呂耀龍,李少英,包丹丹,趙春杰

(1.內蒙古農業(yè)大學職業(yè)技術學院,內蒙古包頭 014109;2.內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院,內蒙古呼和浩特 010018)

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內蒙古達茂旗牧區(qū)牛乳中乳酸菌的鑒定與耐藥性分析

呂耀龍1,李少英2,*,包丹丹1,趙春杰1

(1.內蒙古農業(yè)大學職業(yè)技術學院,內蒙古包頭 014109;2.內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院,內蒙古呼和浩特 010018)

本研究以內蒙古達茂旗牧區(qū)牛乳中分離的16株乳酸菌為研究對象,采用形態(tài)觀察、生物學特性實驗和16S rRNA鑒定,并用紙片擴散法對阿莫西林、氨芐西林和紅霉素三種抗生素進行了耐藥測定。結果顯示,除DM8為乳酸乳球菌、DM21為約氏乳桿菌外,其余均為植物乳桿菌;供試菌株對阿莫西林的耐藥率為12.5%,對氨芐西林和紅霉素表現為敏感。經分析,敏感菌株不完全是安全菌株。

乳酸菌,鑒定,耐藥性,分析

內蒙古達茂旗牧區(qū)牛乳中含有多種乳酸菌,這些菌種多被應用于食品業(yè)、飼料業(yè)和醫(yī)藥業(yè)等相關領域。乳酸菌有著較長的安全使用歷史,人們普遍認為發(fā)酵產品中所用的乳酸菌都是安全(GRAS)菌株,并與人及動物腸道固有微生物群落存在著相互的益生作用,對人和動物的健康有益[1]。近年來研究表明,抗生素在醫(yī)藥、飼料等行業(yè)得到了廣泛甚至泛濫應用,致使微生物耐藥問題日趨嚴重,使人們在應對微生物性疾病時將面臨嚴重挑戰(zhàn)[2]。有研究表明,臨床分離的細菌中有近50%～70%的乳酸菌對青霉素類藥物表現出耐藥性[3-4]。

阿莫西林、氨芐西林和紅霉素三種抗菌藥物,是臨床治療中感染性疾病應用較多的藥物。乳酸菌對三種抗菌藥物表現為較低的耐藥率,但也存在一定的差異性[3-8]。在不明確菌株耐藥程度的情況下盲目研究機理及防控乃至用于生產實踐,將造成后續(xù)工作的不確定性、甚至影響人們的健康。本文旨在研究內蒙古達茂旗牧區(qū)牛乳中乳酸菌對阿莫西林、氨芐西林和紅霉素三種抗菌藥物的耐藥性,為進一步研究耐藥機理和選育乳酸菌提供方向,為乳酸菌的安全使用提供參考依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

表1　紙片法使用的抗菌藥物及藥物敏感型標準

注:S(susceptible)為敏感;R(resistant)為耐藥;I(intermediate)為中度敏感。

實驗菌株來自內蒙古達茂旗牧區(qū)牛乳中分離純化保存的菌種,共16株,分別為:DM1、DM2、DM3、DM4、DM6、DM8、DM9、DM10、DM11、DM13、DM14、DM15、DM17、DM18、DM19、DM21;質控菌株:大腸桿菌(Escherichiacoli,ATCC:25922)標號DC購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;瓊脂糖Sigma公司;細菌基因組DNA提取試劑盒天根生化科技(北京)有限公司;2×Easy Tap PCR Supermix、DL2000 DNA Marker、6×Loading buffer北京全式金生物技術有限公司;核酸染料北京賽百盛生物工程公司;16S rRNA序列引物:上游:5′-tgtcgtgagatgttgggttaag-3′,下游:5′-actagcgattccgacttcatgt-3′中美泰和生物技術(北京)有限公司,查閱文獻[3]而定;阿莫西林(HTWS-C054,10 μg/片)、氨芐西林(C002,10 μg/片)、紅霉素(C023,15 μg/片)杭州天和微生物試劑有限公司;TPY培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和脫脂乳培養(yǎng)基按文獻[9]進行配制。

熒光分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;超凈臺哈爾濱市東聯公司;離心機Eppendorf公司;PCR擴增儀BIO-RAD公司;電泳儀北京市六一儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1菌種活化按照文獻[10]中方法進行。

