毛　媛,呂留莊,劉克武,劉克海，*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所,黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點實驗室,黑龍江牡丹江 157011)

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東紫蘇(ElsholtizabodinieriVaniot)總黃酮的提取及其抗氧化、免疫活性的研究

毛媛1,呂留莊1,劉克武2,劉克海1，*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所,黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點實驗室,黑龍江牡丹江 157011)

東紫蘇,總黃酮,抗氧化,免疫

東紫蘇別名鳳尾茶、野山茶、小山茶、小香薷、牙刷草等,是唇形科香薷屬的矮小半灌木狀植物,主產(chǎn)于我國云南、貴州、甘肅等地[1]。據(jù)報道,東紫蘇是香薷屬植物中現(xiàn)存的唯一食藥兩用的植物[2]。東紫蘇外形美觀,植株含揮發(fā)油,氣味清香,還含有黃酮類、甾體、萜類、酚類、鞣質(zhì)、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、多糖、苷類等活性成分,且含有多種有益的微量元素,具有較高的食用、藥用和觀賞價值[1]。

據(jù)研究表明,東紫蘇中黃酮含量豐富,高達10%以上,不同產(chǎn)地有所差異[3]。目前對東紫蘇的研究多集中在揮發(fā)油,但對其黃酮研究較少,除木犀草素和槲皮素的抑菌活性外,其他活性尚未見報道。黃酮化合物藥理作用主要包括降血脂、抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等。本文通過正交實驗提取了東紫蘇的總黃酮,并首次對其清除自由基活性、免疫活性進行研究,為東紫蘇的開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

東紫蘇購買于云南省文山,常溫避光儲藏;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品純度>96.6%,購買于Sigma;魯米諾純度≥97%,Sigma,購買于國藥集團化學(xué)試劑有限公司;乙醇、甲醇、正丁醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、EDTA、雙氧水、鄰苯三酚、印度墨水等:分析純,購買于國藥集團化學(xué)試劑公司。

ICR小鼠SPF級,18～20 g,上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,合格證號:2007000577656.動物于實驗前在動物房環(huán)境中適應(yīng)一周。

毛細管100 mm,1.8～2.2 mm,購買于國藥集團化學(xué)試劑有限公司粉碎機，F(xiàn)W100型,上海安銳自動化儀表有限公司;水浴鍋HH2型,上海比朗儀器制造有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52C型,上海青浦滬西儀器廠;分光光度計PharmaSpec UV-3600,日本shimadzu公司;酶標(biāo)儀SH-1000型,北京華拓鴻達科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1東紫蘇總黃酮含量的測定

1.2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制東紫蘇中總黃酮含量的測定方法采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH分光光度法[4]。準(zhǔn)確稱取10 mg干燥的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中,加無水乙醇定容,搖勻。分別吸取該溶液0,1,2,3,4,5 mL于25 mL容量瓶中,加入1 mL 5%的NaNO2溶液,搖勻,還原6 min后,加入1 mL 10%的Al(NO)3溶液,搖勻,絡(luò)合6 min后,加入10 mL 4%的NaOH溶液,搖勻,顯色15 min后,用水定容,繼續(xù)靜置15 min,在500 nm處測定各溶液的吸光度,并以吸光度值(A)作為縱坐標(biāo),溶液濃度(C)作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出線性方程。

1.2.1.2樣品測定取0.1 mL提取液,按上述方法,測定各提取液在500 nm處的吸光度。根據(jù)所得線性方程及稀釋倍數(shù)計算東紫蘇中總黃酮的含量,計算公式為:

式中:w-東紫蘇中總黃酮的含量;c-根據(jù)樣品吸光度及標(biāo)品線性方程得出的濃度;a-提取液的稀釋倍數(shù);V-萃取溶劑的體積;m-東紫蘇的質(zhì)量。

1.2.2東紫蘇總黃酮的提取

1.2.2.1提取流程東紫蘇洗凈→烘干、剪碎→粉碎→稱量→乙醇回流→上清液→蒸干→水復(fù)溶→正丁醇萃取→正丁醇相→蒸干→乙醇溶解→4 ℃保存[4]

