呂葉輝，馬開軍，李志宏，顧　峻，鮑建瑛，楊智昉，高　靜，曾　顏，陶　麗，陳　龍（．上海健康醫(yī)學院，上海 08；．上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學現(xiàn)場應用技術(shù)公安部重點實驗室 上海市現(xiàn)場物證重點實驗室，上海 0008；．復旦大學基礎(chǔ)醫(yī)學院法醫(yī)學系，上海 000）

人體腦組織RNA表達水平與早期PMI的相關(guān)性

呂葉輝1，馬開軍2，李志宏1，顧峻1，鮑建瑛1，楊智昉1，高靜1，曾顏3，陶麗3，陳龍3
（1．上海健康醫(yī)學院，上海 201318；2．上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學現(xiàn)場應用技術(shù)公安部重點實驗室 上海市現(xiàn)場物證重點實驗室，上海 200083；3．復旦大學基礎(chǔ)醫(yī)學院法醫(yī)學系，上海 200032）

目的 探討人體腦組織多種RNA指標的表達水平與早期死亡時間（PMI）的相關(guān)性。方法 選取12例已知PMI（4.3～22.5h）的個體，提取腦組織總RNA。選取8種常用RNA指標（β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA、5S rRNA、U6 snRNA、miRNA-9、miRNA-125b），通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測其在腦組織中的表達水平。運用geNorm軟件篩選早期PMI表達穩(wěn)定的內(nèi)參指標，并分析其表達水平與相關(guān)因素（年齡、性別、死亡原因）的關(guān)系。運用R軟件將內(nèi)參標準化的RNA指標代入前期研究建立的數(shù)學模型推斷PMI，計算推斷PMI的誤差率以驗證模型精確性。結(jié)果 5S rRNA、miRNA-9和miRNA-125b表達穩(wěn)定，其表達水平與年齡、性別、死亡原因無關(guān)。利用β-actin推斷PMI的誤差率為24.6%，GAPDH為41.0%。結(jié)論 5S rRNA、miRNA-9和miRNA-125b在死亡早期表達穩(wěn)定，適合作為人體腦組織的內(nèi)參指標。β-actin表達水平與PMI相關(guān)性良好，有望成為推測早期PMI的輔助指標。

法醫(yī)病理學；RNA；腦；死亡時間；實時熒光定量PCR

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，運用RNA時序性降解規(guī)律推斷PMI逐漸成為研究熱點。國內(nèi)外學者在研究中發(fā)現(xiàn)RNA并非想象中那樣脆弱，可以通過測定某些管家基因mRNA含量變化推斷PMI，如β-肌動蛋白（β-actin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）等［1］，但針對早期PMI的研究相對較少。作為快速高效的RNA定量技術(shù)，實時熒光定量PCR技術(shù)在PMI推斷的研究領(lǐng)域得到越來越多的應用。但由于該方法得到的結(jié)果必須依賴于內(nèi)參指標的標準化處理，尋找穩(wěn)定、適用的內(nèi)參指標十分必要。

由于人體死亡后不同個體間存在諸如溫度、濕度、死亡原因等內(nèi)外因素的干擾，無法進行系統(tǒng)規(guī)律的研究，通過動物模型對研究人體死亡后體內(nèi)RNA降解變化規(guī)律有著重要的參考價值。筆者在前期研究［2］中已經(jīng)建立了大鼠腦組織多溫度、多RNA指標的數(shù)學模型推斷早期PMI，但還需要人體樣本進一步驗證。

本研究收集已知PMI的人體樣本，通過實時熒光定量PCR技術(shù)對死亡早期人體腦組織各RNA指標轉(zhuǎn)錄水平進行檢測，篩選表達穩(wěn)定的內(nèi)參指標，并將內(nèi)參標準化的RNA指標代入數(shù)學模型進行驗證，以期探討運用該方法推斷PMI的準確性和有效性。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器：9700型PCR擴增儀、Prism?7500型熒光定量PCR儀（美國AB公司），NanoDrop 1000分光光度計（美國Thermo公司），Agilent 2100生物分析儀（美國Agilent公司）。

試劑：TRIzol試劑盒（美國 Invitrogen公司），RNAlater保護液、PrimeScriptTMRT reagent試劑盒、One Step PrimeScript?miRNA cDNA Synthesis試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TaKaRa公司），DEPC水（焦碳酸二乙酯處理并經(jīng)高溫高壓滅菌的MiliQ純水）。

