何文智，馬曉燕，冼嘉嘉，袁天麗，李少英，李雙琳，劉海波，黎　青（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所 廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510150）

廣東地區(qū)漢族人群VEGF基因5′端SNP位點(diǎn)遺傳多態(tài)性

何文智，馬曉燕，冼嘉嘉，袁天麗，李少英，李雙琳，劉海波，黎青
（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所 廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510150）

目的 調(diào)查廣東地區(qū)漢族人群VEGF基因5′端SNP位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性，為法醫(yī)學(xué)應(yīng)用及群體遺傳學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。方法 DNA微測序技術(shù)SNaPshot分析184例廣東地區(qū)無關(guān)個(gè)體VEGF基因5′端4個(gè)SNP位點(diǎn)（rs699947、rs1570360、rs833061、rs2010963）的遺傳多態(tài)性。應(yīng)用PowerMarker v3.25軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 184例廣東地區(qū)漢族無關(guān)個(gè)體VEGF基因5′端4個(gè)SNP位點(diǎn)基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），每個(gè)位點(diǎn)均檢出3種基因型。rs833061和rs699947位點(diǎn)緊密連鎖。共檢出6種單倍型，其中C-G-T-C、C-G-T-G、A-A-C-G、A-G-C-G頻率均＞10%，為主要單倍型。rs699947、rs833061、rs2010963位點(diǎn)的個(gè)人識別率為0.583～0.634，非父排除率為0.133～0.144；4個(gè)SNP構(gòu)成單倍型的個(gè)人識別率為0.868，非父排除率為0.438。結(jié)論 廣東地區(qū)漢族人群VEGF基因5′端序列呈現(xiàn)出高度遺傳多態(tài)性，可作為個(gè)人識別和親權(quán)鑒定的遺傳學(xué)指標(biāo)，同時(shí)可用于相關(guān)疾病關(guān)聯(lián)分析。

法醫(yī)遺傳學(xué)；多態(tài)性，單核苷酸；血管內(nèi)皮生長因子；漢族

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生［1-2］。VEGF屬血小板源生長因子超家族，目前主要包括VEGF-A、胎盤生長因子、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E［3］。VEGF基因位于6p21.3，啟動子區(qū)及5′非翻譯區(qū)所在的SNP位點(diǎn)在人群中具有較高的多態(tài)性，在腫瘤、不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)等疾病中被廣泛研究［4-5］。

本研究應(yīng)用DNA微測序技術(shù)SNaPshot調(diào)查廣東地區(qū)漢族人群 VEGF基因 5′端 rs699947、rs1570360、rs833061、rs2010963 4個(gè)SNP位點(diǎn)的分布情況，探討其法醫(yī)學(xué)意義，也為相關(guān)疾病分析提供遺傳學(xué)參數(shù)。

1　材料與方法

1.1DNA提取及PCR擴(kuò)增

經(jīng)知情同意后采集184名廣東地區(qū)漢族無關(guān)個(gè)體外周血，EDTA抗凝，采用DNeasy?Blood&Tissue試劑盒（德國QIAGEN公司）提取基因組DNA。

PCR擴(kuò)增及SNaPshot微測序引物采用Oligo 6設(shè)計(jì)（表1），微測序引物5′端增加長度不等的聚胞苷酸（PolyC），由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

PCR復(fù)合擴(kuò)增體系：模板DNA 100ng，1×LA Taq緩沖液，dNTP 0.1mmol/L，每個(gè)片段上下游引物反應(yīng)濃度均為1μmol/L。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃30s，62℃ 30s，72℃ 30s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。

表1　基因擴(kuò)增引物及探針序列

1.2基因檢測及測序驗(yàn)證

取2μL PCR產(chǎn)物用蝦堿性磷酸酶FastAP及核酸外切酶ExoⅠ（立陶宛Fermentas公司）消化15 min。SNaPshot體系：反應(yīng)混合液1μL，酶切后的PCR產(chǎn)物4 μL，各位點(diǎn)微測序引物終濃度2 μmol/L，ddH2O補(bǔ)體積至10 μL。SNaPshot反應(yīng)條件：96℃ 10 s；96℃10s，50℃ 5s，60℃ 30s，25個(gè)循環(huán)；60℃ 30s。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)FastAP消化15 min后用3500型遺傳分析儀（美國AB公司）檢測。