1.2.2供試菌液制備按照文獻[3]中方法進行。

1.2.3供試菌株的形態(tài)及生物學特性細菌鏡檢觀察、革蘭氏染色、運動性實驗、過氧化氫酶實驗、葡萄糖產氣實驗、糖發(fā)酵實驗等具體實驗步驟參照文獻[11]方法進行。

1.2.4供試菌株16S rRNA鑒定

1.2.4.1供試菌株DNA提取具體操作步驟按照DNA提取試劑盒操作步驟進行。

1.2.4.2供試菌株DNA驗證0.5 μL的6×Loading buffer與5 μL提取后供試菌株的DNA混勻,點入1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,觀察條帶。電泳參數:電泳液為1×TBE buffer,時間為30 min,電壓為110 V。

1.2.4.3PCR擴增16S rRNA PCR擴增的引物通過查閱文獻[3]而定,擴增片段長為275 bp,由中美泰和生物技術(北京)有限公司合成。

擴增體系為50 μL:模板DNA(4 μL)、上游引物(1 μL)、下游引物(1 μL)、2×Easy Tap PCR Supermix(25 μL)、ddH2O(19 μL)。PCR循環(huán)參數[5],預變性:94 ℃、3 min,變性:94 ℃、30 s,退火:60 ℃、30 s,延伸:72 ℃、1 min，共45個循環(huán),末端延伸:72 ℃、5 min。

1.2.4.4PCR擴增產物驗證將提取的DNA 5 μL點入1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,觀察條帶。電泳參數:電泳液為1×TBE buffer,時間為30 min,電壓為110 V。

1.2.4.5供試菌株16S rRNA同源性分析將1.2.4.3中PCR擴增產物送中美泰和生物技術(北京)有限公司進行測序。測序結果與NCBI中BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)和GenBank數據庫中已有菌株16S rRNA序列進行比對,找出與供試菌株序列同源性最高菌種。將供試菌株序列與已知NCBI數據庫中乳酸菌序列用DNASTAR軟件中MegAlign進行分析,得到同源性百分比,繪制系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定供試菌株。

1.2.5供試菌株抑菌直徑測定采用紙片擴散法測定,用無菌吸管取1 mL供試菌液,分別加入到25 mL未凝固MRS培養(yǎng)液中,充分搖勻后再倒入平皿中待凝固。在凝固好的平皿中均等放置2個藥敏紙片、1個空白紙片。同樣方法做質控菌株對照。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,測量抑菌圈直徑。上述實驗每個菌株做3次重復。

1.2.6供試菌株對三種抗菌藥的敏感性判斷供試菌株對三種抗菌藥的敏感性參照美國臨床和實驗標準協(xié)會(CLSI)[10,12]規(guī)定標準(詳見表1)進行,報告各供試菌株對三種抗菌藥物是敏感、中度敏感、耐藥分別用S、I和R表示[11-12]。

2　結果與分析

2.1供試菌株的生物學特性

16株供試乳酸菌的形態(tài)及部分理化特性見表2。從表2可知,各供試菌株的菌落大小不盡相同,偏小、中等居多,菌落顏色均為乳白色,菌落除DM8和DM11外,均為不透明。供試菌株均為革蘭氏陽性,4株球菌,12株桿菌,包括4株短桿菌。理化檢測中硝酸鹽還原實驗均為陰性。運動性實驗,9株陽性,7株陰性;陽性菌株3株球菌,6株桿菌,陰性菌株2株球菌,其余為桿菌。葡萄糖產氣、過氧化氫酶實驗均為陰性,實驗結果符合乳酸菌特性。本實驗還選取五種代表性的糖:葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇進行糖發(fā)酵實驗,只有DM17葡萄糖發(fā)酵略產氣,其他均不產氣。糖發(fā)酵中有25%種次為陰性,其余均為陽性。致此原因:糖發(fā)酵原理、微生物含有酶系不同所致，綜上，DM8為乳酸乳球菌、DM21為約氏乳桿菌，其余均為植物乳桿菌。