1.2樣本

選取12例上海市公安局物證鑒定中心的檢案案例，每例均有準確的卷宗記錄，包括性別、年齡、環(huán)境平均溫度、死亡原因、PMI等，詳見表1。死者尸體沒有呈現(xiàn)肉眼可見的腐敗現(xiàn)象，尸體解剖前沒有經(jīng)過冰凍和解凍過程。解剖時取額葉腦組織50～100mg，用無菌眼科剪剪碎后分裝于RNAlater保護液中，立即置于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1　12例人體樣本詳細信息

1.3指標選擇

本研究選擇 8種 RNA指標，分別為 β-actin、GAPDH、核糖體蛋白 S29（ribosomal protein S29，RPS29）、18S核糖體RNA（18S ribosomal RNA，18S rRNA）、5S核糖體RNA（5S ribosomal RNA，5S rRNA）、U6微核RNA（U6 small nuclear RNA，U6 snRNA）、微小RNA-9（microRNA-9，miR-9）及微小RNA-125b （microRNA-125b，miR-125b）。引物設(shè)計至少跨一個外顯子或外顯子區(qū)域以保證cDNA正確的合成與擴增，擴增產(chǎn)物片段長度均在200bp以下。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表2。

表2　實驗選取的RNA指標及引物序列

1.4總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

準確稱取腦組織質(zhì)量，按照TRIzol試劑盒總RNA提取說明書提取總RNA，加入30μL DEPC水溶解后置于-80℃凍存。NanoDrop 1000分光光度計測定RNA的純度及濃度。Agilent 2100生物分析儀測定RNA完整性。應用PrimeScriptTMRT reagent試劑盒對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，以用于β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA的實時熒光定量PCR。應用One Step Prime-Script?miRNA cDNA Synthesis試劑盒對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，以用于5S rRNA、U6 snRNA、miR-9、miR-125b的實時熒光定量PCR。

1.5實時熒光定量PCR

應用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進行實時熒光定量PCR反應。按照試劑盒說明書配制20 μL反應體系，并應用Prism?7500型熒光定量PCR儀進行擴增。擴增條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。每個樣本重復3次，結(jié)果由系統(tǒng)自動生成，從而得到各個RNA指標的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct值）。

1.6統(tǒng)計學分析

1.6.1內(nèi)參選擇及穩(wěn)定性評估

運用geNorm v3.5軟件（比利時Biogazelle公司）對RNA指標的Ct值進行統(tǒng)計學處理［3］。根據(jù)平均表達穩(wěn)定度M值確定最穩(wěn)定的指標，M值越小，指標的穩(wěn)定性越高。根據(jù)標準化因子的配對變異V值判斷引入新的內(nèi)參指標是否會對標準化因子產(chǎn)生顯著影響，默認V值為0.15，如果Vn/Vn+1（n＞1）小于0.15（當多個V值符合時選取最小值），說明n或n+1個RNA指標可以作為內(nèi)參指標使用。

運用SPSS v22.0軟件分析內(nèi)參指標表達水平與性別、年齡、死亡原因之間的關(guān)系，檢驗方法分別采用t檢驗、Pearson相關(guān)分析和Kruskal-Wallis檢驗。檢驗水準α=0.05。

除內(nèi)參指標外，其余RNA指標作為候選指標。

1.6.2PMI推斷及數(shù)學模型驗證

運用SPSS v22.0軟件對候選RNA指標Ct值進行內(nèi)參標準化（ΔCt=Ct候選指標-Ct內(nèi)參均值），內(nèi)參均值為內(nèi)參指標的幾何平均數(shù)，并對各候選指標ΔCt值及PMI進行三次方回歸分析并計算相關(guān)系數(shù)r。檢驗水準α=0.01。

本課題組在前期研究［2］中已經(jīng)建立了大鼠腦組織死后24 h內(nèi)的三元（ΔCt值、溫度、PMI）二次數(shù)學模型推斷PMI。本研究運用R v3.2.3軟件（美國RStudio公司）將人體樣本數(shù)據(jù)代入已建模型推斷PMI，并計算PMI推斷和PMI實際之間的差異程度，用誤差率表示，誤差率=|PMI推斷-PMI實際|/PMI實際×100%。

