韓飛飛,李　楊,王中江,隋曉楠,齊寶坤,王　瑞,畢　爽,李秋慧,江連洲,2,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030;2.國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心,黑龍江哈爾濱 150030)

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綠豆分離蛋白的葡聚糖糖基化改性研究

韓飛飛1,李楊1,王中江1,隋曉楠1,齊寶坤1,王瑞1,畢爽1,李秋慧1,江連洲1,2,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030;2.國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心,黑龍江哈爾濱 150030)

為改善綠豆分離蛋白(MBPI)的理化特性,利用葡聚糖(Dextran)接枝改性MBPI,并對(duì)改性后蛋白的溶解性、乳化特性、表面疏水性、亞基結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行研究。SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果表明,MBPI和Dextran接枝反應(yīng)后生成了分子量較大的共價(jià)復(fù)合物,表面疏水性分析表明,相比于未處理蛋白,MBPI-Dextran共價(jià)復(fù)合物的表面疏水性含量降低,溶解性和乳化特性的研究表明,改性后的蛋白質(zhì)溶解性和乳化特性得到不同程度的改善。

綠豆分離蛋白,糖基化,蛋白質(zhì)改性

綠豆(Vignaradiate(L.))又名青小豆,錄豆、植豆,屬于豆科,蝶花亞科豇豆屬一年生直立草本植物,原產(chǎn)印度、緬甸地區(qū),在我國(guó)已有2000多年的種植歷史[1]。綠豆是蛋白質(zhì)的良好來(lái)源,蛋白含量為20%～30%,并且?guī)缀醪缓忻洑庖蜃覽2]。綠豆蛋白的氨基酸組成與大豆和菜豆相當(dāng),并且復(fù)合FAO/WHO的標(biāo)準(zhǔn)[3]。然而,綠豆的加工應(yīng)用主要集中在淀粉的利用方面,綠豆蛋白則多作為生產(chǎn)廢料或動(dòng)物飼料使用,造成了蛋白資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。采用適當(dāng)?shù)母男苑椒ㄌ岣呔G豆蛋白的某些功能性質(zhì)以滿足食品加工工業(yè)的需求是綠豆高值化利用的基礎(chǔ)。

美拉德反應(yīng)能夠在加熱過(guò)程中進(jìn)行而不需要添加額外的化學(xué)試劑,被廣泛認(rèn)為是有效和安全的提高蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的方法,包括提高蛋白質(zhì)的溶解性[4]、乳化性、熱穩(wěn)定性[5]、抗氧化活性[6]。目前,許多不同的蛋白質(zhì)例如大豆蛋白[7]、乳清蛋白[8]、大米蛋白[9]等和不同種糖進(jìn)行糖基化反應(yīng)以提高其功能性質(zhì)已經(jīng)被研究。葡聚糖是糖基化反應(yīng)中應(yīng)用最多的多糖,研究表明,葡聚糖糖基化對(duì)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)具有良好的改善效果。Zhang等人[10]研究了葡聚糖糖基化燕麥蛋白的乳化性,結(jié)果表明,燕麥蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物制備的乳液相比于天然燕麥蛋白粒徑更小,并且具有更好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。Laura等人[11]研究了β-乳球蛋白和葡聚糖之間的接枝反應(yīng),結(jié)果表明,反應(yīng)產(chǎn)物的溶解性和熱穩(wěn)定性得到顯著提高。

本文以綠豆蛋白為研究對(duì)象,利用葡聚糖糖基化改性綠豆分離蛋白,研究了不同反應(yīng)條件下得到的綠豆分離蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物的溶解性和乳化特性,并對(duì)相關(guān)機(jī)理進(jìn)行探究,為綠豆分離蛋白的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

東北綠豆、福臨門(mén)牌大豆色拉油市售;1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)Sigma公司;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒北京創(chuàng)根勝泰科技有限公司;Lowry法測(cè)溶解度試劑盒上海荔達(dá)生物科技有限公司;其他試劑均為分析純。

電子分析天平(0.0001 g)北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;FD 5-3型冷凍干燥機(jī)美國(guó)SIM公司;高速均質(zhì)機(jī)上海昂尼儀器儀表有限公司;722型分光光度計(jì)上海菁華科技儀器有限公司;GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;F-4500熒光分光光度計(jì)日本HITACHI公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1綠豆分離蛋白的制備綠豆—浸泡12 h(料液比為1∶10,4 ℃)—去皮—磨漿—用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為9—室溫下攪拌20 min—10000×g離心30 min(4 ℃)—上清液用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為4—10000×g離心30 min(4 ℃)沉淀加水分散—用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至中性—真空冷凍干燥(﹣50 ℃)—綠豆分離蛋白[12]。

