刁非非　趙永峰　姜常青　韓鎧懌　謝之景*?。á偕綎|農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院　山東 泰安　271018　①山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室　山東 泰安）

水貂抗犬瘟熱病毒中和抗體滴度的測定

刁非非①①趙永峰①①姜常青①①韓鎧懌①①謝之景①①*（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院山東 泰安271018①山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室山東 泰安）

為了解當(dāng)前犬瘟熱疫苗及免疫程序的在水貂的免疫效果，該研究在6個水貂養(yǎng)殖場，隨機對CD疫苗免疫接種后55～60d的水貂進行心臟采血，共采集、制備84份血清。采用血清微量中和試驗，測定84份水貂血清中抗CDV的中和抗體滴度。結(jié)果表明，只有1份水貂血清中抗CDV的中和抗體滴度為94，占1.2%，其余83份血清樣品中的抗CDV中和抗體滴度小于10，達98.8%。

水貂犬瘟熱病毒中和抗體

當(dāng)前水貂CD疫苗免疫程序的免疫效果很差，這是造成在水貂養(yǎng)殖過程中CD流行的重要因素，因此研究制定科學(xué)水貂CD疫苗免疫接種程序成為當(dāng)務(wù)之急。犬瘟熱（Canine Distemper，CD）是由犬瘟熱病毒（Canine Distemper virus，CDV）引起犬科、鼬科、和浣熊科等動物的一種急性、高度接觸性傳染性疾?。?］。CDV是副粘病毒科麻疹病毒屬的成員，病毒粒子呈多形性，多數(shù)呈球形，直徑大多數(shù)在150～300nm之間，為負鏈單股不分節(jié)的RNA病毒，只有一個血清型。目前CDV自然感染的動物范圍在不斷擴大，除犬科外，人們又發(fā)現(xiàn)了許多CDV的新宿主，例如鼬科的雪貂、水貂，浣熊科的小熊貓、浣熊，貓科的貓、獅、孟加拉虎、豹，大熊貓科的大熊貓，偶蹄目豬科的豬，日本獼猴和人等。

CD在世界各地均有分布，所有養(yǎng)犬和經(jīng)濟動物的國家均有CD的發(fā)生。CD疫苗的應(yīng)用在一定程度上控制了CDV的流行［2，3］，但是在實際生產(chǎn)過程中仍有許多疑似CDV感染的病例。CD在我國廣泛存在，我國部分省市的皮毛動物特別是水貂飼養(yǎng)場不斷有CD病例的出現(xiàn)，給養(yǎng)殖戶造成很大的經(jīng)濟損失。造成免疫失敗的原因較多，但其確切原因尚不清楚，其中疫苗免疫效果不好是造成免疫失敗的一個重要原因。目前，有關(guān)CD疫苗免疫接種的效果尚不清楚，為此該研究對水貂血清中抗CDV中和抗體滴度進行了測定，為進一步研究科學(xué)的水貂CD疫苗接種程序提供了實驗數(shù)據(jù)。本研究具有重要的生產(chǎn)實踐意義。

1　材料和方法

1.1毒株與細胞CDV-M1本實驗室分離鑒定保存，MDCK細胞由遼寧出入境檢驗檢疫局胡傳偉研究員惠贈。

1.2血清樣品在諸城、東平、文登三地6個水貂養(yǎng)殖場，這6個水貂養(yǎng)殖場均對水貂進行了1次CD疫苗免疫接種，隨機對CD疫苗免疫接種后55～60d的水貂進行心臟采血，制備血清，共84份，置-20℃凍存，待檢。

1.3中和抗體效價的測定采用血清微量中和試驗測定水貂血清抗CDV中和抗體效價。采用固定病毒—稀釋血清法［4］，在96孔微量細胞培養(yǎng)板上進行。首先將血清樣品置56℃水浴30min，滅活血清中非特異性病毒抑制成分，隨后將血清樣品中加入終濃度為0.025%恩諾沙星，10000r/min離心10min，去除可能的細菌污染物。先將血清稀釋成1∶10，再作2倍連續(xù)稀釋（共8個稀釋度）。隨后分別加入等量含100TCID50的病毒懸液。經(jīng)25℃、2h感作后，分別加入96孔板，每個稀釋度加4孔，每孔加100ul。然后將分散并稀釋成2.5～3.0×106個/ml的MDCK細胞懸液加入96孔板，每孔加50ul，置5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)（37℃，60%～80%濕度）培養(yǎng)。同時設(shè)血清毒性對照，陰陽性血清對照，病毒對照及正常細胞對照。4d判定結(jié)果，以每孔完全不出現(xiàn)蜘蛛樣的融合性細胞病變作為中和陽性標(biāo)準(zhǔn)，以出現(xiàn)中和陽性的血清最高稀釋滴度為中和終點，按Reed-Muench法計算血清的中和抗體效價，以其倒數(shù)作為水貂血清中抗CDV中和抗體滴度。

