申芮萌,楊　嵐,于　寧,朱　月,朱　寧,張海平,張　鑫,孫愛東

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,北京 100083;2.北京林業(yè)大學(xué)林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

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申芮萌,楊嵐,于寧,朱月,朱寧,張海平,張鑫,孫愛東*

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,北京 100083;2.北京林業(yè)大學(xué)林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

本論文初步探討了采用Sephadex LH-20凝膠柱層析分離純化藍(lán)莓花色苷的工藝條件,比較了花色苷在不同緩沖液濃度、不同流速和不同上樣量條件下的分離效果,并將最佳分離條件下得到的組分進(jìn)行紫外可見波長掃描,對其中的花色苷組分進(jìn)行HPLC檢測。結(jié)果表明,當(dāng)以30%的酸化甲醇為洗脫液,采用混合流速進(jìn)行洗脫,進(jìn)樣量為20 mg時(shí),藍(lán)莓花色苷的分離效果最好,共收集到七個(gè)峰組分。經(jīng)紫外-可見光譜掃描,可確定組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ為非花色苷類物質(zhì);組分Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ為花色苷類物質(zhì)。由HPLC檢測可知:組分Ⅳ中只含一種藍(lán)莓花色苷;組分Ⅵ、Ⅶ均以一種花色苷為主,且其峰面積比例達(dá)到85%以上;組分Ⅴ中主要含兩種花色苷。

藍(lán)莓花色苷,Sephadex LH-20,HPLC

藍(lán)莓(Blueberry)又稱越橘、藍(lán)漿果,為多年生落葉或常綠灌木,果實(shí)為漿果,近圓形,呈藍(lán)色,酸甜適度,果肉細(xì)膩[1-2]。藍(lán)莓營養(yǎng)成分豐富,除含常規(guī)的有機(jī)酸、糖、維生素和礦物質(zhì)外,還富含大量的花色苷類物質(zhì)[3-4]。近幾年的國內(nèi)外研究表明,花色苷具有多種生理功能,比如:清除自由基[5]、延緩衰老[6]、抗菌消炎[7]、預(yù)防癌癥[8-9]、降低膽固醇[10]、防止動(dòng)脈粥樣硬化[10-11]、增強(qiáng)人體免疫力[12]、改善和強(qiáng)化視力[12-14]等。而藍(lán)莓花色苷作為一種天然色素,具有資源豐富、安全無毒的特點(diǎn),在食品、藥品和化妝品領(lǐng)域都有著廣闊的應(yīng)用前景和消費(fèi)市場。因此,如何制備高純度的藍(lán)莓花色苷一直是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

目前藍(lán)莓花色苷分離純化的方法主要有大孔樹脂法、高效液相色譜法、超濾法、高速逆流色譜法等[15],其中大孔樹脂法以成本低且操作簡單、易行等特點(diǎn)成為當(dāng)前分離純化花色苷的主要方法。鄭紅巖[16]等以藍(lán)莓果提取液為原料,研究了12種大孔樹脂對花色苷的靜態(tài)吸附與解析效果,并優(yōu)化了大孔樹脂分離純化藍(lán)莓花色苷的工藝技術(shù)參數(shù)。李穎暢[17]等研究了AB-8型大孔樹脂對藍(lán)莓花色苷的吸附與解吸條件。但是經(jīng)大孔樹脂純化精制得到的花色苷純度并不高[18-19],還遠(yuǎn)達(dá)不到人們的要求。本文旨在大孔樹脂純化的基礎(chǔ)上,利用葡聚糖凝膠技術(shù)進(jìn)一步探討藍(lán)莓花色苷分離純化工藝,以期為提高花色苷純度,擴(kuò)大應(yīng)用范圍提供技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實(shí)驗(yàn)用藍(lán)莓鮮果(愛國者)產(chǎn)于大興安嶺林區(qū),使用前在零下80 ℃冷凍保存;Amberlite XAD-7大孔樹脂購自Sigma公司,使用前經(jīng)過活化預(yù)處理;Sephadex LH-20填料購自GE公司;無水甲醇、甲酸、乙酸乙酯均為分析純,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;色譜級甲醇購自賽默飛世爾科技有限公司;色譜級甲酸購自阿拉丁有限公司。