1.2.2綠豆分離蛋白-葡聚糖接枝物的制備綠豆分離蛋白和葡聚糖(w/w=1∶1)溶解于磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8 0.2 mol/L)中,使蛋白濃度為10 mg/mL,室溫?cái)嚢? h至完全溶解,置于80 ℃水浴鍋中反應(yīng)1～6 h,反應(yīng)結(jié)束后迅速?zèng)_冷水使其冷卻至室溫,離心后上清液置于蒸餾水中透析24 h(4 ℃),凍干成粉后置于冰箱中備用。

1.2.3接枝度測(cè)定采用OPA法[13]。配制OPA試劑,此試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用。準(zhǔn)確稱取40.0 mg的OPA溶解于1.0 mL甲醇中,再加入20%(w/w)的十二烷基硫酸鈉(SDS)2.5 mL,硼砂(0.1 mol/L)25.0 mL,β-巰基乙醇100 μL,最后用蒸餾水定容到50 mL。測(cè)定時(shí),取4.0 mL OPA試劑于試管中,加入200 μL樣品,混合均勻,放入35 ℃水浴中反應(yīng)2 min后在340 nm下測(cè)吸光值A(chǔ)340,另取4.0 mL OPA試劑于試管中,加入200 μL水作為空白對(duì)照。

接枝度可以用此公式計(jì)算:

其中:A0:接枝反應(yīng)前溶液的吸光值;A1:接枝反應(yīng)后溶液的吸光值。

1.2.5綠豆分離蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物乳液的制備將綠豆分離蛋白、綠豆分離蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物分別溶于磷酸鹽緩沖溶液中(0.01 mol/L,pH7.0),室溫?cái)嚢? h,在4 ℃過(guò)夜使蛋白充分水合。次日10000×g離心20 min,取上清液。測(cè)定蛋白濃度并稀釋一定倍數(shù),并添加一定量的大豆油,使最終乳液中含有10%(v/v)的大豆油和0.5%(w/v)的蛋白質(zhì)。用高速均質(zhì)機(jī)進(jìn)行均質(zhì),轉(zhuǎn)速20000 r/min,時(shí)間為1 min。

1.2.6乳液粒徑的測(cè)定利用Malvern Mastersizer 2000 激光粒度儀測(cè)定乳液液滴的平均粒徑和粒度分布。乳液液滴的平均粒徑采用體積平均直徑(d43)來(lái)表示。所有的測(cè)試均在25 ℃條件下進(jìn)行,并且平行測(cè)定三次。

1.2.7表面疏水性測(cè)定表面疏水性的測(cè)定采用ANS熒光探針?lè)╗15]。用0.01 mol/L的磷酸緩沖液(pH7.0)配制不同濃度的蛋白質(zhì)溶液(0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/mL)和8.0 mmol/L的1-苯胺基-8-萘磺酸(1-anilino-8-naphthalene-sulfonate,ANS)溶液。取20 μL ANS溶液加到4.0 mL蛋白質(zhì)溶液中,混合均勻,迅速測(cè)定混合液的熒光強(qiáng)度,激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別是390、470 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm。以熒光強(qiáng)度對(duì)樣品濃度作圖,曲線的初始斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性(H0)。

1.2.8SDS-PAGE凝膠電泳的測(cè)定本實(shí)驗(yàn)參考Laemmli[16]的方法并稍加修改。分離膠濃度12%(w/v),包括12%凝膠儲(chǔ)備液,0.375 mol/L Tris-HCl(pH 8.8),0.1% SDS,0.1%過(guò)硫酸銨,0.1% TEMED;濃縮膠采用5%(w/v),包括5%凝膠儲(chǔ)備液,0.125 mol/L Tris-HCl(pH 6.8),0.1% SDS,0.1%過(guò)硫酸銨,0.1% TEMED。蛋白樣品與上樣緩沖液(100 mg SDS,0.25 mLβ-巰基乙醇,2 mg溴酚藍(lán),2 mL pH為8.0,濃度0.05 mol/L Tris-HCl,甘油2.0 mL,定容至10 mL配至濃度為1 mg/mL,然后在95 ℃下進(jìn)行5 min的加熱,上樣量為10 μL。電泳過(guò)程恒壓,濃縮膠電壓80 V,分離膠120 V。染色劑為0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250(甲醇∶冰乙酸=4∶1∶5)的混合溶液,脫色劑為(甲醇∶冰乙酸∶水=4∶1∶5)混合溶液。

采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白:雞蛋清溶菌酶(14.4 ku),牛奶β-乳球蛋白(18.4 ku),大腸桿菌REase Bsp981(25.0 ku),乳酸脫氫酶(35.0 ku),雞蛋乳清蛋白(45.0 ku),牛血清白蛋白(66.2 ku)和β-半乳糖苷酶(116 ku)[17]。

