劉 萍　馬全英　宋玉霞　劉學榮　牟克斌　王超英　董金杰（中農(nóng)威特生物科技股份有限公司　甘肅 蘭州　730046）

DAPI染色法在檢測BHK-21細胞周期的應用

劉 萍馬全英宋玉霞劉學榮牟克斌王超英董金杰*
（中農(nóng)威特生物科技股份有限公司甘肅 蘭州730046）

為建立一種檢測細胞周期的方法，取懸浮培養(yǎng)的BHK-21細胞按照4，6-聯(lián)脒-2苯基吲哚（DAPI） 染色方法進行染色，利用NC-3000細胞分析儀進行細胞周期分析。結(jié)果表明，DAPI標記法簡單易行，DAPI標記法能夠準確的進行細胞周期檢測。

DAPI染色法細胞周期流式細胞技術(shù)

細胞周期分析，對反映一個細胞群體的增殖活性具有重要意義，利用流式細胞術(shù)進行DNA含量測定是細胞周期分析的重要手段，直到目前仍然是廣泛使用的方法之一，應用細胞流式技術(shù)進行細胞周期檢測，其結(jié)果不僅受樣品固有性、樣品的處理方法及熒光染色的影響，還受分析方法的影響目前，用于檢測細胞周期的染料種類較多，其中碘化丙啶（PI）是常用染料，但嵌入到雙鏈DNA 和RNA 的堿基對中與之結(jié)合，無堿基特異性，故染色前必須用核糖核酸酶A處理細胞，排除雙鏈RNA的干擾［1-2］。4，6-聯(lián)脒-2苯基吲哚（DAPI）是DNA特異性的熒光染料，與DNA結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在A-T堿基區(qū)，使用時無需用RnaseA處理細胞， 但由于配置紫外激光源的流式細胞儀非常昂貴，大多數(shù)實驗室都沒有配備。因此，以DAPI 標記DNA 分析細胞周期的方法尚未成為常規(guī)檢測方法被普遍采納，也沒有簡單的標準實驗流程可供參考［3-4］。

本試驗擬采用DAPI標記BHK-21細胞以探索簡便易行的DNA 檢測技術(shù)，檢測細胞周期中各期的DNA 含量，以便及時預測規(guī)模化培養(yǎng)細胞培養(yǎng)細胞增殖活性的情況，為規(guī)?；毎囵B(yǎng)的檢測奠定基礎。

1　材料與方法

1.1儀器及試劑NucleoCounter NC-3000自動化全光譜定量細胞成像分析儀，DAPI試劑盒均為chemometec公司產(chǎn)品，細胞計數(shù)儀為INNOVATIS產(chǎn)品，懸浮培養(yǎng)細胞BHK-21為中農(nóng)威特生物科技股份有限公司馴化并保存。

1.2樣品的制備將生長狀態(tài)良好的BHK-21細胞進行傳代批式培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的細胞，以4x105個/ml的密度接種于含200ml培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)三角瓶中，與37℃，150r/min培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，分別在24、48、60h對細胞取樣，并進行細胞形態(tài)觀察、細胞濃度和細胞活力檢測。將樣品用PBS洗2次，1000r/min離心5min，棄上清液。用冰凍的70%無水乙醇固定，放4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3染色與上機檢測將處理好的細胞樣品，每份懸浮于0.5ml DAPI染色液中，37℃避光染色5min，取適量染色后的細胞樣加入到NC-Slide A8的檢測室中，將上樣后的NC-Slide A8放置于NC3000主機的托盤中，進行上機檢測。

2　結(jié)果

2.1細胞形態(tài)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，大多數(shù)細胞散在分布，單個細胞透亮，邊緣光滑，形態(tài)長良好。

2.2細胞生長濃度與活性在起始濃度為4x105個/ml，經(jīng)過一段時間培養(yǎng)，0～48h檢測結(jié)果細胞密度逐漸呈上升趨勢，48h后繼續(xù)培養(yǎng)，細胞濃度逐漸呈下降趨勢；細胞活力先有所增加，達到最大值呈下降趨勢，直至細胞大部分死亡（見圖1、2）。

圖1　批式培養(yǎng)BHK-21細胞濃度變化

圖2　批式培養(yǎng)BHK-21細胞活性變化

2.2細胞周期分析上述經(jīng)DAPI染色后的BHK-21細胞上機進行檢測，經(jīng)NC-3000系統(tǒng)對細胞進行細胞周期分析，結(jié)果48h以前，S期和G2/M期的DNA含量總數(shù)呈上升趨勢，大部分細胞逐進入DNA合成期，培養(yǎng)48h后，S期和G2/M期的DNA含量總數(shù)明顯呈下降趨勢（見圖3）。

圖3　BHK-21細胞培養(yǎng)0-72h細胞周期DNA含量變化

3　討論

（1）細胞濃度與細胞活力都是監(jiān)測細胞質(zhì)量好壞的重要指標［5］。本試驗細胞周期檢測結(jié)果表明，在細胞培養(yǎng)到48h，細胞S期和G2/M期含量逐漸呈上升趨勢并達到最高，同時這一培養(yǎng)時間內(nèi)細胞密度也達到最大值，且細胞活力高達95%以上，兩者的檢測結(jié)果一致。試驗結(jié)果表明細胞培養(yǎng)開始階段，培養(yǎng)液中營養(yǎng)豐富，細胞在較低密度下生長，代謝活躍，大部分處在G0/G1期，為下一階段DNA 合成S期貯備足夠營養(yǎng)物質(zhì)和能量，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞逐漸向DNA合成期過渡，完成DNA合成，最后進入G2/M，細胞開始分裂增殖。試驗中，細胞生長到72h，大部分細胞被阻滯在G0/G1期，此期細胞明顯增多，細胞不能在增殖，表明隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)大量被消耗，同時細胞代謝產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，這些因素都嚴重影響細胞的生長［6-7］。因此檢測細胞周期可預測下一個階段細胞生長趨勢與增值情況，為規(guī)膜化細胞培養(yǎng)提共理論參考。（2）細胞周期染色方法很多，本實驗以探討了DAPI標記BHK-21細胞，結(jié)果表明，DAPI是一種可靠的DNA檢測方法，并且其樣本制備更簡單、易行。這種染料可做為帶紫外激光器的分選儀上檢測DNA的最佳選擇。雖然PI的DNA染色效果好，適用于普通流式細胞儀上檢測（488 nm激發(fā)），但由于其具有毒性，污染后不易清除，且不能標記活體細胞等局限性，因此，不適用于在分選儀上檢測［8-9］。（3）本試驗借助NC-3000自動化全光譜定量細胞成像分析儀所建立的DAPI染色法簡單易行，不必加通透劑，也不分離核，是一種適用于多參數(shù)分析的檢測細胞DNA含量的方法，而且實驗流程更簡單、快速，可做為具備紫外激光器的流式細胞儀上首選的DNA熒光染料。能夠準確的檢測細胞周期，為規(guī)模化細胞培養(yǎng)過程中監(jiān)控細胞生長狀態(tài)提供一種良好的檢測方法。

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S818.9

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1007-1733（2016）08-0010-02

甘肅省科技計劃資助（1008FCCA006）

2016-04-21）