LQ-A 30002電子天平瑞安市樂祺貿(mào)易有限公司;pH計(jì)上海精密科學(xué)有限公司;超聲波中藥處理機(jī)濟(jì)寧奧波超生電氣有限公司;循環(huán)水真空泵、L3660D低速離心機(jī)上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠;HL-2S恒流泵、BSZ-100自動(dòng)部分收集器上海青浦滬西儀器廠;FD-18冷凍干燥機(jī)北京天佑科技發(fā)展有限公司;UV-2500PC Series、LC-20AD高分離度快速液相色譜系統(tǒng)配有在線脫氣機(jī)、高壓二元泵、柱溫箱及二極管陣列紫外檢測檢測器(PDA)SHIMADZU公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1藍(lán)莓花色苷的制備稱取100 g藍(lán)莓鮮果,破碎打漿后加入700 mL 60%甲醇溶液(用甲酸調(diào)pH至2.2左右),超聲輔助提取30 min(功率400 W,溫度30 ℃)。提取液于4000 r/min離心20 min,剩余果渣用200 mL提取劑再次超聲提取,合并兩次上清液,用60%甲醇溶液定容至1000 mL。減壓濃縮后用乙酸乙酯以1∶1(v∶v)在室溫避光條件下萃取三次。水層部分通過XAD-7大孔樹脂柱吸附后,先用5倍柱體積的酸化去離子水淋洗,以除去有機(jī)酸、蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)。再用60%酸化甲醇進(jìn)行洗脫,收集洗脫液,減壓濃縮后經(jīng)冷凍干燥制得紫黑色藍(lán)莓花色苷純化粉末。低溫貯存,備用。

1.2.2葡聚糖凝膠柱的處理

1.2.2.1凝膠預(yù)處理稱取25 g Sephadex LH-20填料,室溫下置于無水甲醇中溶脹過夜,脫氣后裝柱。

1.2.2.2裝柱與平衡先向Φ16 mm×50 cm的層析柱中加入4～5 cm高度的無水甲醇,然后盡量一次性將攪拌均勻的葡聚糖凝膠通過玻璃棒引流的方式全部緩慢倒入層析柱中,并以自下而上的方式不斷敲擊層析柱外壁,以排出氣泡,在此過程中保持下方出水口水流通暢,但應(yīng)控制水流速度使之低于凝膠自然沉降速度,以免柱體流干。最終得到柱高46 cm,柱體積約92 mL 的凝膠柱。先用無水甲醇平衡2～3個(gè)柱體積。在每次上樣前,再用2～3個(gè)柱體積的緩沖液平衡凝膠柱,使基線穩(wěn)定[20-21]。

1.2.3凝膠層析分離條件的優(yōu)化

1.2.3.1繪制曲線取一定量藍(lán)莓花色苷純化粉末溶解于緩沖液(即為不同濃度的酸化甲醇溶液,實(shí)驗(yàn)中溶解液與洗脫液必須一致并統(tǒng)稱之為緩沖液),當(dāng)樣品滲入膠床后用相應(yīng)的緩沖液進(jìn)行洗脫,每3 mL收集1管,并測定其在530 nm下的吸光度值,以管數(shù)為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制曲線。

1.2.3.2不同工藝條件下Sephadex LH-20凝膠柱的分離效果的比較緩沖液濃度的篩選:在Sephadex LH-20凝膠上,以30%酸化甲醇為洗脫液,濃度分別設(shè)定為20%、30%、40%(pH均調(diào)至2.2左右),流速為0.5 mL/min,上樣量為10 mg。