表2　供試菌株的生物學特性結果

注:—:表示不透明,半:表示半透明,G+:表示革蘭氏陽性,-:表示陰性,+:表示陽性,+○:表示陽性產氣,=:表示陰性無發(fā)酵。

2.2供試菌株16S rRNA鑒定

2.2.1DNA提取條帶條帶如圖1所示。目的條帶與預期條帶一致,均大于2000 bp。

圖1　供試菌株總DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1　Agarose gel electrophoresis of total DNA of the tested strains注:M:DNA Marker DL2000,1:DM1,2:DM2,3:DM3,4:DM4,5:DM6,6:DM8,7:DM9,8:DM10,9:DM11,10:DM13,11:DM14,12:DM15,13:DM17,14:DM18,15:DM19,16:DM21,17:FC,18:DC。

2.2.216S rRNA擴增條帶以試劑盒提取的DNA為模板,對16株供試菌株16S rRNA基因50 μL體系擴增,再用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,供試菌株、標準菌株都在275 bp處出現特異性的條帶,與預期吻合,DM16、DM17、DM18有重復條帶現象,分析可能是因退火溫度不夠高或引物不夠特異所致,詳見圖2。

圖2　供試菌株的16S rRNA基因擴增電泳圖Fig.2　16S rRNA gene amplificationelectrophoresis of the tested strains注:M:DNA Marker DL2000,1:DM1,2:DM2,3:DM3,4:DM4,5:DM6,6:DM8,7:DM9,8:DM10,9:DM11,10:DM13,11:DM14,12:DM15,13:DM17,14:DM18,15:DM19,16:DM21,17:FC,18:DC。

2.2.316S rRNA同源性分析將上述PCR產物與Genbank/EMBL/DDBJ數據庫中已知乳酸菌的16S rRNA基因序列同源性分析并出圖(見圖3)。16株供試菌株中DM2、DM3、DM4、DM6、DM9、DM10、DM11、DM13、DM14、DM15、DM17、DM18和DM19的16S rRNA序列結果與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)序列的同源性為100%,菌株DM1的16S rRNA序列結果與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)序列的同源性為99.5%,故判定以上14株供試菌株為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum);DM8的16S rRNA序列結果與乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)序列的同源性為99.5%,故判定為乳酸乳球菌(Lactococcuslactis);DM21的16S rRNA序列結果與約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)序列的同源性為97.9%,故判定為約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)。

圖3　供試菌株的同源性和系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3　Homology and phylogenetic tree oftested strains

