林佳揚(yáng),陳小藝,周愛(ài)蓮,方　婷

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002)

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響應(yīng)面法優(yōu)化ClO2溶液對(duì)牡蠣中沙門(mén)氏菌的殺菌動(dòng)力學(xué)

林佳揚(yáng),陳小藝,周愛(ài)蓮,方婷*

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002)

為了探究ClO2溶液處理牡蠣中沙門(mén)氏菌的最佳殺菌條件,本文選用鼠傷寒沙門(mén)氏菌(CICC22956)和腸炎沙門(mén)氏菌(CICC21482)混合菌株,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,運(yùn)用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法探討料液比、ClO2溶液濃度和殺菌時(shí)間對(duì)牡蠣中的沙門(mén)氏菌殺菌效果的影響。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化模型確定ClO2溶液殺菌的最佳條件為:料液比1∶7 g/mL,ClO2濃度93 g/mL,殺菌時(shí)間30 min。在此條件下模型優(yōu)化出最優(yōu)的沙門(mén)氏菌菌落降低值為3.13 lg cfu/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,采用上述分析的最佳條件不僅有效防止牡蠣中沙門(mén)氏菌的污染,還可以提高生鮮牡蠣的品質(zhì)和安全性。

牡蠣,沙門(mén)氏菌,ClO2殺菌,響應(yīng)面設(shè)計(jì)

牡蠣是一種藥食兩用的海中珍品,但是牡蠣在生長(zhǎng)、捕獲、運(yùn)輸以及銷(xiāo)售的過(guò)程中經(jīng)常會(huì)受到各種致病菌的污染,尤其是沙門(mén)氏菌[1-2]。Tingfang等[3]研究了鼠傷寒沙門(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌混合菌株在牡蠣中的不同溫度下微生物的生長(zhǎng)特性,同時(shí)指出,牡蠣在生食過(guò)程中,極易受到這兩種血清型感染,從而引發(fā)諸多沙門(mén)氏菌食物中毒事件,對(duì)消費(fèi)者帶來(lái)極大的健康威脅。目前貝類(lèi)凈化技術(shù)基本上是用臭氧、ClO2、紫外線這3種方法對(duì)進(jìn)行處理[4-5]。而對(duì)牡蠣中沙門(mén)氏菌殺菌效果的研究未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

二氧化氯(ClO2)是目前國(guó)際上公認(rèn)的高效A1級(jí)滅菌消毒劑,它殺菌力極強(qiáng)、殺菌速度快、效率高、副產(chǎn)物少,適合作為食品消毒劑[6-8]。我國(guó)國(guó)標(biāo)GB2760-2014中規(guī)定ClO2可以在水產(chǎn)品加工中應(yīng)用[9]。陶晶等[10]采用簡(jiǎn)單的單因素實(shí)驗(yàn)法研究表明,當(dāng)海水中ClO2濃度為18.75 mg/g時(shí),在30 h內(nèi)可使牡蠣內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)降低2.61,消毒效果較好。

響應(yīng)面分析法(response surface methodology,RSM)是利用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法,它與過(guò)去廣為使用的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法不同,具有實(shí)驗(yàn)周期短,求得的回歸方程精度高,能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)[11]。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際條件出發(fā),擬以ClO2溶液為殺菌劑,參考Fang[3]實(shí)驗(yàn)方法,選用鼠傷寒沙門(mén)氏菌(CICC22956)和腸炎沙門(mén)氏菌(CICC21482)混合菌株為研究對(duì)象,通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化確定出ClO2殺菌劑處理牡蠣中沙門(mén)氏菌的最佳工藝條件,旨在為進(jìn)一步提高牡蠣的品質(zhì)和延長(zhǎng)產(chǎn)品的保藏期,為其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

近江牡蠣福建省福州市郭厝里永輝超市;胰蛋白胨大豆瓊脂TSA,北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;腦心浸液肉湯培養(yǎng)基BHI,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;蛋白胨Peptone,青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;利福平國(guó)藥集團(tuán);二氧化氯(ClO2含量10%)華星牌;鼠傷寒沙門(mén)氏菌(CICC22956)和腸炎沙門(mén)氏菌(CICC21482)均采購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;THZ-C型恒溫振蕩器太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;QL-866型快速混合器海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司;大容量電動(dòng)移液器大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;YXQ-LS50型高壓滅菌鍋上海博訊實(shí)業(yè)公司;BagMixer100型均質(zhì)拍打器上海思伯明儀器設(shè)備有限公司;FA1004A 型電子天平上海精天電子儀器有限公司;PT919型秒表深圳市超速達(dá)實(shí)業(yè)有限公司;H1850R型高速冷凍離心機(jī)湘儀離心機(jī)儀器有限公司;YB-40-60LA型超低溫冰箱上海億倍實(shí)業(yè)有限公司;無(wú)菌均質(zhì)袋。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1ClO2消毒液的配制1 g ClO2粉劑溶解于1000 mL無(wú)菌水中可制得有效ClO21000 mg/L的消毒液。

