龔　洋,馬海樂,王　洋,茍文來,熊　建,劉　芳

(江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇省食品物理加工重點實驗室,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

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不補料酶膜耦合反應制備牛乳蛋白ACE抑制肽的研究

龔洋,馬海樂*,王洋,茍文來,熊建,劉芳

(江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇省食品物理加工重點實驗室,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

為了克服傳統(tǒng)酶解技術的不足,提高酶解反應效率,采用不補料酶膜耦合反應制備牛乳蛋白ACE抑制肽?？疾斐瑸V膜對牛乳蛋白及酶的截留、膜通量及濾出液的ACE抑制率和IC50的影響,確定出超濾膜最佳的截留分子量為5000 u;研究了反應時間、底物濃度、加酶量和循環(huán)泵轉速對蛋白轉化率的影響,確定最優(yōu)酶解工藝條件:底物濃度7%(W/W)、加酶量2000 U/g、反應時間100 min、循環(huán)泵轉速100 r/min,該條件下蛋白轉化率、單位酶產(chǎn)肽量、ACE抑制率分別達到53.16%、39.59 g肽/g酶、76.81%,與對照組相比蛋白轉化率、單位酶產(chǎn)肽量、ACE抑制率分別提高了16.99%、16.61%、18.55%;采用高效凝膠過濾色譜法測定超濾液中ACE抑制肽的分子量分布,發(fā)現(xiàn)樣品中分子量≤2253 u組分質量分數(shù)為94.62%,超濾膜對截留分子量大小控制準確。因此不補料酶膜耦合反應可為酶法制備牛乳蛋白ACE抑制肽提供一種更為高效的方法。

牛乳蛋白,酶膜耦合,ACE抑制肽,蛋白轉化率

牛乳蛋白是人類膳食蛋白質的重要來源,不僅為人類提供豐富的營養(yǎng),還包含具有降血壓活性的血管緊張素(Angiotensin I-converting enzyme,ACE)抑制肽等多種生物活性肽的序列,食用安全性高、無副作用[1-3]。傳統(tǒng)酶法制備ACE抑制肽采用先酶解再膜分離的制取工藝,存在產(chǎn)品均一性差、酶消耗量大、多肽產(chǎn)率低、工序繁瑣等缺點[4-5]。相比之下,酶膜耦合反應制備ACE抑制肽,在酶解反應的同時,實現(xiàn)生物小分子多肽在線分離,減少產(chǎn)物抑制效應,產(chǎn)物分布集中,酶和大分子多肽及蛋白等未反應的物質則返回反應體系繼續(xù)反應,提高了酶的利用率,從而得到更高的底物轉化率[6-7]。近年來,大量研究表明酶膜耦合技術可以改善傳統(tǒng)間歇酶解制備ACE抑制肽的不足,顯著提高反應效率及產(chǎn)物活性。丁青芝[8]等人以蛋白轉化率為指標,研究了三種酶膜耦合制備活性多肽的模型,結果表明連續(xù)酶膜耦合模型可大大提高活性多肽的產(chǎn)能;姜瞻梅[9]等采用10000 u和3000 u的超濾膜分離酪蛋白酶解物中的ACE抑制肽,證明超濾技術是一種分離ACE抑制肽的有效手段;Cheison[10]等人利用響應面優(yōu)化乳清蛋白在切變流酶膜反應器中的工藝參數(shù),重點研究了底物濃度、加酶量和膜通量對酶膜反應器運行狀況的影響。本文以牛乳蛋白為原料,在前期選酶及傳統(tǒng)酶解最優(yōu)工藝基礎上,考察酶膜耦合反應過程中操作參數(shù)對蛋白轉化率的影響,探索制備牛乳蛋白ACE抑制肽的有效方法,并采用高效凝膠過濾色譜法測定其相對分子量分布,為酶膜耦合技術在食品加工中的應用提供實驗依據(jù)和參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