1.3數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次,采用Origin9.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖及分析。

2　結(jié)果與討論

2.1接枝度(DG)和褐變程度(A(420 nm))的分析

接枝度和褐變程度常被用來(lái)評(píng)價(jià)糖基化反應(yīng)的程度。糖基化反應(yīng)過(guò)程中,蛋白質(zhì)中的游離氨基可以與多糖的羰基發(fā)生反應(yīng),形成共價(jià)復(fù)合物,使體系中的游離氨基逐漸減少,接枝度升高[18]。MBPI和Dextran反應(yīng)產(chǎn)物的接枝度隨反應(yīng)時(shí)間的變化如圖1所示。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),產(chǎn)物的接枝度不斷增加。這是由于隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白質(zhì)鏈展開(kāi),從而暴露出更多的游離氨基參與到反應(yīng)中,使接枝度不斷增大[10]。

圖1　綠豆分離蛋白-葡聚糖復(fù)合物接枝度 和褐變程度的變化Fig.1　DG degree of the glycosylation and browning of mung bean protein isolates-dextran conjugates注:樣品1～6:反應(yīng)1～6 h后得到的 綠豆分離蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物,圖3～圖5同。

MBPI-Dextran共價(jià)復(fù)合物的褐變程度隨反應(yīng)的時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)。有報(bào)道稱[8],Maillard反應(yīng)的高級(jí)階段,糖類(lèi)中的還原性羰基和蛋白質(zhì)中的游離氨基的反應(yīng)會(huì)生成含氮的棕色聚合物或共聚物。褐變程度的增加表明綠豆分離蛋白和葡聚糖在反應(yīng)過(guò)程中生成了Maillard高級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物,并隨時(shí)間的延長(zhǎng)含量逐漸增加。

2.2SDS-PAGE凝膠電泳分析

圖2為反應(yīng)不同時(shí)間后得到的MBPI-Dextran共價(jià)復(fù)合物的電泳譜圖。反應(yīng)1 h后,(條帶3),分離膠上端逐漸出現(xiàn)較寬的條帶,這表明綠豆分離蛋白和葡聚糖反應(yīng)后產(chǎn)生了較大分子量的復(fù)合物[14],隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),靠近分離膠頂端的條帶顏色逐漸加深,表明有越來(lái)越多的大分子量物質(zhì)的生成。同時(shí),分子量在18.4～66.2 ku之間的條帶隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸變淺直至消失,表明這些范圍內(nèi)的蛋白亞基參與了糖基化反應(yīng)。MBPI-Dextran共價(jià)復(fù)合物電泳圖譜的這種變化與接枝度及褐變程度的變化情況相符。

圖2　綠豆分離蛋白-葡聚糖復(fù)合物電泳圖譜Fig.2　SDS-PAGE profiles of mung bean protein isolates-dextran conjugates注:條帶M:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品;條帶1:未處理綠豆分離蛋白; 條帶2:綠豆分離蛋白和葡聚糖的混合物;條帶3～8: 反應(yīng)1～6 h后得到的綠豆分離蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物。

2.3溶解性分析

圖3為MBPI-Dextran共價(jià)復(fù)合物溶解性隨反應(yīng)時(shí)間的變化情況,隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)復(fù)合物的溶解性逐漸增加后呈現(xiàn)出略微的下降,但糖基化處理組整體上溶解度均高于未處理的綠豆分離蛋白。這是因?yàn)榉磻?yīng)的開(kāi)始階段,隨著接枝度逐漸增大,由于糖鏈的引入為綠豆分離蛋白帶來(lái)了親水性羥基,使得蛋白質(zhì)分子表面形成水化層,增加了綠豆分離蛋白的親水性[19],也有研究表明適度的熱處理對(duì)蛋白質(zhì)的溶解性有一定的改善作用。隨著反應(yīng)時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng),接枝物的溶解性發(fā)生略微的下降,這是由于蛋白質(zhì)分子進(jìn)一步交聯(lián)聚合的結(jié)果。這個(gè)結(jié)果與已有報(bào)道的研究結(jié)果相符[20-22]。

圖3　綠豆分離蛋白-葡聚糖復(fù)合物的溶解性Fig.3　Solubility of mung bean protein isolates-dextran conjugates

2.4乳化特性分析

圖4　綠豆分離蛋白-葡聚糖復(fù)合物乳液的 平均粒徑及粒徑分布Fig.4　The average particle size and particle size distribution of mung bean protein isolates-dextran conjugates emulsions