1.2.2細(xì)菌培養(yǎng)采用Fang[3]的方法,保存并制備每次實(shí)驗(yàn)所需的接種菌液。

1.2.3原料準(zhǔn)備與接種牡蠣的預(yù)處理采用Fang[3]的方法進(jìn)行樣品的制備與接種。

1.2.4沙門(mén)氏菌和背景菌的菌落數(shù)測(cè)定采用Fang[3]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1料液比對(duì)沙門(mén)氏菌殺菌效果的影響選取ClO2濃度為100 mg/L、殺菌時(shí)間20 min,溫度為25 ℃的一定條件下,探討不同料液比(0、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)g/mL對(duì)牡蠣中沙門(mén)氏菌和背景菌的菌落數(shù)變化影響。

1.2.5.2ClO2濃度對(duì)沙門(mén)氏菌殺菌效果的影響選取料液比1∶6 g/mL,處理時(shí)間20 min,溫度為25 ℃的一定條件下,探討不同ClO2濃度(0、30、50、60、100、120 mg/L)對(duì)牡蠣中沙門(mén)氏菌和背景菌的菌落數(shù)變化影響。

1.2.5.3處理時(shí)間對(duì)沙門(mén)氏菌殺菌效果的影響選取料液比1∶6 g/mL,ClO2濃度為100 mg/L,溫度為25 ℃的一定條件下,探討不同處理時(shí)間(0、10、20、30、40、50 min)對(duì)牡蠣中沙門(mén)氏菌和背景菌的菌落數(shù)變化影響。

1.2.6響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)根據(jù)Box-Behnken Design(BBD)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[12-13],以沙門(mén)氏菌菌落數(shù)降低值為響應(yīng)值,結(jié)合上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取與之密切相關(guān)的ClO2濃度、料液比、殺菌時(shí)間3個(gè)因素為自變量,設(shè)計(jì)了3因素3水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and levels of the response surface experiment

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert V8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1料液比對(duì)牡蠣中沙門(mén)氏菌和背景菌數(shù)的影響由圖1所示,隨著ClO2溶液用量的不斷增加,沙門(mén)氏菌和背景菌數(shù)先下降后趨于平緩,當(dāng)料液比為1∶10時(shí),沙門(mén)氏菌的菌落數(shù)下降了3.07 lg cfu/g,背景菌的菌落數(shù)下降了2.71 lg cfu/g。其中,料液比小于1∶6范圍區(qū)間,沙門(mén)氏菌和背景菌菌落數(shù)下降值存在顯著差異(p<0.05);料液比為1∶8～1∶10之間時(shí),增加ClO2溶液用量,沙門(mén)氏菌和背景菌菌落數(shù)沒(méi)有顯著變化。因此,當(dāng)料液比為1∶6時(shí),ClO2溶液對(duì)牡蠣進(jìn)行殺菌處理效果好。

圖1　不同料液比對(duì)沙門(mén)氏菌和背景菌數(shù)的影響 Fig.1　Effects of different proportion on the number of Salmonella and background microorganisms

2.1.2ClO2溶液濃度對(duì)牡蠣中沙門(mén)氏菌和背景菌數(shù)的影響由圖2可知,隨著ClO2溶液濃度的不斷增加,沙門(mén)氏菌和背景菌數(shù)先降低后趨于平緩,當(dāng)ClO2溶液濃度為120 mg/L時(shí),沙門(mén)氏菌的菌落數(shù)下降了3.02 lg cfu/g,背景菌的菌落數(shù)下降了2.62 lg cfu/g。其中,當(dāng)ClO2溶液濃度在0～100 mg/L時(shí),沙門(mén)氏菌和背景菌數(shù)下降值存在顯著差異(p<0.05);當(dāng)ClO2溶液濃度在100～120 mg/L時(shí),沙門(mén)氏菌和背景菌數(shù)下降值沒(méi)有明顯變化。說(shuō)明當(dāng)ClO2溶液達(dá)到一定濃度時(shí),對(duì)菌體的殺菌效果無(wú)法起到顯著作用,考慮到原材料的消耗率,節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本,故本實(shí)驗(yàn)選用ClO2溶液對(duì)牡蠣進(jìn)行殺菌處理的濃度為75 mg/L。