光明脫脂奶粉蛋白含量34%,市售;血管緊張素轉化酶(ACE)酶活力4.2 U/mL;馬尿酰組氨酰亮氨酸(N-Hippuryl-L-histidyl-L-leucine,HHL)Sigma公司;Neutrase(中性蛋白酶)酶活力119987 U/mL,南京誠納化工有限公司;乙腈德國默克MERCK公司;牛血清白蛋白(67000 u)、細胞色素C(12500 u)、桿菌酶(1450 u)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(451 u)、色氨酸(204 u)Sigma公司;鹽酸、三氟乙酸、氫氧化鈉國藥集團化學試劑有限公司。

Pellicon小型超濾系統(tǒng)包含截留分子量為5000、3000、1000 u的再生纖維素復合膜,美國Millipore公司;BT600S型蠕動泵保定雷弗流體科技有限公司;WFJ7200型可見分光光度計尤尼柯(上海)儀器有限公司;PHS-3C酸度計上海鴻蓋儀器有限公司;Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)美國安捷倫公司;Waters 1525型高效液相色譜儀美國Waters公司。

1.2酶膜耦合反應實驗方法

1.2.1超濾膜截留分子量的選擇實驗以超濾膜通量、透過液ACE抑制率為考核指標,通過傳統(tǒng)的酶解實驗,確定最佳的超濾膜截留分子量。在底物濃度9%、加酶量1500 U/g、水解溫度50 ℃、pH7.0的條件下酶解60 min,沸水浴滅酶10 min,5000 r/min離心10 min后取上清液,采用不同截留分子量(5000、3000、1000 u)的膜進行超濾。超濾過程中循環(huán)泵轉速設為100 r/min,料液溫度維持50 ℃,操作壓力0.09 MPa。測定膜通量、透過液ACE抑制率。

1.2.2超濾膜對蛋白質和酶截留情況的評價實驗對于酶膜耦合反應,需要評價膜對蛋白和蛋白酶的截留情況[11-12]。

對蛋白的截留情況實驗:取m1(81 g)牛奶粉配制成9%的溶液,在溫度50 ℃、轉速100 r/min、壓力0.09 MPa的條件下過5000 u的膜循環(huán)1 h,收集滲透液并濃縮凍干,稱重為m2(2 g),截留率即為97.53%。

對蛋白酶的截留情況實驗:在底物濃度9%、加酶量1500 U/g、溫度50 ℃,pH7、壓力0.09 MPa的條件下,以5000 u的膜進行酶膜耦合反應100 min,每隔20 min測透過液和截留液的酶活。截留率為截留液中酶活力單位總數(shù)與原始反應液中酶活力單位總數(shù)的百分比,透過率為透過液中酶活力單位總數(shù)與原始反應液中酶活力單位總數(shù)的百分比。

1.2.3不補料酶膜耦合反應條件的優(yōu)化以牛奶蛋白轉化率為考核指標,通過實驗優(yōu)化不補料模式下最佳酶膜耦合反應的條件。選用中性蛋白酶、5000 u再生纖維素復合膜,對牛奶蛋白進行連續(xù)循環(huán)酶膜耦合反應。超濾裝置如圖1所示,在中性蛋白酶產(chǎn)品提供的最適溫度50 ℃和pH7.0下,考察酶解反應時間、底物濃度、加酶量、循環(huán)泵轉速對牛奶蛋白轉化率的影響。各單因素的取值分別為:在底物濃度9%、加酶量1500 U/g、循環(huán)泵轉速100 r/min下,酶解反應時間20、40、60、80、100、120、140、160 min;在酶解反應時間100 min、加酶量1500 U/g、循環(huán)泵轉速100 r/min下,底物濃度3%、5%、7%、9%、11%、13%;在酶解反應時間100 min、底物濃度7%、循環(huán)泵轉速100 r/min下,加酶量1000、1500、2000、2500、3000 U/g;在酶解反應時間100 min、底物濃度7%、加酶量2000 U/g下,循環(huán)泵轉速60、80、100、120 r/min。

圖1　不補料連續(xù)酶膜耦合反應裝置示意圖Fig.1　Demonstration of continuous membranereactor without new material feeding