1.2.2.2提取工藝優(yōu)化采用1.2.2.1的提取工藝流程,根據(jù)前期單因素實驗結(jié)果選擇提取溫度、回流時間和料液比3個因素,采用L9(34)正交表按照表1進行實驗。

1.2.3東紫蘇總黃酮抗氧化活性的研究

表1　因素水平表Table 1　Factor and level

1.2.3.2清除雙氧水能力(H2O2)的測定東紫蘇總黃酮清除雙氧水的能力通過魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系測定[6]。配制0.1 mmol/L 的魯米諾碳酸鹽緩沖液(Na2CO3-NaHCO30.05 mol/L,pH=9.4)和0.15 mol/L的H2O2,將樣品溶液用60%乙醇稀釋成50、100、150、200 μg/mL、1 mg/mL。測量時,樣品組依次加入樣品10 μL、雙氧水10 μL、魯米諾-磷酸鹽緩沖溶液150 μL;對照組依次加入蒸餾水10 μL、雙氧水10 μL、魯米諾-磷酸鹽緩沖溶液150 μL。在20 ℃下,每隔0.6 s記錄一次發(fā)光強度,連續(xù)記錄30 s。

自由基清除率計算公式為:

式中:R-自由基清除率,%;Lc-對照組的發(fā)光強度;Ls-樣品組的發(fā)光強度。

1.2.4東紫蘇總黃酮免疫活性的研究免疫活性通過碳粒廓清實驗測定[7-8]。將24 只小鼠隨機分為4組,每組6只。分別為模型對照組、黃酮低劑量組(100 mg/kg)、黃酮中劑量組(150 mg/kg)、黃酮高劑量組(200 mg/kg)。每天稱重、灌胃提取液1次,模型對照組給以生理鹽水(0.2 mL/10 g)。于第14 d給藥1 h后,對每只小鼠尾靜脈注射用生理鹽水稀釋5倍的印度墨汁(0.1 mL/10 g),待墨汁注入,立即計時。2 min(T1)和10 min(T2)后,分別從每只小鼠眼眶取血100 μL,加到4 mL 0.1%的NaHCO3溶液中,在660 nm處測其吸光度值,計算碳粒廓清指數(shù)K。然后將小鼠處死,取肝臟、脾臟,用濾紙吸干表面的血液,稱其重量,計算吞噬指數(shù)α。計算公式如下:

式中:K-碳粒廓清指數(shù);OD1、OD2-2 min和10 min時采血的吸光值;T2、T1-兩次采血的時間差,min。

式中:α-吞噬指數(shù);BW-小鼠的體重,g;LW-小鼠的肝臟重量,g;SW-小鼠的脾臟重量,g。

2　結(jié)果與分析

2.1總黃酮含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

以干燥的蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH分光光度法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1?；貧w方程為Y=15.400X+0.0128,r=0.9989。標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示,在0.008～0.04 mg/mL的濃度范圍內(nèi),蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的500 nm處的吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of rutin

2.2總黃酮提取工藝的優(yōu)化

提取溫度、回流時間和料液比3個因素正交實驗結(jié)果見表2。由表2可知,對東紫蘇總黃酮提取效果的影響因素大小依次為料液比>回流時間>提取溫度。由表3可知,B、C具有顯著性差異,為影響黃酮提取工藝的主要因素,而A則不具有顯著性意義,為次要因素。

表2　正交實驗結(jié)果Table 2　Result of orthogonal experiment

對主要因素B、C水平選擇,從綜合評分B3>B2>B1、C2>C1>C3,宜分別選B3、C2;因素A影響較小,為節(jié)約能源,應(yīng)選A1。故確定優(yōu)化條件為A1B3C2,即提取溫度為60 ℃,回流提取為3 h,料液比為1∶20(g/mL)。

表3　方差分析Table 3　Analysis of variance

注:F0.05(2,4)=6.94，F(xiàn)0.01(2,4)=18.00。

2.3東紫蘇總黃酮抗氧化活性

清除率的影響(n=4，x±s)