隨機(jī)取20例樣本，采用反向擴(kuò)增引物分別對目的片段進(jìn)行基因測序，以驗(yàn)證基因型。測序試劑盒為BigDye Terminator v3.1（美國AB公司），具體方法參照試劑盒操作手冊。測序儀器為3500型遺傳分析儀（美國AB公司）。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算各SNP位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率。用PowerMarker v3.25軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)、連鎖不平衡分析、單倍型分析及單倍型頻率計(jì)算。按Nei［6］的方法計(jì)算雜合度（H），用Modified-Powerstats（標(biāo)準(zhǔn)版）軟件計(jì)算個(gè)人識別率（DP）、非父排除率（PE）及多態(tài)信息含量（PIC）等群體遺傳學(xué)參數(shù)。

2　結(jié)　果

2.1多態(tài)性分析

VEGF基因 5′端 4個(gè) SNP位點(diǎn)［rs699947 （-2578C/A）、rs1570360（-1154G/A）、rs833061（-460T/C）、rs2010963（+405G/C）］均檢出2種等位基因構(gòu)成的3種基因型。圖1～3顯示S13-2及S13-4兩個(gè)樣本SNaPshot檢測及測序驗(yàn)證結(jié)果，S13-2的4個(gè)SNP位點(diǎn)均為雜合，S13-4均為純合。4個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因頻率、基因型頻率見表2。經(jīng)檢驗(yàn)，4個(gè)SNP位點(diǎn)基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。

表2　廣東地區(qū)漢族人群VEGF基因4個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因頻率、基因型頻率?。╪=184）

2.2連鎖不平衡分析

連鎖不平衡分析結(jié)果顯示，rs699947與rs833061緊密連鎖（D′=0.917，表3）。

表3　廣東地區(qū)漢族人群VEGF基因4個(gè)SNP位點(diǎn)連鎖不平衡系數(shù)　（n=184）

2.3群體遺傳學(xué)參數(shù)

單倍型分析顯示，所檢樣本rs699947、rs1570360、rs833061及rs2010963 4個(gè)SNP位點(diǎn)可構(gòu)成6種單倍型，相應(yīng)的單倍型頻率和基因型頻率見表4～5。根據(jù)4個(gè)SNP位點(diǎn)在廣東地區(qū)漢族人群的遺傳多態(tài)性分布情況，計(jì)算各位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表6。單倍型遺傳標(biāo)記的DP和PE分別為0.868和0.438。

表4　廣東地區(qū)漢族人群VEGF基因4個(gè)SNP位點(diǎn)構(gòu)成的6種單倍型頻率?。╪=184）

表5　廣東地區(qū)漢族人群VEGF基因4個(gè)SNP位點(diǎn)構(gòu)成的基因型頻率?。╪=184）

表6　廣東地區(qū)漢族人群VEGF基因4個(gè)SNP位點(diǎn)及其單倍型的群體遺傳學(xué)參數(shù)（n=184）

3　討　論

3.1廣東地區(qū)漢族人群VEGF基因5′端SNP位點(diǎn)分布情況

SNP具有數(shù)量多、分布廣泛、多為二等位基因易于自動分型、適于快速高流量檢測等特點(diǎn)，目前已成為醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

本研究采用DNA微測序技術(shù)調(diào)查VEGF基因啟動子區(qū)及 5′非翻譯區(qū) 4個(gè) SNP位點(diǎn)（rs699947、rs1570360、rs833061、rs2010963）在廣東地區(qū)漢族人群的分布情況。上述4個(gè)SNP位點(diǎn)均在基因編碼區(qū)之外，因此不會改變蛋白質(zhì)序列。但有報(bào)道［7-8］稱不同等位基因型可能會參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。

4個(gè)SNP位點(diǎn)均檢出2種等位基因構(gòu)成的3種基因型。連鎖分析發(fā)現(xiàn)，rs699947與rs833061連鎖不平衡系數(shù)為0.917，顯示出極強(qiáng)的緊密連鎖。上述SNP構(gòu)成6種單倍型，其中C-G-T-C、C-G-T-G、A-A-CG、A-G-C-G頻率均＞10%，為主要單倍型。

本研究獲得的廣東地區(qū)漢族人群VEGF基因5′端SNP位點(diǎn)的等位基因頻率、基因型頻率以及單倍型頻率，為疾病相關(guān)性研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

3.2法醫(yī)學(xué)意義

VEGF基因 5′端 4個(gè) SNP位點(diǎn)中，rs699947、rs833061、rs2010963的 DP為 0.583~0.634，PE為0.133~0.144，具有較高的個(gè)人識別能力。4個(gè)SNP構(gòu)成單倍型的DP為0.868、PE為0.438。說明上述4個(gè)SNP構(gòu)成的單倍型遺傳標(biāo)記具有較高的鑒別能力，可用于法醫(yī)學(xué)個(gè)人識別和親子鑒定。

［1］Pang L，Wei Z，Li O，et al.An increase in vascular endothelial growth factor（VEGF）and VEGF soluble receptor-1（sFlt-1）are associated with early recurrent spontaneous abortion［J］.Plos One，2013，8（9）：e75759.