2　結(jié)果

在84份水貂血清中，只有1份水貂血清中抗CDV的中和抗體滴度為94，占1.2%，其余83份血清樣品中的抗CDV中和抗體滴度小于10，達98.8%，見表1?？笴DV中和抗體滴度大于50，則動物對CDV具有很好的免疫抵抗力，在所檢測的水貂血清樣品中，疫苗免疫合格率僅為1.2%。這表明水貂血清中抗CDV的中和抗體滴度很低，水貂養(yǎng)殖企業(yè)所采用的CD免疫程序不合理，不能夠誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生很好的抗體水平。

表1　水貂抗CDV中和抗體滴度

3　討論

（1）山東省是水貂養(yǎng)殖大省，盡管CD疫苗的應(yīng)用在一定程度上控制了CDV在水貂的流行，但是近年來，在實際生產(chǎn)過程中CDV的發(fā)病率越來越高，有時呈地方流行，給我省水貂養(yǎng)殖業(yè)造成了很大的經(jīng)濟損失。造成免疫失敗的原因較多，但其確切原因尚不清楚。但是疫苗免疫效果不確實是造成免疫失敗的一個重要原因。（2）中和抗體是當(dāng)病原微生物侵入機體時會產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，是B淋巴細胞產(chǎn)生的適應(yīng)性免疫應(yīng)答細胞分泌的一種可溶性蛋白。病原微生物入侵細胞時需要依賴病原體自身表達的特定分子與細胞上的受體結(jié)合，才能感染細胞，并進一步擴增。中和抗體是在病毒進入細胞之前破壞病毒的，能夠與病原微生物表面的抗原結(jié)合，從而阻止該病原微生物黏附靶細胞受體，破壞病毒顆粒，防止侵入細胞。中和抗體是抗病毒免疫的主要因素，也是疫苗免疫效果的重要檢測指標(biāo)之一?？笴DV中和抗體對于水貂抵抗CDV的感染是十分重要的。為了了解水貂CD疫苗的免疫效果，該研究對水貂血清中的抗CDV中和抗體水平進行了檢測。（3）抗CDV中和抗體滴度大于50，則動物對CDV具有很好的免疫抵抗力，但檢測結(jié)果表明，水貂血清中抗CDV的中和抗體滴度很低，98.8%的水貂血清中抗CDV中和抗體滴度小于10，只有僅為1.2%的水貂血清中抗CDV中和抗體滴度大于50。這表明水貂養(yǎng)殖企業(yè)所采用的CD免疫程序不合理，不能夠誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生很好的抗體水平，這是造成CDV流行的重要因素。為此，應(yīng)加強水貂CD疫苗免疫程序的研究，減少因該病造成的經(jīng)濟損失。

［1］Gassen U， Collins FM， Duprex WP， et al. Establishment of a rescue system for canine distemper virus. J Virol 2000 Nov； 74（22）∶ 10737-44.

［2］Franke-V； Matern-B； Ackermann-O； et al.The prevention of distemper in zoo animals. Berl-Munch-Tierarztl-Wochenschr. 1989 Feb 1； 102（2）∶56-8.

［3］Tizard-I. Grease， anthraxgate， and kennel cough∶ a revisionist history of early veterinary vaccines. Adv-Vet-Med. 1999； 41∶ 7-24.

［4］楊篤寶， 雷留真， 謝之景等. 幼狐犬瘟熱母源抗體消長規(guī)律的測定［J］. 山東畜牧獸醫(yī). 2009， 8∶ 9-10

S852.65+5

A

1007-1733（2016）08-0012-02

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系特種經(jīng)濟動物產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-21-07）。

2016-05-11）