1.2.4超濾透過液組分的相對分子量分布采用高效凝膠過濾色譜法測定超濾液的相對分子量分布[13]。Waters液相色譜系統(tǒng):Waters 1525泵,Waters 2998 PDA檢測。色譜條件:色譜柱為TSK-GEL G2000SW×L(7.8 mm×300 mm,5 μm);流動相A,水∶三氟乙酸=100∶0.1;流動相B,乙腈∶三氟乙酸=100∶0.1;檢測波長:UV 220 nm;流速0.5 mL/min;柱溫30 ℃;進樣體積30 μL;洗脫條件:梯度洗脫,可使復雜樣品中性質差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k達到良好的分離目的,使峰型得以改善,增加靈敏度。依據(jù)樣品的色譜數(shù)據(jù)計算超濾液中多肽的相對分子量及其分布范圍所占質量分數(shù)。梯度洗脫條件如表1所示。

表1　梯度洗脫條件

蛋白質分子量標準曲線的繪制:準確稱取牛血清白蛋白(67000 u)、細胞色素C(12500 u)、桿菌酶(1450 u)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(451 u)、色氨酸(204 u)各0.1 g,分別溶于流動相(乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1)100 mL,再各取25 mL混合制成混標。在上述條件下進樣,記錄相應保留時間,以蛋白質標準樣分子量對數(shù)值對標準樣保留時間作圖,得出標準曲線回歸方程。

1.2.5對照酶解實驗在傳統(tǒng)酶解最優(yōu)條件下進行酶解[14-16],即底物濃度9%、加酶量1500 U/g、水解溫度50 ℃、pH7.0、酶解時間60 min,酶解結束后滅酶(沸水浴10 min)、離心(5000 r/min),取上清液過5000 u的超濾膜,測定透過液的ACE抑制率、蛋白轉化率及單位酶產(chǎn)肽量。

1.3主要指標的測定方法

1.3.1膜通量的測定

式中:J-透過速率,mL·(m2·min)-1;V-透過組分的體積,mL;A-超濾膜有效面積,m2(本實驗用的膜包面積為0.1 m2);t-超濾時間,min。

1.3.2蛋白酶的活力測定采用中華人民共和國專業(yè)標準SB/T 10317-1999測定蛋白酶活力。

1.3.3蛋白轉化率的計算蛋白含量采用福林酚法[17]進行測定。蛋白轉化率X(%)以透過液中蛋白質含量占原料液中蛋白含量的百分比計算。

式中:X-蛋白轉化率(%);C0-原料液蛋白含量(mg·mL-1);V0-原料液總體積(mL);C1-透過液蛋白含量(mg·mL-1);V1-透過液總體積(mL)。

1.3.4單位酶產(chǎn)肽量單位酶產(chǎn)肽量Q(g肽/g酶)定義為單位質量酶產(chǎn)生目標肽制品的質量,以肽制品的質量與蛋白酶的質量比計算。超濾液真空冷凍干燥后得到的產(chǎn)品質量即為肽制品質量。

1.3.5ACE抑制率的測定參照吳瓊英的測定方法并適當改進[18]。吸取10 μL樣品溶液,加入25 μL ACE溶液(用加鹽的硼酸緩沖液稀釋10倍),在37 ℃的水浴鍋中反應10 min后加入40 μL HHL,在37 ℃條件下繼續(xù)反應30 min,盡快加入85 μL 1 mol/L HCl終止反應,得到反應液。將反應液用0.22 μm濾膜過濾后用于HPLC分析。同時用10 μL pH8.3的硼酸緩沖液替代樣品溶液制備反應液,作為空白對照組。液相色譜條件:色譜柱:ZORBAX SB-C18分析用色譜柱(4.6 mm×150 mm,填料粒徑為5 μm);流動相:乙腈-超純水(體積比為25∶75,各含0.05%體積分數(shù)的三氟乙酸),等梯度洗脫;流速:1 mL/min;柱溫:25 ℃;進樣量:10 μL。

式中:ACEI-ACE抑制率,%;A-空白對照組Hip的峰面積;B-添加ACE抑制肽組Hip的峰面積。

稱取一定質量樣品配成不同濃度的溶液(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL),以濃度為橫坐標,抑制率為縱坐標繪成圓滑的曲線,從曲線中計算IC50值。

