王 強(qiáng)　（山東省泰安市岱岳區(qū)山口鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站　271038）霍 偉?。ㄉ綎|省泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局）任元?jiǎng)偂。ㄉ綎|省濟(jì)南市商河縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園管理委員會(huì)）

新城疫病毒對(duì)雞內(nèi)臟病理?yè)p傷的研究

王 強(qiáng)（山東省泰安市岱岳區(qū)山口鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站271038）
霍 偉（山東省泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局）
任元?jiǎng)偅ㄉ綎|省濟(jì)南市商河縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園管理委員會(huì)）

本試驗(yàn)利用病理石蠟切片技術(shù)研究新城疫病雞的免疫器官的組織病理學(xué)變化，探討新城疫病毒對(duì)雞心臟，肝臟和腸的損傷機(jī)理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，光鏡下的病理主要表現(xiàn)在腸、胸腺、脾臟、胰臟、盲腸扁桃體等，以消化道的出血性炎癥為主，黏膜層淋巴細(xì)胞增多，部分上皮細(xì)胞壞死、出血。

雞新城疫心臟肝臟腸光鏡觀察

新城疫（Newcastle Disease，ND）在1929年發(fā)生于印度尼西亞的爪哇［1］，同年發(fā)現(xiàn)英國(guó)的新城［2］，根據(jù)發(fā)現(xiàn)地而命名為新城疫。自從1945年我國(guó)開(kāi)始報(bào)道新城疫［3］到現(xiàn)在，凡是我國(guó)養(yǎng)雞的地方就有新城疫不同程度的流行，造對(duì)養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展成影響。隨著細(xì)胞和分子生物技術(shù)的發(fā)展，組織制片技術(shù)也為原位顯示細(xì)胞內(nèi)的基因和基因表達(dá)提供了基礎(chǔ)。做好的標(biāo)本能保存較長(zhǎng)時(shí)間，使用方便。組織制片技術(shù)在醫(yī)學(xué)教育研究中被廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)利用病理石蠟切片技術(shù)研究新城疫病雞的免疫器官的組織病理學(xué)變化，探討新城疫病毒對(duì)雞心臟，肝臟和腸的損傷機(jī)理。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1材料新城疫病雞。

1.1.2器材切片刀、切片機(jī)、恒溫箱、電爐、酒精燈、手術(shù)刀、解剖剪、解剖盤(pán)、鑷子、單面刀片、包埋紙盒、染色缸、蓋玻片、載玻片、玻片盤(pán)、樹(shù)膠、顯微鏡、水浴鍋。

1.1.3主要試劑2×PBS緩沖液：1%SDS，20mMTris-HCL （pH 7.6），0.2M NaCL，固體石蠟，蒸餾水，無(wú)水乙醇，二甲苯，甲醛，氯化鈉，氯化鉀，磷酸一氫鈉，磷酸二氫鉀，蘇木素、伊紅等。

1.1.4主要病理材料心臟，肝臟，腸。

1.2方法

1.2.1取樣（1）把病雞解剖，取心肌，肝臟和腸置于10%中性福爾馬林溶液。（2）固定：選用甲醛來(lái)作為固定液，取心肌和肝臟合腸固定于10%中性福爾馬林溶液，使組織發(fā)生硬化。固定時(shí)間為24h。（3）沖洗：將在固定過(guò)程中殘留于組織塊中的甲醛充分除去利用流水對(duì)組織塊進(jìn)行沖洗，連續(xù)沖洗24h。（4）脫水：從30%或50%酒精開(kāi)始，經(jīng)70%、85%、95%直至純酒精（無(wú)水乙醇），每次時(shí)間為30～90min，以2次95%酒精，2次100%酒精重復(fù)進(jìn)行脫水，以保證組織的水分脫凈。（5）透明：經(jīng)純酒精和透明劑各半的混合液浸漬1～2h，再轉(zhuǎn)入純透明劑中浸漬。在透明之前利用乙醇和二甲苯1∶1的混合溶液浸泡組織塊30min，共2次，然后再用二甲苯透明5～20min。（6）浸蠟：在60℃恒溫箱內(nèi)進(jìn)行，將已經(jīng)透明的組織塊置于已經(jīng)融化的石蠟燒杯中，放在60℃的恒溫箱中，2h左右后取出倒入另一只含有融化的石蠟燒杯中2h。浸蠟完畢后便可包埋。（7）包埋：包埋時(shí)在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行，倒入包埋盒的蠟在恒溫箱內(nèi)放0.5h后取出自然冷卻，可以有效的避免蠟塊分層。（8）修塊：將已經(jīng)包埋的組織塊修理成合適的大小便于儲(chǔ)存和切片。

1.2.2切片用切片機(jī)將已經(jīng)包埋好的石蠟組織塊進(jìn)行切片，切片厚度為5μm。切好的石蠟切片放入水浴鍋中（水溫為37）℃使其平展，再用載玻片從切片下方將切片置于在玻片上，并于50℃恒溫箱中烘干4h。