組別濃度(μg/mL)超氧陰離子清除率(%)對照組50074.51±1.62樣品1組5026.36±4.46**樣品2組10053.63±5.79**樣品3組15067.25±1.11**樣品4組20073.94±1.83**

注:與對照組對照,**p<0.01,差異極顯著;表5同。

2.3.2雙氧水(H2O2)清除能力在堿性條件下,H2O2會氧化冷發(fā)光劑魯米諾,產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。通過測定發(fā)光信號的變化來檢驗樣品對H2O2的清除能力[5]。同2.3.1,由發(fā)光強度與樣品濃度的關(guān)系可知東紫蘇總黃酮對H2O2的清除率,由表5可知,東紫蘇總黃酮的濃度越高,對H2O2的清除率越大,并且在50～200 μg/mL的濃度范圍內(nèi),清除率為48.56%～77.39%,半抑制濃度IC50為 50.59 μg/mL,表明東紫蘇總黃酮對H2O2具有較高的清除作用。

表5　東紫蘇總黃酮對雙氧水(H2O2) 清除率的影響(n=4,x±s)Table 5　Effect of flavonoids from EBV on H2O2(n=4,x±s)

2.4東紫蘇總黃酮免疫活性

碳粒廓清實驗是通過測定血液中碳粒的消失速度來反映單核巨噬細胞系統(tǒng)吞食異物的能力,碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α越大,表明其體內(nèi)免疫作用越強[8]。由表6可知,相對于對照組,實驗組的K值和α值都有提高,并且高劑量組呈現(xiàn)了極顯著性差異(p<0.01),說明東紫蘇黃酮可以明顯增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能,具有促進小鼠免疫功能的作用。有研究表明:減少過氧化脂質(zhì)LPO損傷,可提高機體的免疫作用[9]。因此,推測東紫蘇總黃酮的免疫功能與其具有良好的抗氧化活性和清除自由基能力,從而降低LPO損傷免疫細胞的風(fēng)險有關(guān)[10]。但其確切的作用機理還需進一步研究。

表6　東紫蘇總黃酮對小鼠巨噬細胞 吞噬功能的影響Table 6　Effect of flavonoids from EBV on carbon clearance test of ±s)

注:與模型組對照,*p<0.05,**p<0.01。

3　結(jié)論

本實驗通過正交實驗篩選了回流提取東紫蘇總

黃酮的最佳工藝條件:料液比1∶20(g/mL)、溫度60 ℃、時間3 h,且料液比對提取效果的影響最大,其次為時間,溫度對其影響較小。此外,東紫蘇總黃酮的含量豐富,并且對超氧陰離子自由基和雙氧水的清除效果明顯,IC50分別為108.07 μg/mL和50.59 μg/mL,表明東紫蘇總黃酮具有良好的抗氧化作用,是一種天然抗氧化劑。通過小鼠體內(nèi)碳粒廓清實驗,表明東紫蘇總黃酮可增強小鼠體液免疫,對小鼠體質(zhì)有一定的改善作用。本實驗對東紫蘇的進一步研究和開發(fā)提供了理論依據(jù),今后有必要對東紫蘇黃酮的具體成分,以及與活性相關(guān)的成分進行深入研究。

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Extraction and its antioxidant,immune activities of total flavonoids fromElsholtziabodinieriVaniot

MAO Yuan1,LV Liu-zhuang1,LIU Ke-wu2,LIU Ke-hai1，*

(1.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2.Heilongjiang Forest By-Product and Speciality Research Institute,Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Non-wood Forest Product Development,Mudanjiang 157011,China)

ElsholtizabodinieriVaniot;flavonoids;antioxidant activity;immune activity

2015-11-05

毛媛(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)與工程,E-mail:13262975153@163.com。

劉克海(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：中藥新制劑,E-mail：khliu@shou.edu.cn。

上海市教育委員會重點學(xué)科建設(shè)項目(J50704)；黑龍江省森林工業(yè)總局攻關(guān)項目(sgzjY201402)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)09-0085-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.008