1.4數(shù)據(jù)處理

2　結果與討論

2.1超濾膜的選擇

2.1.1不同截留分子量膜對膜通量的影響圖2為不同截留分子量膜對膜通量的影響。由圖2可以看出,在壓力0.09 MPa條件下5000 u的膜對酶解液具有較高的膜通量,其平均值分別是3000 u膜的1.2倍和1000 u膜的4倍左右,因此從膜通量的角度來看,5000 u的膜比較合適。

圖2　超濾時間對膜通量的影響Fig.2　Influence of ultra-filtration time on flux of membrane

2.1.2不同截留分子量膜對透過液ACE活性的影響圖3為不同截留分子量膜對透過液ACE抑制活性的影響。由圖3可以看出,未經(jīng)超濾的酶解液其ACE抑制率較低,而經(jīng)過超濾膜處理的酶解液其ACE抑制率有了大幅度的提高,通過SPSS分析四者ACE抑制活性有顯著性差異,這表明超濾可以實現(xiàn)ACE抑制肽活性成分的分離與濃縮,為制取高活性的ACE抑制肽提供一種更為有效的方法。但是3000 u和1000 u的膜通量與5000 u的膜比相對較小,因此為了提高原料的利用率和生產(chǎn)效率,綜合考慮選用5000 u分子量的膜作為酶膜耦合的實驗用膜。與未經(jīng)超濾相比,5000 u膜過濾液ACE抑制率提高了45.22%,IC50下降了31.03%。

圖3　不同超濾膜透過液ACE抑制率及其IC50Fig.3　Inhibitory rate of ACE and IC50by ultra-filtration of various membrane

2.1.3超濾膜對原料及酶的截留及透過情況評價實驗發(fā)現(xiàn),超濾100 min,5000 u的膜對牛奶蛋白原料的截留率高達97.53%,說明5000 u的再生纖維素復合膜對原料具有良好的截留性。

圖4為截留液中酶的活力截留率和透過液中酶的活力透過率隨時間的變化圖。由圖4可以看出,透過液中酶活力透過率始終維持較低水平(<5%),說明所用的5000 u的膜對中性蛋白酶幾乎完全截留,而截留液中維持著較高的酶活力截留率(>90%),這表明在酶膜耦合的反應過程中,酶得到了充分地循環(huán)利用,因此5000 u的再生纖維素復合膜可以作為實驗用膜。

圖4　超濾膜對蛋白酶的截留及透過情況Fig.4　Proteases retension and permeation of 5000 u ultra-filtration membrane

2.2不補料酶膜耦合反應條件的優(yōu)化

2.2.1酶膜耦合反應時間對蛋白轉化率的影響蛋白轉化率隨酶膜耦合反應時間的變化趨勢如圖5所示。由圖5可知,反應初期隨著酶膜耦合時間的延長,蛋白轉化率快速增長,而100 min以后其增長的趨勢平緩,蛋白轉化率不再顯著增加。酶膜耦合反應可以顯著提高蛋白轉化率的主要原因在于小分子肽的及時排除,減小了產(chǎn)物抑制效應。酶解100 min以后,底物逐漸不足,受酶催化蛋白質的解聚過程趨于結束,且反應過程失去大量的水,反應體系中料液粘稠致使膜通量下降,影響了蛋白轉化率的繼續(xù)提升[19]。所以,最終確定100 min為酶膜耦合反應時間。

圖5　酶膜耦合反應時間對蛋白轉化率的影響Fig.5　Influence of time on conversion ratio of protein

2.2.2底物濃度對蛋白轉化率的影響底物濃度對蛋白轉化率的影響見圖6。由圖6可知,底物濃度越高,蛋白轉化率反而越低。這主要是因為隨著底物濃度的不斷增大,物料粘度增加使膜通量相應降低,膜通量的減小影響了透過液的體積,從而使蛋白轉化率降低。

圖6　不同底物濃度對蛋白轉化率的影響Fig.6　Influence of different substrate concentration on conversion ratio of protein