1.2.3染色和封片用HE染色法進(jìn)行染色。

表1　試驗(yàn)采取的脫水時(shí)間　　　　　　　 （min）

表2　試驗(yàn)采取的透明時(shí)間　　　　　　?。╩in）

2　結(jié)果與分析

2.1剖檢癥狀

剪開(kāi)嘴發(fā)現(xiàn)口腔內(nèi)積有大量灰白色粘液；嗦囊空虛但是囊內(nèi)有較多量液體或帶有酸臭味的液體；消化道里可見(jiàn)到食道與腺胃的交界處有出血點(diǎn)，腺胃與肌胃交界處有出血點(diǎn)、條或斑；腺胃乳頭出血，肌胃角質(zhì)層下面可見(jiàn)到出血或潰瘍。腸道的漿面可見(jiàn)多處呈棗核狀紫紅色出血，剪開(kāi)腸管在腸黏膜表面見(jiàn)到棗核狀出血、壞死；盲腸扁桃體腫大、出血、壞死和潰瘍；直腸及泄殖腔、黏膜出血點(diǎn)或條狀出血。心冠和腹部脂肪出血。

2.2腸道病理變化

腸內(nèi)形成大潰瘍，腸壁深部的集合淋巴濾泡壞死，最初淋巴細(xì)胞腫大，胞漿淡染，與相鄰的細(xì)胞融合，同時(shí)核也增大，色淡，進(jìn)一步這些細(xì)胞細(xì)胞輪廓模糊，變?yōu)榉奂t濃染不均勻的塊狀物，其中散在的核的殘屑，以后壞死的淋巴濾泡與周?chē)膲乃澜M織融為一體，壞死部小動(dòng)脈和靜脈管壁發(fā)生纖維素樣壞死，血栓形成和血管破裂引起該部的嚴(yán)重出血與血漿浸潤(rùn)，使壞死組織中出現(xiàn)大量的紅細(xì)胞和血漿凝結(jié)物。黏膜上皮變性、壞死、并大量脫落。固有膜中有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，以及漿液滲出、充血和出血等病變。

2.3心肌的病理變化

心肌顆粒變性，光鏡下細(xì)胞腫大，胞漿內(nèi)出現(xiàn)多量微細(xì)顆粒，HE染色成淡紅色，胞核無(wú)明顯的變化，間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)滲出性變化，毛細(xì)血管充血、出血、個(gè)別部位可見(jiàn)心肌纖維出現(xiàn)明顯斷裂，局部有輕微的小灶狀出血等急性病理變化。

2.4肝臟的病理變化

主要表現(xiàn)肝小葉中的肝細(xì)胞可見(jiàn)體積腫大，胞漿內(nèi)密布細(xì)小紅染的顆粒。視野中肝細(xì)胞出現(xiàn)胞核略微腫大，淡染。有的胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂肪空泡，較嚴(yán)重時(shí)形成一個(gè)大空泡，將胞核擠向一側(cè)。新城疫，肝臟的病理變化主要表現(xiàn)為變性，顆粒變性和脂肪變性。

3　結(jié)論

新城疫病毒為細(xì)胞外播散，主要入侵呼吸道和消化道的上皮細(xì)胞，表現(xiàn)出高度的殺細(xì)胞作用。病毒感染還能引起炎癥反應(yīng)導(dǎo)致局部組織損傷。本試驗(yàn)光鏡下的病理主要表現(xiàn)心、肝、腸等，部分上皮細(xì)胞壞死、出血，這些病變主要是由于病毒直接作用和機(jī)體抗病毒反應(yīng)所導(dǎo)致的損傷。心肌顆粒變性，肝臟的病理變化主要表現(xiàn)為變性，顆粒變性和脂肪變性，由于新城疫病毒主要侵害呼吸道和腸道上皮細(xì)胞，加之腸相關(guān)淋巴組織豐富，因而出現(xiàn)的局部損傷相應(yīng)也較為嚴(yán)重。腸相關(guān)淋巴組織的陽(yáng)性染色最強(qiáng)，組織損傷最為嚴(yán)重，這與肉眼病變的嚴(yán)重程度相吻合。

［1］林紹儀. 雞新城疫研究進(jìn)展［J］. 國(guó)外獸醫(yī)學(xué)一畜禽傳染病， 1982（2）：41-43.

［2］殷震， 劉景華. 動(dòng)物病毒學(xué)［Ml. 北京： 科技出版社. 1997.

［3］梁英. 雞新城疫免疫膠體金診斷技術(shù)的研究［J］. 畜牧獸醫(yī)月刊，1945（5）： 10-12.

S852.65+9

A

1007-1733（2016）08-0013-02

2016-04-25）