王琦，陳蔚清，張程

(貴州省人民醫(yī)院婦科生殖中心，貴州 貴陽(yáng)　550002)

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不同激光輔助孵化對(duì)玻璃化冷凍和慢速程序冷凍卵裂期胚胎移植妊娠率的影響

王琦，陳蔚清，張程

(貴州省人民醫(yī)院婦科生殖中心，貴州 貴陽(yáng)550002)

目的：研究分析兩種激光輔助孵化方法對(duì)玻璃化冷凍和慢速程序冷凍卵裂期胚胎移植妊娠率的影響。方法：對(duì)2013年11月到2014年7月期間在我院接受冷凍胚胎移植的160例患者進(jìn)行臨床研究，隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組為進(jìn)行激光透明帶打孔輔助孵化，研究組進(jìn)行激光透明帶薄化輔助孵化，比較組間患者的臨床妊娠結(jié)局。結(jié)果：胚胎經(jīng)程序冷凍后,研究組胚胎種植率(19.1%)顯著高于對(duì)照組(12.3%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而解凍后卵裂球存活率(82.21% vs.77.43%)與臨床妊娠率(37.5% vs.32.5%)無(wú)顯著差異(P>0.05)；胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后，研究組和對(duì)照組解凍后卵裂球存活率(87.48% vs.87.41%)、胚胎的臨床妊娠率(37.5% vs.35.0%)、種植率(17.5% vs.15.1%)相比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；研究組中來(lái)源于兩種冷凍方法的卵裂期胚胎解凍后卵裂球存活率(87.48% vs.82.21%)、臨床妊娠率(37.5% vs.37.5%)和種植率(17.5% vs.19.1%)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論：激光透明帶削薄優(yōu)于激光透明帶打孔用于輔助孵化，不影響患者的妊娠率，可減少對(duì)胚胎的損害。

激光輔助孵化；凍胚移植；妊娠率

【Abstract】Objective：To study the influence of two kinds of laser assisted hatching method on frozen thawed embryo transfer pregnancy rate during cleavage stage by vitrification freezing and slow freezing program.Methods：In our hospital a clinical study was performed on 160 patients with frozen embryo used laser zona drilling assisted hatching,while the study group used laser zona pellucida thinning assisted hatching,clinical pregnancy outcome was compared between two groups.Results：Firstly,after cryopreservation,the embryo implantation rate in study group (19.1%)was significantly higher than that of the control group (12.3%),the difference was statistically significant (P<0.05),while the survival rate after thawing cleavage (82.21% vs.77.43%)and clinical pregnancy rate (37.5% vs.32.5%)had no significant difference (P>0.05);In addition,after vitrification freezing,the thawing cleavage survival rate (87.48% vs.87.41%),the clinical pregnancy rate of embryo (37.5% vs.35%)and implantation rate(17.5% vs.15.1%)had no statistically significant difference (P>0.05);What is more,the thawing cleavage survival rate (87.48% vs.82.21%),the clinical pregnancy rate of embryo (37.5% vs.37.5%)and the implantation rate (17.5% vs.19.1%)in the study group from two freezing methods,had no significant difference (P>0.05).Conclusion：The laser zona pellucida thinning assisted hatching is superior to laser zona drilling assisted hatching,it doesn't affect the patient’s pregnancy rate and can reduce the damage for the embryo.