2.3供試菌株的耐藥特性

2.3.1供試菌株耐藥抑菌圈直徑及藥敏結果供試菌株培養(yǎng)24 h后,測量培養(yǎng)皿抑菌圈直徑大小求均值,得藥敏結果見表3,耐藥率結果見表4。

表3　三種抗菌藥物對16株乳酸菌的抑菌直徑及藥敏結果

注:R為耐藥,I為中度敏感,S為敏感,W為在CLSI規(guī)定值范圍之內。

表4　16株供試菌株對三種抗菌藥物的耐藥率

表5　三種抗菌藥物對供試菌株抑菌直徑的F檢驗

表4結果表明,16株菌對氨芐西林、紅霉素均為敏感,對阿莫西林有2株為耐藥,其余為敏感。16株菌對氨芐西林、紅霉素的耐藥率為0,對阿莫西林的耐藥率為12.5%。

質控菌株大腸桿菌對阿莫西林、氨芐西林和紅霉素的耐藥直徑均在CLSI規(guī)定允許范圍內,說明供試菌株耐藥直徑數值有效。

2.3.2供試菌株的耐藥性分析結合上述實驗結果做三種抗菌藥對供試菌株抑制性差異分析,結果見表5。

從表4、表5可以看出,三種抗菌藥物對乳酸菌抑制作用差異極顯著(p<0.01)。

周寧[7]從全國不同地區(qū)市售的酸奶中分離的43乳酸菌中,得出對氨芐西林的耐藥率為34.9%,對紅霉素的耐藥率為44.2%。秦宇軒[8]等人從市售酸奶中分離的100種乳酸菌,對鏈霉素和慶大霉素的耐藥率為100%,對萬古霉素的耐藥率為42%,對頭孢氨芐、四環(huán)素、紅霉素和土霉素的耐藥率為0。Hummel等[13]將40株商用乳酸菌對紅霉素、四環(huán)素、氯霉素、青霉素G、氨芐西林的耐藥性研究得出,耐藥率低于7%。MASCO等[14]對100株乳酸菌的耐藥性研究得出,對阿莫西林、萬古霉素、氯霉素、紅霉素的表現為敏感。張麗芳等[15]對34株乳酸菌的耐藥性研究得出,對紅霉素、氨芐西林、青霉素G均表現為敏感或中度敏感。陳燃等[16]對31株乳酸菌的耐藥性研究得出,對紅霉素的耐藥率為9.7%。本實驗研究結果與以上學者實驗結果一致,16株乳酸菌對阿莫西林、氨芐西林、紅霉素表現為較低的耐藥率,分別為12.5%、0、0。但Hummel等人[12,17]在對氯霉素敏感的乳酸菌中檢測出氯霉素耐藥基因(cat),說明無耐藥型的乳酸菌也可能攜帶耐藥基因。秦宇軒等人[8]在對紅霉素敏感菌株檢測到耐藥基因(ermB)。呂耀龍[18]研究內蒙古達茂旗牧區(qū)牛乳中乳酸菌對氧氟沙星的表現為較高的耐藥率。目前人類大量濫用抗菌藥物,乳酸菌對多數抗菌藥物表現為不同程度的耐藥,但也存在著對部分抗菌藥物表現為敏感。對抗菌藥物敏感的菌株不完全是安全菌株,也可能含有耐藥基因,只是沒有表達或表達不充分。FAO/WHO評價益生菌安全的重要指標之一是其耐藥性評價[15,19]。

3　結論

3.116株供試菌株中,經生物學特性實驗和16S rRNA鑒定,除DM8為乳酸乳球菌、DM21為約氏乳桿菌外,其余均為植物乳桿菌。

3.216株供試菌株中,2株菌對阿莫西林表現為耐藥,耐藥率為12.5%;對氨芐西林和紅霉素均為敏感菌株,耐藥率為0。供試菌株對三種抗菌藥物表現為較低的耐藥率。內蒙古達茂旗牧區(qū)牛乳中乳酸菌對不同的抗菌藥物呈現不同的耐藥性。敏感菌株也可能含有耐藥基因,不完全是安全菌株。鑒于此,對食品工業(yè)而言,在選育評價乳酸菌菌株時,除了考慮其發(fā)酵能力,發(fā)酵產物的品質和安全性外,還應檢測菌株的耐藥性和耐藥機理,這樣可保證食用菌株的安全性,防范耐藥菌株的擴增和耐藥基因的轉移。

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Identification and drug resistance analysis on the lactic acid bacteria of cow milk in the pastoral areas of Damao Banner in Inner Mongolia

LV Yao-long1,LI Shao-ying2,*,BAO Dan-dan1,ZHAO Chun-jie1

(1.Vocational and Technical College of Inner Mongolia Agricultural University,Baotou 014109;2.Food Science and Engineering College of Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018)

The sixteen 16 strains of lactic acid bacteria were isolated from the cow milk in the Damao pasture of Inner Mongolia,and were used as research subjects in the study. The method of morphological observation,biological characteristics test and 16S rRNA identification were adopted in the experiment. The disk diffusion method was used to determine drug resistance of three antibiotics of amoxicillin,ampicillin and erythromycin. Results showed that DM8 wasLactococcuslactis,and DM21 wasLactobacillus,and that except DM8 and DM21,the rest were allLactobacillusplantarum. The study also showed that the tested strains resistant to amoxicillin was 12.5%,the tested strains were sensitive to ampicillin and erythromycin,and the sensitive strain was not entirely safety strain through analysis.

lactic acid bacteria;identification;drug resistance;analysis

2015-10-22

呂耀龍(1982-)，男，碩士，講師，主要從事食品微生物方面的研究，E-mail:lylong1982@163.com。

李少英(1961-)，女，博士，教授，研究方向：有益微生物方面的研究，E-mail:nmglshy@126.com。

內蒙古高等學?？茖W研究項目(NJ09059)；國家自然科學基金項目(31060014)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)12-0178-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.026