圖4顯示了MBPI-Dextran共價(jià)復(fù)合物制備的乳液的粒徑大小及粒徑分布情況。MBPI-Dextran共價(jià)復(fù)合物乳液的粒徑比未處理MBPI的乳液粒徑小,這是因?yàn)樘腔磻?yīng)后多糖鏈中的親水基團(tuán)的引入,使得MBPI更有效的吸附到油-水界面上,界面的張力下降,從而提高蛋白的乳化活性[23],此外,液滴表面吸附的共價(jià)復(fù)合物分子由于具有較大的分子空間位阻效應(yīng),能夠阻止新液滴的形成,從而促進(jìn)了微小乳液顆粒的形成,使所得到的乳液體系更加穩(wěn)定[24]。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),乳液液滴的粒徑呈現(xiàn)出先減小后增大的趨勢(shì)，但糖基化處理組的乳液液滴粒徑整體上均小于未處理組。這是因?yàn)殡S著反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行,接枝度不斷增大,更多的親水基團(tuán)的引入會(huì)對(duì)油-水界面的平衡造成破壞,從而降低乳化活性[25]。

2.5表面疏水性分析

MBPI-Dextran共價(jià)復(fù)合物的表面疏水性(H0)如圖5所示?？梢钥闯?隨著糖基化反應(yīng)的時(shí)間延長(zhǎng),產(chǎn)物的H0不斷下降。這是因?yàn)樘腔磻?yīng)后Dextran和MBPI發(fā)生了共價(jià)結(jié)合,一方面,糖基化反應(yīng)能減少蛋白分子內(nèi)部疏水性基團(tuán)的暴露,另一方面,具有親水性基團(tuán)的Dextran的接入增加了分子表面的親水性[26]。結(jié)構(gòu)緊湊的球蛋白內(nèi)部包埋著大量的疏水性殘基[27],當(dāng)綠豆分離蛋白與葡聚糖發(fā)生共價(jià)復(fù)合后,多糖的遮蔽效應(yīng)使得熒光探針難以進(jìn)入蛋白質(zhì)的內(nèi)部與其發(fā)生結(jié)合,從而使H0下降[28]。此外,高溫高濕的極性反應(yīng)條件處理下,蛋白質(zhì)分子之間會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈的疏水相互作用和聚集作用,重新形成內(nèi)部疏水區(qū)域,從而提高了蛋白質(zhì)的親水性[29]。研究表明[30],蛋白質(zhì)的表面疏水性與蛋白質(zhì)的溶解性、表面性質(zhì)等功能性質(zhì)有一定的聯(lián)系,適當(dāng)?shù)臏p少蛋白分子的表面疏水性有利于蛋白質(zhì)溶解度的提升,為其功能性的改善提供基礎(chǔ)。

圖5　綠豆分離蛋白-葡聚糖復(fù)合物的表面疏水性Fig.5　The surface hydrophobicity of mung bean protein isolates-dextran conjugates

3　結(jié)論

隨著糖基化反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),MBPI-Dextran接枝反應(yīng)程度不斷增加,接枝度和褐變程度不斷增大;SDS-PAGE凝膠電泳分析表明,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),分子量較大的共價(jià)復(fù)合物逐漸形成,表明MBPI和Dextran之間發(fā)生了共價(jià)結(jié)合;疏水性的分析表明,糖基化處理能顯著降低蛋白質(zhì)的表面疏水性;經(jīng)過(guò)改性后的蛋白質(zhì)溶解性和乳化特性得到改善,改善效果隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。本研究表明在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下,利用Dextran共價(jià)修飾MBPI是一種有效的改善MBPI理化性質(zhì)的途徑。

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Study on glycosylation of mung bean protein isolates and dextran

HAN Fei-fei1,LI Yang1,WANG Zhong-jiang1,SUI Xiao-nan1,QI Bao-kun1,WANG Rui1,BI Shuang1,LI Qiu-hui1,JIANG Lian-zhou1,2,*

(1.College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.National Research Centre of Soybean Engineering and Technology,Harbin 150030,China)

In order to improve the physicochemical properties of mung bean protein isolates(MBPI),MBPI-dextran covalent conjugates were prepared via Maillard reaction,solubility,emulsifying properties,surface hydrophobicity and subunit structure were studied.SDS-PAGE gel electrophoresis analysis showed that larger molecular weight covalent conjugates were formed,surface hydrophobicity analysis showed that compared to the untreated protein,MBPI-dextran covalent conjugates had a lower surface hydrophobicity,physicochemical properties such as solubility and emulsifying properties were improved after glycosylation.

mung bean protein isolates;glycosylation;protein modification

2015-11-19

韓飛飛(1991-)，女，在讀碩士，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：hffsunshine@163.com。

江連洲(1960-)，男，博士，教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：jlzname@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31571876、31301501)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2014BAD22B00)；國(guó)家“863”計(jì)劃(2013AA102101)；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZD201302)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20132325110013)；國(guó)家“863”計(jì)劃(2013AA102104)。

TS214.9

A

1002-0306(2016)09-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.001