王永慶，李慶生，吳 煒，夏雷鳴

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硼替佐米對(duì)小鼠骨髓移植后Th1/Th2/Th17細(xì)胞亞群分化的影響

王永慶，李慶生，吳 煒，夏雷鳴

目的 觀察硼替佐米對(duì)小鼠急性移植物抗宿主病（aGVHD）后輔助性T細(xì)胞（Th）1/Th2/Th17細(xì)胞亞群分化及其主要的效應(yīng)性細(xì)胞因子［γ-干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-17A］表達(dá)的影響。方法 建立小鼠aGVHD動(dòng)物模型，將小鼠隨機(jī)分3組：正常對(duì)照組、移植對(duì)照組、移植+硼替佐米組。觀察各組小鼠的生存時(shí)間、aGVHD表現(xiàn)和嵌合度，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第7天外周血Th1/Th2/Th17細(xì)胞亞群的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)血清中IFN-γ、IL-4、IL-17A水平。結(jié)果 移植對(duì)照組小鼠出現(xiàn)典型的aGVHD癥狀，2周內(nèi)死于aGVHD，平均存活時(shí)間為11 d，移植+硼替佐米組小鼠aGVHD癥狀明顯減輕，平均生存時(shí)間較移植對(duì)照組顯著延長，60 d時(shí)生存率為60%。移植對(duì)照組小鼠Th1/Th17細(xì)胞亞群明顯升高（P＜0.01），Th2細(xì)胞亞群比例降低（P＜0.01）。輸注硼替佐米后Th1/Th17細(xì)胞亞群比例降低，但仍高于正常對(duì)照（P＜0.05），Th2細(xì)胞亞群比例上升，與正常對(duì)照差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。移植對(duì)照組小鼠血清IFN-γ和IL-17A水平明顯升高（P＜0.01），IL-4水平顯著降低（P＜0.01）。輸注硼替佐米后IFN-γ和IL-17A水平降低，但仍高于正常對(duì)照（P＜0.05），IL-4水平上升，低于正常對(duì)照（P＜0.05）。結(jié)論 移植后早期輸注硼替佐米可通過下調(diào)Th1/ Th17細(xì)胞分化比例及IFN-γ和IL-17A的表達(dá)來減輕小鼠異基因移植后的aGVHD，提高生存率。

硼替佐米；小鼠；急性移植物抗宿主病；Th1細(xì)胞；Th2細(xì)胞；Th17細(xì)胞

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-6-6 13：52：32 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.022.html

異基因造血干細(xì)胞移植是治療惡性血液病和某些非惡性遺傳性缺陷病的最有效方法之一，但移植后急性移植物抗宿主?。╝cute graft-versus-host disease，aGVHD）的發(fā)生率高達(dá)20%～80%，是造成患者死亡和生活質(zhì)量下降的主要原因之一［1］。因此，尋找新的藥物和方法防治aGVHD成為目前研究的熱點(diǎn)。硼替佐米作為首個(gè)應(yīng)用于臨床的蛋白酶體抑制劑，其作用機(jī)制與核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途徑的抑制有關(guān)［2］。NF-κB途徑在活化的自身反應(yīng)性T細(xì)胞中的活性明顯增強(qiáng)，而自身反應(yīng)性T細(xì)胞的異?；罨莂GVHD的主要發(fā)病機(jī)制［3］。早期的研究［4-5］證實(shí)移植后早期輸注硼替佐米可減輕小鼠異基因移植后的aGVHD、提高生存率；而移植后延期輸注硼替佐米則會(huì)加重aGVHD，但移植后早期輸注硼替佐米減輕小鼠異基因移植后的aGVHD作用機(jī)制尚不明確。該研究觀察aGVHD時(shí)小鼠經(jīng)早期輸注硼替佐米作用后外周血輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）1/Th2/Th17細(xì)胞亞群分化及其主要的效應(yīng)性細(xì)胞因子γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4、IL-17A表達(dá)，以探討硼替佐米防治aGVHD的作用機(jī)制，為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1小鼠移植模型的建立

1.1.1藥品、試劑和設(shè)備 硼替佐米購自美國Millennium公司；刺激劑PMA、Ionomycin購自美國Sigma公司；FITC標(biāo)記的anti-mouse CD3、PE標(biāo)記的anti-mouse CD4、APC標(biāo)記的anti-mouse IFN-γ、IL-4、IL-17A、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑Monensin購自美國eBioscience公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；小鼠IFN-γ、IL-4、IL-17A ELISA試劑盒購自廣州瑞博奧生物科技有限公司；FCM Beckman Coulter EPICS XL-4C購自美國Beckman Coulter公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀Ultra-Mark購自美國Bio-Bad公司。