流速的篩選:在Sephadex LH-20凝膠上,將pH2.2的30%酸化甲醇作為洗脫液,流速分別設(shè)定為0.5、1.0、2 mL/min,上樣量為10 mg 。

上樣量的篩選:在Sephadex LH-20凝膠上,將30%酸化甲醇作為洗脫液,采用混合流速進(jìn)行洗脫,上樣量分別為10、20、30 mg。

1.2.4紫外-可見光譜掃描在凝膠層析的最佳條件下,收集Sephadex LH-20分離的目標(biāo)物峰尖部分并合并,對各部分進(jìn)行稀釋或濃縮后進(jìn)行紫外-可見波長全掃描,進(jìn)行初步的分析鑒定。

1.2.5HPLC對藍(lán)莓花色苷組分的檢測與分析對紫外-可見光譜掃描鑒定的藍(lán)莓花色苷組分用高效液相色譜進(jìn)行分析。色譜條件:Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相A:色譜級甲醇,流動(dòng)相B:3%甲酸水溶液;采用二元梯度洗脫,洗脫程序如下:0～20 min,15%～20%A;20～30 min,20%～22%A;30～45 min,22%～45%A;45～55 min,45%A。檢測波長:530 nm;柱溫35 ℃;流速0.5 mL/min;進(jìn)樣體積:20 μL。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2016;LabSolutions Version 5.54 SP5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1凝膠層析分離條件的優(yōu)化

2.1.1緩沖液濃度的篩選20%、30%、40%甲醇對藍(lán)莓花色苷的洗脫效果如圖1～圖3所示,可以看出上樣量為10 mg,洗脫速度為0.5 mL/min 時(shí),隨著甲醇濃度的增大,洗脫能力的增強(qiáng),藍(lán)莓花色苷的洗脫速度也逐漸加快,但分離效果變差。用20%、30%甲醇進(jìn)行洗脫時(shí),均可觀察到5個(gè)峰組分,而用40%甲醇進(jìn)行洗脫時(shí),僅可觀察到4個(gè)峰組分,且峰扭曲變形、較為尖銳變差。分析原因可能是雖不同藍(lán)莓花色苷極性存在差異,但在40%甲醇溶液中,均有較高的溶解度,因此極性相近的花色苷易同時(shí)被洗脫出來。從峰型上來說,20%和30%甲醇的洗脫效果相差并不大,但隨著洗脫液濃度的降低,藍(lán)莓花色苷的出峰時(shí)間將延長,用30%甲醇進(jìn)行洗脫,到115管時(shí)5個(gè)樣品組分已全部被洗脫出來,而用20%甲醇洗脫時(shí),到140管仍沒有洗脫完全,并且有拖尾現(xiàn)象。因此低濃度的洗脫液會(huì)降低洗脫效率,使溶劑消耗增多,洗脫時(shí)間延長。綜上,本實(shí)驗(yàn)選擇30%甲醇作為緩沖液。

圖1　20%甲醇濃度對洗脫效果的影響Fig.1　Influence of 20% methanol on the elution effect

圖2　30%甲醇濃度對洗脫效果的影響Fig.2　Influence of 30% methanol on the elution effect

圖3　40%甲醇濃度對洗脫效果的影響Fig.3　Influence of 40% methanol on the elution effect

2.1.2流速的篩選洗脫流速1.0 mL/min時(shí)藍(lán)莓花色苷的洗脫效果如圖4所示,洗脫流速0.5 mL/min時(shí)藍(lán)莓花色苷的洗脫效果如圖2所示。結(jié)合圖2和圖4可以看出,以30%甲醇為洗脫劑,上樣量為10 mg時(shí),在0.5 mL/min的流速下洗脫效果最好,當(dāng)流速為1.0 mL/min時(shí),雖然洗脫時(shí)間縮短,但洗脫峰的分離度明顯降低,分析原因可能為洗脫速度加快使分辨率降低,從而導(dǎo)致分離效果變差,由此可推斷洗脫流速為2 mL/min時(shí),由于速度的加快,藍(lán)莓花色苷更難以被分離,所以在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中省略了這步操作。但如果流速過慢,則會(huì)導(dǎo)致樣品在凝膠中的停留時(shí)間延長,擴(kuò)散加劇,條帶變寬,反而會(huì)使分辨率降低。所以洗脫流速應(yīng)不低于0.5 mL/min。