圖7為不同底物濃度對蛋白轉化率及ACE抑制活性的影響。由圖7可知,就底物濃度對酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性的影響而言,過低的底物濃度會造成產(chǎn)物ACE抑制活性降低,隨著底物濃度的增加產(chǎn)物ACE抑制活性顯著升高。酶解100 min時,底物濃度3%的蛋白轉化率為62.39%,ACE抑制率僅為40.69%;底物濃度13%的蛋白轉化率為28.41%,ACE抑制率高達80.31%。綜合考慮蛋白轉化率和產(chǎn)物ACE抑制率,選擇底物濃度為7%,其蛋白轉化率和ACE抑制率分別為47.92%和74.11%。

圖7　不同底物濃度對蛋白轉化率及ACE抑制率的影響Fig.7　Influence of different substrate concentration on conversion ratio of protein and inhibitory rate of ACE

2.2.3加酶量對蛋白轉化率的影響加酶量對蛋白轉化率的影響如圖8所示。由圖8可以看出,在相同時間內(nèi),加酶量低于2000 U/g時,蛋白轉化率隨著加酶量的增加有明顯的提高;而加酶量高于2000 U/g時,蛋白轉化率無明顯增加,其直接原因在于底物蛋白已被蛋白酶所飽和,再增加酶濃度對體系的反應無明顯影響[20],綜上所述,選擇加酶量為2000 U/g。

圖8　加酶量對蛋白轉化率的影響Fig.8　Influence of enzyme concentration on conversion ratio of protein

2.2.4蠕動泵轉速對蛋白轉化率的影響蠕動泵轉速對蛋白轉化率的影響如圖9所示。隨著蠕動泵轉速增加,蛋白轉化率相應提高。這是由于蠕動泵轉速增加,有利于多肽在線分離和底物轉化,促使蛋白轉化率提升[21-22]。但是轉速過快,會導致酶與底物接觸時間減少,造成酶解不充分,如圖9所示出現(xiàn)了轉速為120 r/min時蛋白轉化率低于80 r/min的蛋白轉化率。經(jīng)測定轉速100 r/min以后膜通量增加不明顯,維持在120.13 mL·(m2·min)-1左右,其蛋白轉化率達最大值,因此選擇100 r/min作為實驗最優(yōu)循環(huán)轉速。

圖9　不同蠕動泵轉速對蛋白轉化率的影響Fig.9　Influence of different cycle pump speed on conversion ratio of protein

通過單因素逐級優(yōu)化實驗,得到最佳的酶膜耦合反應條件為:酶膜耦合時間100 min、底物濃度7%(W/W)、加酶量2000 U/g、循環(huán)泵轉速100 r/min。在此條件下,蛋白轉化率為53.16%、ACE抑制率為76.81%,單位酶產(chǎn)肽量為39.59 g肽/g酶。利用傳統(tǒng)的酶解方法,蛋白轉化率為45.44%、ACE抑制率為64.79%、單位酶產(chǎn)肽量為33.95 g肽/g酶。因此,就牛奶蛋白的不補料酶膜耦合反應而言,蛋白轉化率、ACE抑制率、單位酶產(chǎn)肽量分別提高了16.99%、18.55%、16.61%。

2.3超濾透過液組分的相對分子量分布

以標準品相對分子量對數(shù)值對保留時間作圖,得出標準曲線回歸方程:Y=-0.283X+7.981(R2=0.998),式中X為保留時間,Y為相對分子量對數(shù)值。

采用高效凝膠過濾色譜法測定最優(yōu)條件下超濾透過液組分的相對分子量分布,由圖10可以看出,大面積的峰其保留時間靠后,超濾液中絕大部分物質的分子量較小,這表明酶膜耦合能較為準確地控制超濾液的分子量大小[23-24],使透過液的分子量主要集中在5000 u以下。

圖10　超濾組分高效凝膠排阻色譜圖Fig.10　The high performance size exclusionchromatography of the permeate fraction