2　結(jié)　果

2.1內(nèi)參選擇及穩(wěn)定性評估

所有人體樣本抽提的RNA均成功擴增，引物特異性高。經(jīng)geNorm v3.5軟件處理后，得到各RNA指標的平均表達穩(wěn)定度 M值：β-actin＞GAPDH＞18S rRNA＞RPS29＞U6 snRNA＞5S rRNA＞miR-9=miR-125b；標準化因子的配對變異Vn/Vn+1值：V2/V3=0.082，V3/V4=0.095，V4/V5=0.087，V5/V6=0.112，V6/V7=0.137，V7/V8=0.153。結(jié)果表明，miR-9和miR-125b最為穩(wěn)定，而β-actin最不穩(wěn)定；V2/V3小于0.15且最小，即選擇2個或3個RNA指標作為內(nèi)參最為合適。為和前期研究結(jié)果保持一致，本研究選取3個RNA指標作為內(nèi)參指標，即5S rRNA、miR-9和miR-125b。

分別采用t檢驗、Pearson相關(guān)分析和Kruskal-Wallis檢驗，分析5S rRNA、miR-9和miR-125b平均表達水平與性別、年齡及死亡原因之間的關(guān)系。結(jié)果表明，在死亡早期人腦組織中，三種指標的表達水平是穩(wěn)定的，不受性別影響，男女表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；上述指標表達水平與年齡之間無相關(guān)性（r=0.2102，P＞0.05），排除了年齡因素的影響；上述指標在不同死亡原因中表達水平差異也無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。綜合分析，在死亡早期，5S rRNA、miR-9 和miR-125b的表達水平不受性別、年齡和死亡原因的影響。

2.2PMI推斷及數(shù)學模型驗證

對候選RNA指標Ct值進行內(nèi)參標準化處理并分析其與PMI的相關(guān)性。相關(guān)系數(shù)r分別為：β-actin，0.837 2（P＜0.01）；GAPDH，0.683 1（P＜0.01）；18S rRNA，0.472 5（P＞0.01），RPS29，0.403 6（P＞0.01）；U6 snRNA，0.2036（P＞0.01）。經(jīng)內(nèi)參標準化后，人體腦組織中βactin與PMI的相關(guān)性最好，GAPDH次之，其余RNA指標與PMI相關(guān)性無統(tǒng)計學意義。

運用R v3.2.3軟件分別將已知ΔCt值及溫度分別代入已建的β-actin、GAPDH模型［2］進行驗證，分別得到β-actin和GAPDH的PMI推斷值，推斷值范圍設(shè)定為［0，24］，并計算推斷PMI與實際PMI的誤差率，結(jié)果見表3。

對于所有樣本，運用β-actin模型推斷PMI的總誤差率為24.6%，GAPDH為41.0%。對于1～6號案例（PMI實際在0～12h），運用β-actin模型推斷PMI的平均誤差率為35.2%，GAPDH為48.9%。對于7～12號案例（PMI實際在12～24h），運用β-actin模型推斷PMI的平均誤差率為14.1%，GAPDH為33.1%。與GAPDH比較，運用β-actin模型推斷PMI誤差率相對較低。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)GAPDH推斷PMI的誤差率與案例樣本的死亡原因有關(guān)，失血性休克死亡樣本誤差率為43.8%，機械性窒息死亡樣本誤差率為44.5%，兩者之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.01），但均大于顱腦損傷死亡樣本誤差率（32.0%，P＜0.01）。

表3　利用數(shù)學模型推斷樣本PMI

3　討　論

PMI的推斷一直是法醫(yī)學領(lǐng)域重要且復雜的課題，其推斷方法多種多樣，近年來應用實時熒光定量PCR技術(shù)測定RNA表達水平推斷PMI已成為研究熱點［4］。由于人體死亡后不同個體間存在諸如年齡、性別、溫度、死亡原因等內(nèi)外因素的干擾，直接進行人體資料的研究缺乏可行性。在動物實驗中，組織易于獲取和保存，實驗條件（如溫度、PMI等）可控，建立的方程可信度較高，因此建立動物模型研究RNA降解變化規(guī)律對于人體PMI推斷有著重要的參考價值。本課題組在前期研究［2］中已經(jīng)建立了大鼠腦組織24 h內(nèi)多溫度、多RNA指標的數(shù)學模型推斷早期PMI，但缺乏人體樣本的進一步驗證。為了證實該方法的可行性及準確性，本研究收集已知PMI的人體樣本，探討人體腦組織中多種RNA含量與早期PMI的相關(guān)性。