【Key words】Laser assisted hatching;Frozen embryo transfer;Pregnancy rate

輔助孵化被用于輔助生殖相關(guān)技術(shù)已具有較長(zhǎng)的時(shí)間，近幾年隨著顯微激光相關(guān)醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，激光系統(tǒng)由于具有快速、安全、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)而被引入到輔助孵化，且已獲得較好的臨床效果[1-2]。本文關(guān)于兩種激光輔助孵化方法對(duì)人類(lèi)早期胚胎解凍后移植妊娠率的影響進(jìn)行研究分析，所研究的結(jié)果報(bào)道如下。

1　資料和方法

1.1一般資料

將2013年11月到2014年7月期間在我院接受凍融胚胎移植的160例患者作為臨床研究對(duì)象，按照隨機(jī)的原則分為兩組，每組80例，對(duì)照組中患者的年齡為27～40歲，平均年齡為(35.6±1.2)歲，該組患者子宮膜厚度平均值為(10.6±1.2)mm；研究組中患者的年齡為26～39歲，平均年齡為(35.3±1.0)歲，該組患者子宮膜厚度平均值為(10.7±1.6)mm。兩組排除了宮腔因素引起的不孕患者，且年齡、子宮內(nèi)膜厚度相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可以進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2方法

1.2.1D3胚胎評(píng)級(jí)參照胚胎分級(jí)[3]1級(jí)：胚胎卵裂球大小均勻，形態(tài)規(guī)則，透明帶完整；胞質(zhì)均勻清晰，沒(méi)有顆?，F(xiàn)象，碎片0%～5%；2級(jí)：胚胎卵裂球大小略不均勻，形態(tài)略不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆粒現(xiàn)象，碎片10%～20%之間；3級(jí)：胚胎卵裂球明顯大小不均，可有明顯的形狀不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆粒現(xiàn)象，胞質(zhì)碎片21%～50%；4級(jí)：胚胎卵裂球大小嚴(yán)重不均，胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆?，F(xiàn)象，胞質(zhì)碎片>50%。

1.2.2冷凍胚胎選擇(1)正常受精；(2)D1、D2、D3連續(xù)發(fā)育；(3)D2 在2細(xì)胞以上，D3卵裂球數(shù)≥6個(gè)；(4)胚胎評(píng)級(jí)2級(jí)以上；解凍后胚胎移植的標(biāo)準(zhǔn)：胚胎解凍后有超過(guò)50%的卵裂球存活的胚胎認(rèn)為胚胎解凍后復(fù)蘇，并用于移植。

1.2.3胚胎慢速程序冷凍及解凍法(1)胚胎冷凍：冷凍試劑盒Quinn’s胚胎冷凍配套培養(yǎng)基。操作步驟：胚胎于37℃移入Fl(冷凍稀釋培養(yǎng)基(含10%SPS的HEPES液))中，將胚胎在培養(yǎng)皿的不同區(qū)域反復(fù)沖洗，放置10 min；移入F2(1.5 M PPD溶液)中，于室溫平衡10 min；移入F3(1.5 M PPD+0.1 M蔗糖溶液)中，裝入冷凍麥管并封好管口。將冷凍管置入已在起始溫度的程序冷凍儀(英國(guó)Planer公司)中，開(kāi)始冷凍從室溫(25℃)開(kāi)始，以2 ℃/min的速度從室溫降至-8 ℃，當(dāng)溫度穩(wěn)定在-8 ℃時(shí)，進(jìn)行植冰，并停留10 min，之后以-0.3 ℃/min的速度從-8 ℃降至-30 ℃，再以10 ℃/min的速度從-30 ℃降至-150 ℃，投入液氮，并轉(zhuǎn)移至保存罐中。(2)胚胎解凍：解凍試劑盒Quinn’s胚胎解凍配套培養(yǎng)基。從液氮罐中取出麥管。在空氣中保持30～40 s。投入37 ℃水浴，30 s，直到冰完全融化，然后將胚胎移入0.5 M蔗糖解凍液中10 min，再移至0.2 M蔗糖解凍液中5 min之后移入HEPES培養(yǎng)基(含10%SPS)中洗7次，最后移至預(yù)平衡的卵裂培養(yǎng)基中待行輔助孵化。