1.1.2受鼠準(zhǔn)備 清潔級(jí)近交系BALB/c（H-2d+）小鼠，雌性，7～9周齡，17～22 g。受鼠飲用添加紅霉素（250 mg/L）和慶大霉素（32×104U/L）的滅菌水，飼料經(jīng)紫外線照射后放入層流架中，并持續(xù)到移植后4周。移植前4 h小鼠經(jīng)60 Co γ射線全身均勻照射（total body irradiation，TBI），總劑量為7.0 Gy，劑量率為0.5 Gy/min。

1.1.3供鼠骨髓細(xì)胞的準(zhǔn)備 取10～12周雄性C57BL/6（H-2b+）小鼠，頸椎脫位法處死，浸入75%乙醇10 min，分離股骨和脛骨。用 RPMI 1640從骨髓腔沖出單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5× 107/ml。

1.1.4實(shí)驗(yàn)分組 正常對(duì)照組（8只）：未做任何處理；移植對(duì)照組（20只）：TBI后輸入供鼠骨髓細(xì)胞0.4 ml；移植+硼替佐米組（20只）：TBI后輸入供鼠骨髓細(xì)胞0.4 ml，第0～2天接受尾靜脈輸注硼替佐米1 mg/（kg·d）。在層流柜中無菌飼養(yǎng)觀察至第60天。另設(shè)預(yù)處理對(duì)照組（8只），單純接受TBI，以觀察預(yù)處理方案是否為清髓性的。

1.2主要觀察指標(biāo)

1.2.1一般狀況觀察 定期檢測(cè)小鼠體重，觀察進(jìn)食以及精神狀況，有無弓背、翹毛、腹瀉、體重減輕、精神萎靡等 aGVHD表現(xiàn)，記錄每只小鼠的存活時(shí)間；存活超過60 d，體重、飲食及活動(dòng)正常者為長期生存，并計(jì)算生存率。

1.2.2嵌合度檢測(cè) 取2只存活超過30 d的小鼠的骨髓細(xì)胞，H-2b-PE熒光抗體染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)受鼠中供鼠來源的細(xì)胞（H-2b+）的百分比以確定嵌合體形成情況。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Th1/Th2/Th17細(xì)胞亞群 第7天采集受鼠眼球血1 ml，肝素抗凝，淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞層，PBS洗滌后用RPMI1640重懸。將淋巴細(xì)胞懸液置于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入2×106細(xì)胞，加入PMA（終濃度50 ng/ ml）、Ionomycin（終濃度1 μg/ml）及 Monensin（終濃度2 mmol/L），加RPMI1640至1 ml；置37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入FITC標(biāo)記的anti-mouse CD3、PE標(biāo)記的anti-mouse CD4，4℃避光孵育30 min。洗滌2次后加入固定液100 ml，4℃固定15 min后，加入破膜液4℃孵育15 min，洗滌2次后每管分為3份分別加入APC標(biāo)記的anti-mouse IFN-γ、IL-4、IL-17A，4℃避光孵育30 min。洗滌2次后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以 CD4+IFN-γ+、CD4+IL-4+、CD4+IL-17A+細(xì)胞占CD3陽性細(xì)胞比例進(jìn)行分析。

1.4檢測(cè)血清中IFN-γ、IL-4、IL-17A的濃度 第7天采集受鼠眼球血，室溫靜置1 h，2 000 r/min離心10 min后分離血清，按照ELISA試劑盒說明檢測(cè)血清中IFN-γ、IL-4、IL-17A的濃度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，用方差分析檢測(cè)組間的總差異。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

2　結(jié)果

2.1移植小鼠aGVHD的發(fā)生情況 小鼠死亡時(shí)白細(xì)胞（white blood cell，WBC）＜0.5×109/L為移植失敗；WBC≥0.5×109/L并有弓背、翹毛、脫毛、腹瀉及體重減輕等表現(xiàn)者為 aGVHD征象。單純照射小鼠在5 d內(nèi)全部死亡，死亡前WBC＜0.5×109/ L，說明為清髓性預(yù)處理方案。移植對(duì)照組小鼠于移植后第6天開始出現(xiàn)倦怠、消瘦、食欲下降、皮毛紊亂、無光澤、弓背，1/2小鼠出現(xiàn)皮膚潰瘍、腹瀉表現(xiàn)，14 d內(nèi)全部死亡（死亡前WBC＞0.5×109/L），平均存活時(shí)間為11 d。移植+硼替佐米組小鼠有16只出現(xiàn)倦怠、體重下降、弓背、翹毛、腹瀉等aCVHD表現(xiàn)，但較移植對(duì)照組減輕，40%于TBI后14 d死于aGVHD，60 d時(shí)生存率為60%。