圖2　不同ClO2消毒液濃度 對(duì)沙門(mén)氏菌和背景菌數(shù)的影響Fig.2　Effects of ClO2disinfectant density on the number of Salmonella and background

2.1.3殺菌時(shí)間對(duì)牡蠣中沙門(mén)氏菌和背景菌數(shù)的影響由圖3可知,隨著ClO2溶液處理時(shí)間的不斷增加,沙門(mén)氏菌和背景菌數(shù)先降低后趨于平緩,當(dāng)處理時(shí)間為50 min時(shí),沙門(mén)氏菌的菌落數(shù)下降了3.09 lg cfu/g,背景菌的菌落數(shù)下降了2.65 lg cfu/g。其中,當(dāng)處理時(shí)間在0～20 min時(shí),沙門(mén)氏菌和背景菌數(shù)下降值存在顯著差異(p<0.05);當(dāng)處理時(shí)間在40～50 min時(shí),菌落數(shù)沒(méi)有較大變化,原因可能在于隨著時(shí)間的延長(zhǎng),ClO2消毒液的濃度降低,菌體產(chǎn)生應(yīng)急反應(yīng),造成菌體抗性增加,ClO2溶液的殺菌效果減弱[14]。由此可說(shuō)明,ClO2溶液對(duì)牡蠣進(jìn)行殺菌處理的最佳處理時(shí)間為20 min。

圖3　不同處理時(shí)間對(duì)沙門(mén)氏菌和背景菌數(shù)的影響Fig.3　Effects of different times on the number of Salmonella and background

2.2ClO2溶液殺菌工藝優(yōu)化

2.2.1響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果分析該研究選用BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在四個(gè)中心點(diǎn)處進(jìn)行17次實(shí)驗(yàn),其中13次是分析實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果隨機(jī)完成,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 2　The design and results of experiments

通過(guò)Design-Expert V8.0.6 統(tǒng)計(jì)軟件擬合響應(yīng)指標(biāo)對(duì)自變量的回歸曲線,建立數(shù)學(xué)模型并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果如下:

Y=2.82+0.14A+0.37B+0.41C-2.500E-003AB+0.057AC+0.052BC-0.21A2-0.37B2-0.25C2,對(duì)回歸曲線進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.2響應(yīng)面圖分析經(jīng)Design-Expert V 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件分析,由回歸方程分析得到沙門(mén)氏菌菌落降低值與各因素的響應(yīng)面結(jié)果見(jiàn)圖4～圖6。在響應(yīng)面圖中,曲面越陡峭,表明該實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著。等高線圖與響應(yīng)面圖相對(duì)應(yīng),等高線圖隨著響應(yīng)面圖的變化而變化,其曲線越接近中心,則對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值也就越大[15]。

圖4表示固定殺菌時(shí)間為20 min,料液比和ClO2溶液濃度對(duì)牡蠣中沙門(mén)氏菌殺菌效果的影響。從圖4可看出,A、B交互作用不顯著。圖4中隨著料液比和ClO2濃度的增大,沙門(mén)氏菌菌落數(shù)減少值均呈上升趨勢(shì),到達(dá)某一定值時(shí)曲面趨于平緩,說(shuō)明隨著殺菌時(shí)間的延長(zhǎng),ClO2容易揮發(fā),影響殺菌效果;由圖4可以確定最佳水平范圍即料液比為1∶6.5～1∶7,ClO2溶液濃度為75～95 g/mL。

表3　回歸模型方差分析Table 3　The variance analysis of the regression model

圖4　料液比和ClO2濃度交互作用 對(duì)沙門(mén)氏菌菌落數(shù)降低值的響應(yīng)面圖Fig.4　The response surface map of the effect of interaction between different proportion and concentration of ClO2 on the viscosity of sol solution

注:*表示差異顯著(p<0.05),**表示差異極顯著(p<0.01)。

圖5表示固定ClO2溶液濃度為75 g/mL時(shí),料液比和殺菌時(shí)間對(duì)牡蠣中沙門(mén)氏菌殺菌效果的影響。由圖5顯示,A、C交互作用顯著。隨著料液比和殺菌時(shí)間的增大,沙門(mén)氏菌菌落數(shù)減少值呈先升高后降低的趨勢(shì);由圖5可以確定最佳水平范圍即料液比為1∶6.5～1∶7,殺菌時(shí)間為25～30 min。

圖5　料液比和殺菌時(shí)間交互作用 對(duì)沙門(mén)氏菌菌落數(shù)降低值的響應(yīng)面圖Fig.5　The response surface map of the effect of interaction between different proportion and different sterilization times on the viscosity of sol solution