1.2.4玻璃化冷凍和解凍法試劑為瑞典Vitrolife卵裂期胚胎玻璃化冷凍/解凍配套培養(yǎng)基。按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行冷凍及復(fù)蘇。(1)胚胎冷凍：所有的操作均在37 ℃熱臺(tái)上進(jìn)行，把胚胎放入基礎(chǔ)液(不含冷凍保護(hù)劑)里平衡5～10 min，然后將胚胎移入以乙二醇作為冷凍保護(hù)劑的培養(yǎng)基中2 min，最后在含有丙二醇、聚蔗糖和蔗糖為冷凍保護(hù)劑的冷凍液中平衡，30 s內(nèi)將胚胎移入低溫冷凍載體(瑞典Vitrolife封閉式載體)上并轉(zhuǎn)移入液氮中保存。(2)胚胎解凍：把冷凍載體從液氮中取出，然后迅速放入Warm1里10～30 s后移入Warm2中1 min后，再移入Warm3中平衡2 min，最后將胚胎置入基礎(chǔ)液中平衡5 min，后移入預(yù)先平衡的卵裂培養(yǎng)基中等待行輔助孵化。

1.2.5輔助孵化顯微激光操作系統(tǒng)(美國(guó)ZILOS-tK系統(tǒng))。對(duì)照組進(jìn)行激光透明帶打孔輔助孵化，選取胚胎卵周隙的最大位置持續(xù)的以2～3 ms的激光能量進(jìn)行激光打孔將部分胚胎透明帶切除掉，需保證中心部分完全的穿透透明帶，盡量避免傷害到胚胎細(xì)胞，并將胚胎移到培養(yǎng)液滴中置于培養(yǎng)箱保存以等待進(jìn)行移植；研究組進(jìn)行激光透明帶削薄輔助孵化，選取胚胎卵周隙的最大位置以4～6 ms的激光能量將削薄1/4左右的胚胎透明帶，削掉約50%～80%的透明帶厚度，并防止穿透透明帶，將胚胎移到培養(yǎng)液滴中置于培養(yǎng)箱保存以等待進(jìn)行移植。對(duì)對(duì)照組80例進(jìn)行激光透明帶打孔輔助孵化，對(duì)研究組80例進(jìn)行激光透明帶削薄輔助孵化，并且每組均有40例為程序冷凍、40例為玻璃化冷凍。將經(jīng)激光輔助孵化后的卵裂期胚胎在腹部B超的指導(dǎo)下移植到患者的宮腔，并于移植后對(duì)患者使用黃體酮或者HCG進(jìn)行黃體支持。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

胚胎經(jīng)程序冷凍后,研究組(激光透明帶削薄)胚胎種植率(19.1%)高于對(duì)照組(激光透明帶打孔)(12.3%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而解凍后卵裂存活率(82.21% vs.77.43%)與臨床妊娠率(37.5% vs.32.5%)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后，研究組和對(duì)照組解凍后卵裂存活率(87.48% vs.87.41%)、胚胎的臨床妊娠率(37.5% vs.35.0%)、種植率(17.5% vs.15.1%)相比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；研究組中來(lái)源于2種冷凍方法的卵裂期胚胎解凍后卵裂存活率(87.48% vs.82.21%)、臨床妊娠率(37.5% vs.37.5%)和種植率(17.5% vs.19.1%)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。詳細(xì)情況如表1、表2所示。

表1　兩組患者的解凍后卵裂球存活率(%)

表2　兩組患者妊娠率與種植率對(duì)比(%)