為了將人體樣本和動物樣本數(shù)據(jù)有效統(tǒng)一，盡可能消除大鼠與人體組織種屬差異的影響，本研究所選用的RNA指標均具有良好的保守性與穩(wěn)定性。βactin和GAPDH是常用的管家基因，廣泛存在于所有細胞中，高度穩(wěn)定保守［5-6］；RPS29屬于核糖體蛋白家族，用于編碼40S亞基的核糖體蛋白，在不同的細胞系中擁有良好的穩(wěn)定性，是一類廣泛存在的基因［7］；18S rRNA和5S rRNA是核糖體RNA，其突變速率相對恒定，而且進化過程相對緩慢，其保守區(qū)常用于構(gòu)建生命的統(tǒng)一進化樹，在不同物種間具有很高的保守性［8］；U6 snRNA是核內(nèi)小RNA，參與真核生物細胞核中RNA的加工，在一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)上都高度保守［9］；miRNA也是真核生物中廣泛存在的小分子RNA，可調(diào)節(jié)其他基因的表達，并在不同物種間有著較好的連續(xù)性和保守型，也常用于研究物種的進化規(guī)律［10］。此外，本研究中人體RNA引物設(shè)計位置和序列與前期研究大鼠引物盡量一致，其擴增產(chǎn)物片段的大小和序列也盡量保持一致，進一步消除種屬差異的影響。

除此之外，實時熒光定量PCR結(jié)果的準確性很大程度上取決于內(nèi)參指標的標準化。選取穩(wěn)定的內(nèi)參指標可以排除個體差異帶來的誤差，使統(tǒng)計結(jié)果更加客觀、準確。對于人體樣本，找到合適的內(nèi)參指標對于RNA表達水平的準確定量至關(guān)重要。經(jīng)geNorm軟件統(tǒng)計分析，5S rRNA、miR-9和miR-125b具有最好的穩(wěn)定性。為了排除相關(guān)參數(shù)（如性別、年齡及死亡原因等）對候選RNA表達的影響，本研究還做了進一步的研究，以確定所選的三個內(nèi)參是否可作為穩(wěn)定可靠的內(nèi)參指標應用于PMI推斷研究。結(jié)果顯示三個內(nèi)參指標的表達水平與上述參數(shù)無明顯的相關(guān)性，表明5S rRNA、miR-9和miR-125b適合作為內(nèi)參指標，其表達不易受內(nèi)外因素的影響，在死亡早期腦組織中表達穩(wěn)定。

篩選出內(nèi)參指標后，對其余候選RNA指標進行標準化處理，并計算各RNA表達水平與PMI的關(guān)系。結(jié)果表明β-actin相關(guān)系數(shù)最高，GAPDH次之，表明這兩個指標更易受PMI的影響，與前期研究［2］結(jié)果一致。分別將標準化后的β-actin和GAPDH代入相應數(shù)學模型，進行PMI推斷。結(jié)果表明，在12個人體樣本中，運用β-actin模型推斷PMI的總誤差率為24.6%，運用GAPDH模型推斷PMI的總誤差率為41.0%，分別高于前期研究中動物樣本的14.1%和22.2%。對于GAPDH，在進行人體樣本PMI推斷時其誤差率較高，且在失血性休克死亡和機械性窒息死亡樣本中誤差率明顯高于顱腦損傷樣本，表明GAPDH可能受死亡原因影響。GAPDH是常用的RNA指標，性質(zhì)相對穩(wěn)定保守，但也有研究［11］表明，GAPDH在特定環(huán)境中（如缺氧情況下）表達水平發(fā)生改變。Koppelkamm等［6］報道GAPDH表達水平在窒息死亡樣本中高于顱腦損傷死亡樣本。Yamanaka等［12］發(fā)現(xiàn)在人皮膚成纖維細胞中，GAPDH在缺氧情況下表達上調(diào)而β-actin保持不變。本研究中GAPDH誤差率較高可能是由于GAPDH在失血性休克和機械性窒息樣本中表達上調(diào)，ΔCt值變小，以致誤差率升高。對于β-actin，在動物樣本和人體樣本中其誤差率都相對較低，推測是由于其表達水平不受死亡原因的影響，與PMI的相關(guān)性更好，表明利用β-actin進行PMI推斷相對準確。研究還發(fā)現(xiàn)PMI在12～24 h的人體樣本推斷誤差率明顯小于PMI在0～12 h的樣本，推測是由于隨PMI延長RNA降解速率加快，ΔCt增加明顯所致。因此，對于更早期的PMI推斷還需篩選時序性降解更敏感的RNA指標做進一步研究。