實(shí)驗(yàn)中,通過觀察葡聚糖凝膠柱顏色變化可發(fā)現(xiàn):在洗脫后不久,樣品會(huì)分成兩條色帶Ⅰ、Ⅱ,下方暗紫紅色條帶Ⅰ下降速度很快,且與上方條帶Ⅱ保持一定距離,將首先被洗脫收集;隨著洗脫時(shí)間的增加,上方色帶Ⅱ則會(huì)逐漸分成四個(gè)色帶。結(jié)合0.5、1.0 mL/min流速下洗脫圖譜的特點(diǎn),我們對洗脫流速進(jìn)行了優(yōu)化,即采用混合流速對藍(lán)莓花色苷進(jìn)行洗脫:1～30管,流速為1.0 mL/min;31～70管,流速為0.5 mL/min;71～100管,流速為2.0 mL/min。洗脫效果如圖5所示,從峰型來看,采用混合流速洗脫能夠?qū)⑦@五種組分較好的分離,且與0.5 mL/min洗脫流速下的分離效果相差不大。但從時(shí)間上來看,當(dāng)流速為0.5 mL/min時(shí),藍(lán)莓花色苷組分洗脫完全需耗時(shí)690 min;而采用混合流速時(shí),洗脫完全僅需要375 min,洗脫效率大大提高。綜上,混合流速下的洗脫效果優(yōu)于單一流速條件下的洗脫效果,因此,最終選擇混合流速進(jìn)行洗脫。

圖4　1 mL/min的洗脫流速對洗脫效果的影響Fig.4　Influence of flow rate of 1 mL/min on eluting effect

圖5　混合洗脫流速對洗脫效果的影響Fig.5　Influence of mixed flow rate on eluting effect

2.1.3上樣量的篩選首先探究不同上樣濃度對分離效果的影響。稱取兩份10 mg藍(lán)莓花色苷粉末分別溶于1、2 mL 30%甲醇溶液中,在Sephadex LH-20凝膠上,以30%酸化甲醇為洗脫液,采用混合流速進(jìn)行洗脫。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)進(jìn)樣濃度分別為10、5 mg/mL時(shí)的洗脫圖譜一致,因此凝膠色譜分離與上樣濃度無關(guān)。

為研究不同上樣量對葡聚糖凝膠分離效果的影響,同時(shí)為進(jìn)一步驗(yàn)證采用混合流速進(jìn)行洗脫效果的重現(xiàn)性與可行性,實(shí)驗(yàn)在其它條件不變的基礎(chǔ)上,繼續(xù)對上樣量為20、30 mg的藍(lán)莓花色苷純化粉末進(jìn)行了凝膠分離實(shí)驗(yàn)，分離效果如圖6、圖7所示。從圖6可以看出當(dāng)上樣量為20 mg時(shí),采用混合流速進(jìn)行洗脫,藍(lán)莓花色苷也具有較好的分離效果。通過對比上樣量10(圖5)、20 mg的洗脫曲線,發(fā)現(xiàn)對于已經(jīng)在10 mg的洗脫圖譜中出現(xiàn)的5個(gè)峰組分,隨著上樣量的增加,對應(yīng)的同一洗脫組分的吸光度值也隨之增大。但在20 mg的圖譜上20～40管之間的位置,又出現(xiàn)了兩個(gè)峰組分,在10 mg的圖譜中并不明顯,可能是由于濃度太低而被忽略。當(dāng)上樣量為30 mg時(shí),藍(lán)莓花色苷的分離效果變差。