3　討論

由于透明帶能進(jìn)行局部的裂解是囊胚可以正常的孵出和種植的關(guān)鍵因素，而囊胚在體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)相關(guān)變化和小分子物質(zhì)的相互作用可引起透明帶逐漸的擴(kuò)張及變薄，并于局部出現(xiàn)溶解、斷裂，進(jìn)而使囊胚的正常孵出及成功種植得到保證[4-5]。但由于所凍融的胚胎透明帶會(huì)受到相關(guān)理化因素的影響，使糖蛋白的基質(zhì)出現(xiàn)改變致使透明帶變硬而對(duì)囊胚的孵出情況造成一定的影響，所以在對(duì)凍融胚胎進(jìn)行移植之前進(jìn)行一定的輔助孵化已被逐漸推廣，然而進(jìn)行輔助孵化是否可以使所凍融胚胎的妊娠率及種植率得到提高尚具有一定的爭(zhēng)議，可能是與所選取的研究對(duì)象(如卵裂期胚胎、囊胚)、冷凍的方法(進(jìn)行程序冷凍、玻璃化冷凍)、輔助孵化的方法(進(jìn)行化學(xué)噴酸輔助孵化、激光輔助孵化)、透明帶的處理程度(進(jìn)行透明帶的打孔、薄化、切除)等存在不同具有一定關(guān)系[6-7]。一般情況下，凍融囊胚的孵出多選擇切除透明帶法，激光薄化法和激光打孔法則常被用于卵裂期胚胎，并且，對(duì)透明帶進(jìn)行激光薄化法比激光打孔法出現(xiàn)孵化嵌頓的情況較少，對(duì)于胚胎的安全性更高，臨床使用更加廣泛[8]。

本研究顯示，程序冷凍及玻璃化冷凍下的胚胎復(fù)蘇情況之間的差異不明顯(P>0.05)，但研究組與對(duì)照組中玻璃化冷凍的解凍后卵裂球存活率明顯高于程序冷凍(P<0.05)，在程序冷凍及玻璃化冷凍情況下研究組的妊娠率高于對(duì)照組，但組間差異不明顯(P>0.05)，提示玻璃化冷凍雖然與程序冷凍的臨床結(jié)局無(wú)差異，但玻璃化冷凍后解凍卵裂球的完整率高，且玻璃化冷凍耗時(shí)較短；另外，在程序冷凍解凍之后研究組的種植率明顯高于對(duì)照組，(P<0.05)，而玻璃化冷凍之后研究組的種植率差異不明顯(P>0.05)，說(shuō)明與激光透明帶打孔輔助孵化相比，激光透明帶削薄輔助孵化可使程序冷凍的胚胎的種植率得到明顯提高，而對(duì)玻璃化冷凍下種植率無(wú)明顯影響?？傊?，進(jìn)行玻璃化冷凍解凍后胚胎的質(zhì)量要明顯的優(yōu)于進(jìn)行程序冷凍的結(jié)果，但在玻璃化冷凍情況下進(jìn)行激光透明帶打孔與激光透明帶削薄輔助孵化后的妊娠率和種植率與在程序冷凍下相比差異不明顯。目前對(duì)于輔助孵化是否改善了IVF的臨床結(jié)局尚存在爭(zhēng)議，但我們的觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為它是有用的，也許它有助于克服孵化前的機(jī)構(gòu)性阻力，減少了胚胎完成孵化過(guò)程所需要的能量從而更利于胚胎的種植。從本研究的結(jié)果來(lái)看進(jìn)行激光透明帶削薄比激光透明帶打孔輔助孵化的胚胎種植率更好，也許它更類(lèi)似于胚胎在自然孵化過(guò)程中透明帶自然減薄的過(guò)程，并且可能避免對(duì)胚胎產(chǎn)生的某些損傷，對(duì)胚胎的安全性較好，并且臨床的妊娠率較好，具有一定的臨床意義。

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(學(xué)術(shù)編輯：李佳平)

Effects of two kinds of laser assisted hatching method on frozen thawed embryo transfer pregnancy rate during cleavage stage

WANG Qi，CHEN Wei-qing,ZHANG Cheng

(Gynecological Reproductive Center,Guizhou Provincial People’s Hospital,Guiyang 550002,Guizhou,China)

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.04.023論著

貴陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(20151001)

2015-12-23

王琦(1979-)，女 ，碩士，主治醫(yī)師。E-mail：qixian66888@126.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-8-217∶48網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160802.1748.046.html

1005-3697(2016)04-0535-03

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