本研究利用實時熒光定量PCR技術(shù)研究人體腦組織8種RNA指標在死亡早期的降解規(guī)律。實驗結(jié)果表明5S rRNA、miR-9和miR-125b在人體樣本中表達穩(wěn)定，其表達水平與年齡、性別、死亡原因無關(guān)，適合作為PMI推斷的內(nèi)參指標。經(jīng)內(nèi)參標準化處理后，分別將β-actin和GAPDH代入前期研究中建立的數(shù)學模型進行PMI推斷，推斷誤差率分別為24.6% 和41.0%。GAPDH推斷誤差率較高，推測是特定RNA表達受死亡原因影響所致。β-actin表達水平與PMI相關(guān)性良好，推斷誤差率也相對較低，證實運用該方法推斷人體樣本早期PMI相對準確有效。本課題將繼續(xù)收集人體組織進行大樣本驗證，以期優(yōu)化數(shù)學模型，提升推斷精確度，以符合實際檢案的需要。

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（本文編輯：鄒冬華）

Correlation between RNA Expression Level and Early PMI in Human Brain Tissue

Lü Ye-hui1，MA Kai-jun2，LI Zhi-hong1，GU Jun1，BAO Jian-ying1，YANG Zhi-fang1，GAO Jing1，ZENG Yan3，TAO Li3，CHEN Long3
（1.Shanghai University of Medicine&Health Science，Shanghai 201318，China；2.Shanghai Key Laboratory of Crime Scene Evidence，Key Laboratory of Forensic Evidence and Science Technology，Ministry of Public Security，Institute of Forensic Science，Shanghai Public Security Bureau，Shanghai 200083，China；3.Department of Forensic Medicine，School of Basic Medical Science，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China）

Objective To explore the correlation between the expression levels of several RNA markers in human brain tissue and early postmortem interval（PMI）.Methods Twelve individuals with known PMI （range from 4.3 to 22.5 h）were selected and total RNA was extracted from brain tissue.Eight commonly used RNA markers were chosen including β-actin，GAPDH，RPS29，18S rRNA，5S rRNA，U6 snRNA，miRNA-9 and miRNA-125b，and the expression levels were detected in brain tissue by realtime fluorescent quantitative PCR.The internal reference markers with stable expression in early PMI were screened using geNorm software and the relationship between its expression level and some relevant factors such as age，gender and cause of death were analyzed.RNA markers normalized by internal reference were inserted into the mathematic model established by previous research for PMI estimation using R software.Model quality was judged by the error rate calculated with estimated PMI.Results 5S rRNA，miRNA-9 and miRNA-125b showed quite stable expression and their expression levels had no relation with age，gender and cause of death.The error rate of estimated PMI using β-actin was 24.6%，while GAPDH was 41.0%.Conclusion 5S rRNA，miRNA-9 and miRNA-125b are suitable as internal reference markers of human brain tissue owing to their stable expression in early PMI.The expression level of βactin correlates well with PMI，which can be used as an additional index for early PMI estimation.

forensic pathology；RNA；brain；postmortem interval；real-time fluorescent quantitative PCR

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.04.002

1004-5619（2016）04-0245-05

國家自然科學基金面上資助項目（81373242、81671863）；上海健康醫(yī)學院種子基金項目；上海高校青年教師培養(yǎng)資助計劃

呂葉輝（1989—），男，博士研究生，主要從事基礎(chǔ)醫(yī)學及法醫(yī)學教學、科研工作；E-mail：yeyeliushu@163.com

陳龍，男，博士，主任法醫(yī)師，副教授，主要從事法醫(yī)病理學及法醫(yī)臨床學研究；E-mail：chenlong@shmu.edu.cn

2016-03-28）