綜上,當(dāng)進(jìn)樣量為20 mg,洗脫液濃度為30%酸化甲醇且采用混合流速進(jìn)行洗脫時(shí),藍(lán)莓花色苷的分離效果最好,收集此條件下經(jīng)凝膠分離得到的7個(gè)峰組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ,進(jìn)行進(jìn)一步的分析與鑒定。

圖6　上樣量20 mg時(shí)對洗脫效果的影響Fig.6　Influence of 20 mg sample amount on eluting effect

圖7　上樣量30 mg對洗脫效果的影響Fig.7　Influence of 30 mg sample amount on eluting effect

2.2紫外-可見光譜分析

花色苷的最大吸收波長一個(gè)在可見光區(qū)的500～540 nm附近,另一個(gè)在紫外區(qū)275 nm附近,通過測定色素的最大吸收波長即可判斷是否為花色苷類色素。由各組分的光譜圖可知,組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在500～540 nm內(nèi)沒有特征吸收峰,因此可以確定其為非花色苷類物質(zhì)。而組分Ⅳ在527 nm處有最大吸收峰,組分Ⅴ在522 nm處有最大吸收峰,組分Ⅵ在518 nm處有最大吸收峰,組分Ⅶ在525 nm處有最大吸收峰,且各組分均在275 nm附近有吸收,均符合花色苷類物質(zhì)的特征,確定其為藍(lán)莓花色苷類物質(zhì),并對Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ做進(jìn)一步的分析研究。

2.3HPLC對藍(lán)莓花色苷組分的檢測與分析

藍(lán)莓花色苷的甲醇粗提液經(jīng)HPLC的檢測結(jié)果如圖9所示。

SephadexLH-20柱層析分離得到的四種藍(lán)莓花色苷組分Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ經(jīng)HPLC的檢測結(jié)果如圖10所示。圖A為組分Ⅳ的檢測結(jié)果,在530 nm的波長下僅出現(xiàn)了一個(gè)色譜峰,說明其只含一種花色苷且純度較高。出峰時(shí)間為48.758 min,與甲醇提取液的HPLC圖譜(圖9)進(jìn)行比較，由表1可知,48.7 min左右為8號峰的位置,因此可以初步鑒定組分Ⅳ主要為8號峰。圖B為組分Ⅴ的檢測結(jié)果,可以看出組分Ⅴ含四種藍(lán)莓花色苷,由峰面積的比例可知,含量最豐富的為42.693 min峰(69.71%),其次為34.887 min峰(23.05%)。與圖9進(jìn)行比較，由表1可知,分別對應(yīng)的為4號峰和2號峰。圖C為組分Ⅵ的檢測結(jié)果,可知組分Ⅵ中保留時(shí)間為27.335 min的峰含量最豐富,占總峰面積的94.31%,與圖9進(jìn)行比較,由表1對應(yīng)的為1號峰。說明組分Ⅵ中主要是1號峰藍(lán)莓花色苷。組分Ⅶ的檢測結(jié)果如圖D所示,組分Ⅶ中含有的藍(lán)莓花色苷種類較豐富,但以兩種為主,其中含量最豐富的為36.812 min峰(86.43%),其次為27.442 min峰(7.51%)。與圖9進(jìn)行比較,由表1可知分別對應(yīng)的為3號峰和1號峰。

綜上,組分Ⅳ的分離效果最佳,純度最高。組分Ⅵ和Ⅶ雖然含花色苷種類較多,但都以一種花色苷單體物質(zhì)為主,其占峰面積比例達(dá)到85%以上。組分Ⅴ主要包括兩種花色苷單體。說明藍(lán)莓花色苷經(jīng)過大孔樹脂純化富集,Sephadex LH-20層析后得到了很好的分離,能夠得到純度較高的花色苷單體物質(zhì)。