使用GPC數(shù)據(jù)處理軟件,將樣品的色譜數(shù)據(jù)代入標準曲線回歸方程中計算,即可得到超濾液中多肽的相對分子量及其分布范圍所占質量分數(shù),結果如表2所示。從表2中可知,超濾液中相對分子量分布在2253 u及其以下組分的質量分數(shù)為94.62%。本課題組多年研究發(fā)現(xiàn),具有ACE抑制活性的多肽主要為3000 u以下的小分子片段[25],由此可見酶膜耦合可以富集這些高活性物質,從而提高產(chǎn)物的ACE抑制活性。

表2　超濾透過液的相對分子量分布

3　結論

實驗確定了5000 u的再生纖維素復合膜為分離富集產(chǎn)物的適宜膜包,對牛奶蛋白和中性蛋白酶具有較好的截留功能。

通過單因素實驗確定的酶膜耦合最佳反應工藝為:底物濃度7%(W/W)、加酶量2000 U/g、反應時間100 min、循環(huán)泵轉速100 r/min,在最優(yōu)條件下酶解,蛋白轉化率為53.16%、ACE抑制率為76.81%,單位酶產(chǎn)肽量為39.59 g肽/g酶。與對照組相比,蛋白轉化率、ACE抑制率、單位酶產(chǎn)肽量分別提高了16.99%、18.55%、16.61%。

采用高效凝膠過濾色譜法測定了超濾液中ACE抑制肽的分子量分布,其分子量≤2253 u的組分質量分數(shù)為94.62%,表明酶膜耦合可以較準確地控制截留分子量大小,可以富集高活性物質,提高產(chǎn)物的ACE抑制活性。

通過產(chǎn)物的在線分離和酶的循環(huán)利用,酶膜耦合反應技術克服了傳統(tǒng)酶解技術的不足,提高了蛋白轉化率和單位酶產(chǎn)肽量,從而節(jié)約了生產(chǎn)成本,提高了生產(chǎn)效率,可為工業(yè)化生產(chǎn)牛乳蛋白ACE抑制肽提供參考和依據(jù)。

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ACE-inhibitory peptides derived from milk protein by continuous coupling of enzymatic hydrolysis and membrane separation without material feeding

GONG Yang,MA Hai-le*,WANG Yang,GOU Wen-lai,XIONG Jian,LIU Fang

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Jiangsu Provincial Key Laboratory for Food Physical Processing,Zhenjiang 212013,China)

To overcome disadvantage of traditional enzymatic hydrolysis and improve reaction effect,ACE-inhibitory peptides from milk protein were prepared by coupling of enzymatic hydrolysis and membrane separation. According to the comparison of protein retention,protease retention,membrane flux,permeates’ ACE-inhibitory activity and IC50,the molecular weight of ultra-filtration membrane was determined as 5000 u. The effects of reaction time,substrate concentration,enzymatic dosage and cycle pump speed on conversion ratio of protein were investigated respectively. The optimal conditions obtained from the single factor tests were:substrate concentration 7%(W/W),enzymatic dosage 2000 U/g,reaction time 100 min and cycle pump speed 100 r/min. Under the optimal conditions,conversion ratio of protein reached 53.16% with productivity of 39.59 g peptide·(g protease)-1and the inhibitory rate of ACE was 76.81%. Compared with the control group,the three contents were increased by 16.99%,16.61% and 18.55% respectively. The relative molecular weight of permeates was measured by high performance size exclusion chromatography(HPSEC). The results showed that the molecular weight could be effectively controlled by ultra-filtration and 94.62% of sample was less than 2253 u. Therefore,it is suggested that the reaction of coupling of enzymatic hydrolysis and membrane separation can provide a more effective method for the preparation of ACE-inhibitory peptides from milk protein.

milk protein;coupling of enzymatic hydrolysis and membrane separation;ACE-inhibitory peptides;conversion ratio of protein

2015-12-25

龔洋(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品分離及食品生物技術，E-mail：gongyangln@163.com。

馬海樂(1963-)，男，教授，研究方向：食品分離及食品生物技術，E-mail：mhl@ujs.edu.cn。

國家863計劃課題(2013AA102203)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)12-0166-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.024