檢測(cè),可測(cè)知ZEN毒素的質(zhì)量為12.64 μg,得率為69.45%,雖然該得率與Filipe O M S[27]和Raquel M[28]等人采用C18-SPE小柱所得得率相比較低,但由于前者所純化物質(zhì)與本實(shí)驗(yàn)的毒素性質(zhì)差異極大,故該得率在可接受范圍之內(nèi)。

2.5三種純化效果的比較

以ZEN毒素的質(zhì)量和得率為衡量標(biāo)準(zhǔn),衡量以上三種純化方法可知,Hopes C18-SPE的純化效果最佳,但考慮到實(shí)際因素,由于Hopes C18-SPE的價(jià)格昂貴,且體積過(guò)小,無(wú)法用于大量毒素的純化,故采用Daisogel反相層析柱進(jìn)行ZEN毒素的純化效果較好。

2.6UPLC-MS檢測(cè)

采用UPLC-MS和Masslynx4.1工作站對(duì)苯萃取旋蒸液和Daisogel反相層析柱純化后的毒素進(jìn)行定性定量測(cè)定與分析,其結(jié)果如圖3、4所示。

圖3　苯萃取旋蒸液中ZEN的離子色譜Fig.3　Ion current chromatograms of ZEN in Benzene extraction and evaporated fluid

圖4　ZEN純化后的離子色譜圖及質(zhì)譜圖Fig.4　ZEN after purification of ion current chromatograms and mass spectra

從圖3、4中可看出,ZEN的流出時(shí)間為5.66 min,對(duì)應(yīng)的其定性分子[M-H]-為m/z 317.15,與ZEN毒素標(biāo)準(zhǔn)品[13-14]的數(shù)據(jù)一致,證明經(jīng)過(guò)提取和純化所得的真菌毒素是ZEN。比較圖3與圖4可知,純化后樣品中的雜峰數(shù)目明顯減少,由此證明Daisogel反相層析柱對(duì)毒素純化效果較好。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)產(chǎn)ZEN毒素的禾谷鐮刀菌發(fā)酵液的基礎(chǔ)上,首先采用不同的有機(jī)溶劑作為萃取劑對(duì)ZEN毒素進(jìn)行提取,運(yùn)用UPLC對(duì)不同的萃取液進(jìn)行比較分析得出苯作為萃取劑對(duì)毒素的提取效果最佳,其得率可達(dá)到73.20%;然后在純化柱的選擇方面進(jìn)行綜合考慮,最終選用Daisogel做為純化毒素層析柱的填料,自行填充后的Daisogel反相層析柱純化毒素的得率為69.30%;用UPLC-MS對(duì)純化前后的ZEN毒素做比較,可明顯看出,純化后的毒素雜峰少,證明層析柱確實(shí)起到了純化ZEN毒素的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為提取高純度的ZEN毒素的方法工藝化、擴(kuò)大化提供一些基礎(chǔ)性理論依據(jù)。在后續(xù)的研究中,將會(huì)選用多種萃取劑混合的方式對(duì)菌液進(jìn)行萃取,加大層析柱選擇范圍,改變多種填充料,研究柱高柱徑、填充高度、流速等對(duì)純化效果的影響[16,19],運(yùn)用質(zhì)譜等方法比較得率高低與純化效果之間的聯(lián)系,向?qū)崿F(xiàn)ZEN毒素生產(chǎn)國(guó)產(chǎn)化的目標(biāo)推進(jìn)。

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Extraction and purification of zearalenone inFusariumgraminearum

ZHEN Yu-ping,PEI Shi-chun*,GAO Jian-wei,WANG Yan,HAO Guang

(College of Food and Biological Engineering,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China)

To obtain highly purified zearalenone,the mycotoxin was extracted and then purified from the fermented liquid ofFusariumgraminearumin this study using different extraction solvents and chromatographic columns. The effects of extraction and purification were evaluated by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry(UPLC-MS).The results demonstrated that benzene was recognized to be the best one of the single extraction agents,ewhose yield could reach up to 73.20%.Daisogel reverse phase chromatography column was much better chosen to purify zearalenone because its yield was up to 69.30% and the numbers of the impurity peaks significantly decreased.The findings of this study can provide the guidance and reference for the development of highly purity of zearalenone.

mycotoxin;zearalenone;Fusariumgraminearum;extraction;purification

2015-09-21

甄玉萍(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全，E-mail：zypssf@163.com。

裴世春(1966-)，男，博士，教授，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全，E-mail：1079481030@qq.com。

齊齊哈爾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目(YJSCX2014-015X)；國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作專(zhuān)項(xiàng)(2013FY113400)；黑龍江省教育廳科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目(12541871)；齊齊哈爾大學(xué)啟動(dòng)基金(000240)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)09-0155-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.022