表1　藍(lán)莓花色苷粗提液與組分Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ的 峰面積比較結(jié)果Table 1　Comparison of peak area ratio between crude anthocyanins extracts and 35% ethonal eulate

圖8　LH-20 制備出的七種組分的紫外-可見光譜掃描圖Fig.8　The UV-Vis spectrum scan profile of seven segments obtained from Sephadex LH-20 column注:A-組分Ⅰ;B-組分Ⅱ;C-組分Ⅲ;D-組分Ⅳ;E-組分Ⅴ;F-組分Ⅵ;G-組分Ⅶ。

圖9　藍(lán)莓花色苷的甲醇粗提液的HPLC圖譜Fig.9　HPLC profile of anthocyanin crude extracts

圖10　利用LH-20制備出的 四種藍(lán)莓花色苷組分的HPLC圖譜Fig.10　HPLC profile of four anthocyanin segments obtained from Sephadex LH-20 column注:A-組分Ⅳ;B-組分Ⅴ;C-組分Ⅵ;D-組分Ⅶ。

3　結(jié)論

大孔樹脂純化后的藍(lán)莓花色苷凍干粉末,在Sephadex LH-20凝膠層析柱分離的最佳工藝條件為:上樣量20 mg,30%甲醇為洗脫液,采用混合流速進(jìn)行洗脫且上樣濃度不影響分離效果。在此條件下得到的7個(gè)花色苷組分,通過紫外-可見全波長掃描初步判定,首先洗脫出的為非花色苷組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,隨后洗脫出的Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ為花色苷類物質(zhì)。經(jīng)HPLC檢測,組分Ⅳ的分離效果最佳,僅含一種花色苷單體,組分Ⅵ和Ⅶ中主要花色苷的峰面積比例達(dá)到85%,而組分Ⅴ則主要包含兩種花色苷單體。說明利用Sephadex LH-20特有的分子篩和吸附層析作用,可以將藍(lán)莓花色苷單體進(jìn)行有效的分離純化,為后期大規(guī)模地制備花色苷產(chǎn)品提供技術(shù)參數(shù),為藍(lán)莓高附加值產(chǎn)品在食品、藥品領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Study on isolation and purification optimization of blueberry anthocyanins by Sephadex LH-20

SHEN Rui-meng,YANG Lan,YU Ning,ZHU Yue,ZHU Ning,ZHANG Hai-ping,ZHANG Xin,SUN Ai-dong*

(1.Department of Food Science,College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China;2.Beijing Foresty University,Key Laboratory of Forestry Food Processing and Security,Beijing 100083,China)

The extraction and purification of blueberry anthocyanins by Sephadex LH-20 were preliminarily disscussed. The respective separating effects of different buffer concentration,flow velocity and sample loading volume were compared and the optimization of the purification condition were selected. The sample components which separated by the optimal condition were scanned on UV-Visible wavelength and identified by HPLC analysis. The results showed that optimal extraction of blueberry anthocyanins conditions were as following:eluant was 30% ethanol,eluting method was mixture velocity elution,sample loading volume was 20 mg,and seven segments can be collected. Based on the scanning of UV-Visible wavelength,segment Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ were not anthocyains and segment Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ,Ⅶ were anthocyains. HPLC analysis results showed that segment Ⅳcontained one anthocyanin,segment Ⅵ,Ⅶ mainly contained one anthocyanin respectively and the peak area ratio reached over 85%,segment Ⅴ mainly contained two anthocyanins.

blueberry anthocyanins;Sephadex LH-20;HPLC

2015-09-21

申芮萌(1992-),女,碩士研究生,研究方向:天然產(chǎn)物生理活性的開發(fā)與利用,E-mail:997429368@qq.com。

孫愛東(1968-),女,博士,教授,研究方向:天然產(chǎn)物生理活性的開發(fā)與利用,E-mail:602310136@qq.com。

國家自然基金資助項(xiàng)目(31271981);國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31471593)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)09-0058-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.003