圖6表示固定料液比為1∶6 g/mL時(shí),ClO2溶液濃度和殺菌時(shí)間對(duì)牡蠣中沙門(mén)氏菌殺菌效果的影響。由圖6顯示,B、C交互作用顯著。隨著ClO2溶液濃度和殺菌時(shí)間的增大,沙門(mén)氏菌菌落數(shù)減少值先升高,達(dá)到某一定值時(shí)趨于平緩;由圖6可以確定最佳水平范圍即ClO2溶液濃度為85～95 g/mL,殺菌時(shí)間為25～30 min。

圖6　殺菌時(shí)間和ClO2濃度交互作用 對(duì)沙門(mén)氏菌菌落數(shù)降低值的響應(yīng)面圖Fig.6　The response surface map of the effect of interaction between different sterilization times and concentration of ClO2 on the viscosity of sol solution

2.2.3最優(yōu)殺菌條件的確定及模型驗(yàn)證以沙門(mén)氏菌菌落數(shù)降低值為最終考察指標(biāo),根據(jù)Design-Expert V 8.0.6軟件對(duì)所得回歸方程的最優(yōu)預(yù)測(cè)值求解,可得ClO2溶液殺菌處理牡蠣中沙門(mén)氏菌的最優(yōu)殺菌參數(shù),其分別為:料液比1∶6.88 g/mL、ClO2溶液濃度92.48 g/mL、殺菌時(shí)間30 min,最大沙門(mén)氏菌菌落降低值達(dá)到3.14 lg cfu/g。為方便實(shí)際操作將實(shí)驗(yàn)條件校正為料液比1∶7 g/mL、ClO2溶液濃度93 g/mL、殺菌時(shí)間30 min,在上述最優(yōu)條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得平均沙門(mén)氏菌菌落降低值為3.13 lg cfu/g,結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)響應(yīng)面回歸方程擬合處理的理論值與實(shí)際值相吻合,用響應(yīng)面法可以?xún)?yōu)化ClO2溶液對(duì)牡蠣中沙門(mén)氏菌的殺菌工藝。

3　結(jié)論

以牡蠣中沙門(mén)氏菌為研究對(duì)象,采用ClO2溶液可以有效減少牡蠣中沙門(mén)氏菌,根據(jù)Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)所得回歸方程的最優(yōu)預(yù)測(cè)值求解,可得ClO2溶液殺菌處理牡蠣中沙門(mén)氏菌的最優(yōu)殺菌參數(shù)為:料液比1∶7 g/mL,ClO2溶液濃度93 g/mL,殺菌時(shí)間30 min,沙門(mén)氏菌菌落降低值為3.13 lg cfu/g。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,模擬方程預(yù)測(cè)值具有較高的擬合度及可信度,可以應(yīng)用該回歸模型分析和預(yù)測(cè)ClO2溶液對(duì)牡蠣中沙門(mén)氏菌殺菌效果的影響。因此,ClO2溶液不僅可以有效降低牡蠣中沙門(mén)氏菌的數(shù)量,還可以提高生鮮牡蠣的品質(zhì)和安全性。

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Sterilizing dynamics ofSalmonellaspp. in oyster by chlorine dioxide

LIN Jia-yang,CHEN Xiao-yi,ZHOU Ai-lian,FANG Ting*

(College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

To optimize the sterilizing parameters of chlorine dioxide forSalmonellaspp. in oyster,the samples were inoculated with a cocktail of twoSalmonellaserotypes,S.Typhimurium(CICC22956)andS.Enteritidis(CICC21482). The single factor tests and response surface methodology(RSM)were applied. The impacts of different proportion,concentration of chlorine dioxide,sterilization timeSalmonellaspp. sterilization in oyster were investigated. Results showed that the optimal sterilizing conditions were as follows:the ratio of oyster to chlorine dioxide solution was 1∶7 g/mL,the concentration of chlorine dioxide was 93 g/mL,and operating time was 30 min. The repeated test under these conditions showed that the reduced number ofSalmonellapp. was 3.13 lg cfu/g. In conclusion,the optimal conditions for sterilization of fresh oysters could not only effectively prevent the contamination ofSalmonellaspp.,but also improve the quality and safety of fresh oysters.

oyster;Salmonellaspp.;chlorine dioxide sterilization;response surface design

2016-01-20

林佳揚(yáng)(1991-),男,碩士研究生,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程,E-mail:linjiayang065@163.com。

方婷(1981-),女,副教授,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程,E-mail:fangting930@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31401597);閩發(fā)改投資[2014]168號(hào);福建省高水平大學(xué)建設(shè)項(xiàng)目(612014043)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)14-0108-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.013