［2］Samli H，Demir BC，Ozgoz A，et al.Vascular endothelial growth factor gene 1154 G/A，2578 C/A，460 C/T，936 C/T polymorphisms and association with recurrent pregnancy losses［J］.Genet Mol Res，2012，11（4）：4739-4745.

［3］Lash GE，Innes BA，Drury JA，et al.Localization of angiogenic growth factors and their receptors in the human endometrium throughout the menstrual cycleand in recurrent miscarriage［J］.Hum Reprod，2012，27（1）：183-195.

［4］李珠玉，游澤山，蘇秀梅，等.復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與夫妻雙方絨毛血管內(nèi)皮生長因子基因多態(tài)性的關(guān)系［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2011，32（1）：85-89.

［5］Bayhan Z，Simsek T，Ergul E，et al.Serum cytokine levels in patients with colorectal cancers according to tumor stages and VEGF gene polymorphism［J］.Hepatogastroenterology，2014，61（135）：1889-1894.

［6］Nei M.Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals［J］. Genetics，1978，89（3）：583-590.

［7］Prakash S，Agrawal S，Kumar S，et al.Impact of vascularendothelialgrowthfactorsinglenucleotide polymorphism association on acute renal allograft rejection［J］.Nephron，2015，129（2）：91-96.

［8］Peng ML，Tsai YY，Tung JN，et al.Vascular endothelial growth factor gene polymorphism and protein expression in the pathogenesis of pterygium［J］.Br J Ophthalmol，2014，98（4）：556-561.

（本文編輯：李成濤）

Genetic Polymorphisms of SNP Located in the 5′Region of VEGF Gene in Han Population in Guangdong

HE Wen-zhi，MA Xiao-yan，XIAN Jia-jia，YUAN Tian-li，LI Shao-ying，LI Shuang-lin，LIU Hai-bo，LI Qing
（Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province，F(xiàn)orensic Identification Institute of the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510150，China）

Objective To investigate the genetic polymorphism of SNP located in the 5′region of the vascular endothelial growth factor（VEGF）gene in Han population in Guangdong and provide basic data for forensic application and population genetics research.Methods The genetic polymorphisms of 4 SNP loci（rs699947，rs1570360，rs833061，rs2010963）within 5′region of VEGF gene of 184 unrelated individuals in Han population in Guangdong were analyzed by DNA micro sequencing technology SNaPshot. The statistical analysis was carried out by PowerMarker v3.25 software.Results The genotype distributions of the 4 SNP loci within 5′region of VEGF gene of 184 unrelated individuals in Han population in Guangdong were in accordance with Hardy-Weinberg equilibrium （P＞0.05）and 3 kinds of genotypes were detected from each loci.There was high linkage disequilibrium between the rs833061 and rs699947 SNP loci.Six haplotypes were observed，while the frequency of C-G-T-C，C-G-T-G，A-A-C-G and A-G-C-G were more than 10%，which were the main haplotypes.The discrimination probabilities（DP）of rs699947，rs833061，and rs2010963 loci were between 0.583 and 0.634，with the power of exclusion （PE）between 0.133 and 0.144.The DP and PE of haplotypes of 4 SNP were 0.868 and 0.438，respectively.Conclusion There are great polymorphisms in the 5′region of VEGF gene in Han population in Guangdong，which could be used as genetic indexes for individual identification and paternity testing，as well as association analysis of the related diseases.

forensic genetics；polymorphism，single nucleotide；vascular endothelial growth factor；Han nationality

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.04.005

1004-5619（2016）04-0257-04

上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題資助項(xiàng)目（KF1305）；廣東省省級科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B022000023）

何文智（1977—），男，壯族，碩士，主要從事法醫(yī)物證鑒定及DNA多態(tài)性研究：E-mail：hewz2000@163.com

黎青，女，博士，主任法醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)物證學(xué)鑒定和研究；E-mail：81292522@163.com

2015-03-13）