2.2嵌合度檢測(cè) 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)隨機(jī)檢測(cè)移植+硼替佐米組2只存活受鼠30 d骨髓中H-2b+細(xì)胞的百分率，結(jié)果顯示嵌合度在95%以上，表明移植成功（圖1）。

圖1　移植后　H-2b細(xì)胞表達(dá)率與正?！ALB/c小鼠比較

2.3外周血Th1/Th2/Th17細(xì)胞亞群分化比率變化 3組小鼠外周血Th1/Th2/Th17細(xì)胞亞群分化比率變化見表1。移植對(duì)照組小鼠Th1/Th17細(xì)胞亞群明顯升高（P＜0.01），Th2細(xì)胞亞群比例降低（P＜0.01）。移植+硼替佐米組小鼠Th1/Th17細(xì)胞亞群比例較移植對(duì)照組減少，但仍高于正常對(duì)照組（P＜0.05），Th2細(xì)胞亞群比例上升，與正常對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

2.4小鼠細(xì)胞因子水平測(cè)定 移植對(duì)照組小鼠血清IFN-γ和IL-17A水平明顯升高（P＜0.01），IL-4水平顯著降低（P＜0.01）。移植+硼替佐米組小鼠血清IFN-γ和IL-17A水平較移植對(duì)照組降低，但仍高于正常對(duì)照組（P＜0.05），IL-4水平上升，低于正常對(duì)照組（P＜0.05）。見表2。

表1　3組小鼠外周血　Th1/Th2/Th17細(xì)胞亞群分化（±s）

表1　3組小鼠外周血　Th1/Th2/Th17細(xì)胞亞群分化（±s）

與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

項(xiàng)目　正常對(duì)照組移植對(duì)照組移植　+硼替佐米組F值Th1　1.82±0.49　4.21±0.56**　2.65±0.52*32.57 Th2　2.73±0.82　1.37±0.34**　2.56±0.53　9.24 Th17　2.03±0.71　4.52±0.54**　3.09±0.65*23.14

圖2　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組小鼠外周血　Th1/Th2/Th17細(xì)胞比例

表2　3組小鼠血清中　IFN-γ、IL-4、IL-17A的水平（±s）

表2　3組小鼠血清中　IFN-γ、IL-4、IL-17A的水平（±s）

與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

項(xiàng)目　正常對(duì)照組　移植對(duì)照組　移植+硼替佐米組　F值IFN-γ（pg/ml）　158.93±52.91　630.24±67.63**　451.28±71.59*81.32 IL-4（pg/ml）　230.64±54.36　124.67±38.42**　190.58±55.34*　6.88 IL-17A（pg/ml）　210.98±34.96　365.17±45.63**　259.42±51.38*18.83

3　討論

aGVHD的組織損傷是由供者的T細(xì)胞識(shí)別受者不同組織相容性抗原所介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用引起，而Th細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的細(xì)胞因子參與了aGVHD的發(fā)生，因此Antin［6］提出了“細(xì)胞因子風(fēng)暴”學(xué)說。一般認(rèn)為，T前體細(xì)胞在抗原的刺激下，在不同的微環(huán)境中，可選擇性分化為Th1、Th2、Th17和Treg等細(xì)胞［7］。早期的研究［8］顯示，Th1類細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α等促進(jìn)aGVHD的發(fā)生，而Th2類細(xì)胞因子能抑制IFN-γ的分泌，減輕aGVHD。最近的研究［9-10］表明，Th17細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-17也參與了aGVHD的發(fā)生、發(fā)展。小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［11］顯示，Th17細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17可以引起小鼠肺和皮膚組織嚴(yán)重的GVHD。若對(duì)宿主組織器官予以保護(hù)，可以減輕宿主組織器官炎性細(xì)胞因子的過度分泌，使allo-BMT后Th1/Th2/Th17類細(xì)胞因子的產(chǎn)生趨于平衡，從而改善aGVHD［12］。

硼替佐米是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中26S蛋白酶體糜蛋白酶樣活性的可逆抑制劑，在臨床上用于治療多發(fā)性骨髓瘤和某些惡性淋巴瘤患者，已經(jīng)取得了良好的療效，其作用機(jī)制與抑制NF-κB的活性有關(guān)［2］。而NF-κB是T細(xì)胞活化過程中至關(guān)重要的信號(hào)分子，NF-κB經(jīng)分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，可以調(diào)節(jié)下游目的基因的表達(dá)，從而調(diào)控T細(xì)胞活化。鑒于aGVHD發(fā)生過程中自身反應(yīng)性T細(xì)胞的異?；罨约癗F-κB在T細(xì)胞活化過程中的作用，故硼替佐米有可能在aGVHD的治療過程中發(fā)揮作用。前期的研究［13］表明，硼替佐米可抑制骨髓移植清髓照射小鼠預(yù)處理損傷所致肝臟及小腸組織中NF-κB的表達(dá)與激活。但硼替佐米對(duì)移植小鼠Th細(xì)胞亞群分化及其主要的效應(yīng)性細(xì)胞因子的分泌的影響目前尚未有報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，移植對(duì)照組小鼠移植后第7天外周血Th1和Th17細(xì)胞比例明顯上升，而Th2細(xì)胞比例下降，同時(shí)血清中IFN-γ和IL-17A水平也明顯上升，IL-4水平顯著降低，與文獻(xiàn)［8-9］報(bào)道一致，說明Th細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子參與了aGVHD的發(fā)生、發(fā)展。本研究進(jìn)一步顯示，移植后第3天輸注硼替佐米后，小鼠外周血中Thl和Th17細(xì)胞比例較移植對(duì)照組顯著下降，Th2細(xì)胞亞群比例上升，與正常對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與此同時(shí)血清中IFN-γ和IL-17A水平較移植對(duì)照組降低，IL-4水平升高，aGVHD癥狀明顯減輕，平均生存時(shí)間較移植對(duì)照組顯著延長，這說明硼替佐米的應(yīng)用可能使移植后小鼠Th細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的產(chǎn)生發(fā)生改變，從而減輕了aGVHD癥狀，延長了生存時(shí)間。因此，硼替佐米應(yīng)用后降低相關(guān)細(xì)胞因子的水平從另一方面說明將其應(yīng)用于aGVHD的防治是可能的。

綜上所述，硼替佐米有明顯的抗小鼠aGVHD作用，這與其降低Th1/Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子比例，提升Th2細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子比例有關(guān)，提示硼替佐米在防治aGVHD方面有明顯的應(yīng)用前景。

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Effects of bortezomib on the polarization of Th1/Th2/Th17 cells after bone marrow transplantation in mice

Wang Yongqing，Li Qingsheng，Wu Wei，et al
（Dept of Hematology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To investigate the possible role of bortezomib on the polarization of Th1/Th2/Th17 cells and the expression of IFN-γ，IL-4 and IL-17A in mice with acute graft versus host disease（aGVHD）.Methods To establish the animal model of mouse aGVHD，mice were randomly divided into 3 groups，normal control group，transplantation control group，transplantation and early injection bortezomib group.The survival time，clinical manifestations of aGVHD and levels of recipients H-2b cells detected by flow cytometry in the recipient mice were observed. The percentages of Th1，Th2 and Th17 cells in T lymphocytes of peripheral blood were measured by flow cytometry.Double antibody sandwich ELISA was employed to detect the levels of IFN-γ，IL-4 and IL-17A in serum.Results The mice in transplantation control group appeared typical symptoms of aGVHD and all died of aGVHD within 2 weeks after transplantation，and the mean survival time was 11 days.The sympotoms of aGVHD was milder in transplantation and early injection bortezomib group than transplantation control group，and the median survival time was significantly longer.The 60 d survival rate was 60%.The mice in transplantation control group，the peripheral blood Th1 and Th17 cells subsets proportion was significantly increased（P＜0.01）and Th2 cells subsets reduced（P＜0.01）.After injection bortezomib，the peripheral blood Th1 and Th17 cells subsets proportion was reduced，but still higher than the normal control group（P＜0.05），Th2 cell subsets increased，there was no difference between with normal control.The mice in transplantation control group，higher levels of IFN-γ and IL-17A also found in serum and the concentrations of IL-4 reduced（P＜0.01）.After injection bortezomib，levels of IFN-γ and IL-17A decreased significantly，but still higher than the normal control group（P＜0.05），levels of IL-4 increased，but still lower than normal control（P＜0.05）.Conclusion Bonezomib administered immediately after bone marrow transplantation can prevent aGVHD，improve the survival rate.Its mechanism maybe down-regulate the expression of Th1 and Th17 cells differentiation and the ratio of IFN-γ and IL-17A.

bonezomib；murine；acute graft-versus-host disease；Th1 cells；Th2 cells；Th17 cells

R 457.7

A

1000-1492（2016）07-0969-05

2016-03-25接收

安徽省教育廳自然科學(xué)項(xiàng)目（編號(hào)：Kj2011Z165）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，合肥 230022

王永慶，男，副主任醫(yī)師；李慶生，男，博士，副主任醫(yī)師，責(zé)任作者，E-mail：wshysh @sina.com