梁敏慧,崔亞娟,李全霞,陳兆天,李　東

(北京市營養(yǎng)源研究所,北京 100069)

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超高效液相色譜-串聯質譜法測定谷物中的總煙酸

梁敏慧,崔亞娟*,李全霞,陳兆天,李東

(北京市營養(yǎng)源研究所,北京 100069)

建立一種快速、準確的測定谷物中總煙酸含量的超高效液相色譜-串聯質譜方法。樣品加入煙酸-D4同位素內標校正,經氫氧化鈉水解,采用HLB固相萃取柱凈化后,以10 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)和乙腈作為流動相進行梯度洗脫,采用HSS T3液相色譜柱分離,正離子MRM模式進行定性定量分析。實驗結果表明,煙酸在0.1～200 ng/mL濃度范圍內線性關系良好,相關系數r>0.999。線性范圍內,平均加標回收率為99.3%～102.6%,相對標準偏差在4.24%～4.74%。儀器的檢出限為0.04 ng/mL,定量限為0.1 ng/mL。該方法具有靈敏度高、重現性好、分析時間短等優(yōu)點,可以為谷物中總煙酸含量的測定提供技術支持。

總煙酸,谷物,超高效液相色譜-串聯質譜

煙酸又稱為維生素B3或尼克酸,是NAD+和NADP+的重要輔酶形式,參與人體多種物質的正常代謝活動[1-3]。人體內煙酸的缺乏會導致皮膚、消化系統、神經系統的病變[4-7]。在谷物類食品中,煙酸的主要存在形式包括煙酸、煙酰胺以及與小分子肽和碳水化合物共價結合的化學結合態(tài)煙酸[8]。

測定食品中煙酸的方法包括比色法、微生物法[9-10]、毛細管電泳法[11]、高效液相色譜法[12-13]。其中,微生物法和高效液相色譜法是我國國標推薦的檢測嬰幼兒食品及乳品中煙酸及煙酰胺的方法[14]。微生物法是測定煙酸及煙酰胺的經典方法,通過使用不同的微生物可以測定食品中游離煙酸含量或總煙酸的含量,但是該方法實驗周期長,重復性差[15]。高效液相色譜法是檢測食品中煙酸及煙酰胺的另一強有力的手段,但該方法易受到其他雜質的干擾,從而影響結果的準確性。超高效液相色譜-串聯質譜法(Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)是一種具有高選擇性、高靈敏度的分析方法,其分離效果好,檢測時間短,大大提高了分析測定的準確性[16]。近年來,國外已有報道利用此技術測定食品中的煙酸[17-19],然而,國內相關研究卻多集中在對奶粉樣品的研究[20-21],對谷物樣品的研究鮮有報道。

本研究采用固相萃取法對樣品進行凈化,利用煙酸-D4內標物來消除處理過程中帶來的系統誤差,建立了超高效液相色譜-串聯質譜聯用技術(UPLC-MS/MS)測定谷物中總煙酸含量的方法,并通過測定不同實際樣本驗證方法的可行性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

煙酸(nicotinic acid,CAS號:59-67-6,純度≥98.0%)、煙酸-D4(nicotinic acid-D4,CAS號:66148-15-0,純度≥98.0%)美國Supelco公司;HLB、MAX、WAX固相萃取柱(3cc,60 mg)美國Waters公司;乙酸銨(色譜純)、甲酸(色譜純)美國Sigma公司;乙腈(色譜純)美國Fisher公司;鹽酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)北京化學試劑公司;實驗用水為超純水。

Acquity@UPLC-Xevo TQ 型超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀美國Waters公司;BSA2245-CW型分析天平德國Sartorius公司;SX-700型全自動高壓滅菌鍋日本Tomy公司。

1.2標準儲備溶液配制

精確稱取煙酸、煙酸-D4各1 mg,用超純水溶解定容至10 mL,搖勻于4 ℃冰箱保存,6個月內使用。上述標準儲備液的濃f度均為100 μg/mL。

標準溶液由儲備液用水逐級稀釋配制,現用現配。

1.3樣品前處理

稱取谷物樣品約0.3 g于50 mL三角瓶中,加入煙酸-D4同位素標準溶液(試樣中煙酸和同位素質量相近)和30 mL 0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液搖勻溶解,在121 ℃,1 MPa條件下,水解30 min。冷卻至室溫后,溶液用5 mol/L鹽酸調pH至4.6,轉移到100 mL容量瓶中,加水定容搖勻。定容液經0.45 μm 濾紙過濾,收集濾液待上固相萃取柱。HLB固相萃取柱用2 mL甲醇活化,2 mL水平衡,控制流速在1 mL/min左右。然后將1 mL上述濾液加到固相萃取柱上,上樣后,用2 mL水淋洗固相萃取柱,最后用1 mL 35%甲醇水溶液作為洗脫液洗脫,棄去前15滴洗脫液,剩余洗脫液收集至棕色小瓶中過0.2 μm濾膜后上機分析。

1.4儀器條件

1.4.1液相條件色譜柱:Waters Acquity@HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流速:0.4 mL/min;柱溫:40 ℃;樣品溫度:15 ℃;進樣量:10 μL;流動相A:10 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)水溶液;流動相B:乙腈。梯度洗脫條件見表1。

表1　流動相梯度洗脫條件

1.4.2質譜條件離子源為電噴霧離子源(ESI);離子化模式:正離子化模式;毛細管電壓:1500 V;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣溫度:500 ℃;錐孔氣流量:50 L/h;脫溶劑氣流量:800 L/h;碰撞氣流速:0.17 mL/min;監(jiān)測方式:多反應檢測(MRM)。煙酸、煙酸-D4的定量和定性離子對、錐孔電壓、碰撞能量等參數見表2。

表2　質譜MRM參數

注:* 定量離子對。

2　結果與討論

2.1質譜條件優(yōu)化

用MRM方式進行定量時,定量離子及碰撞能量的選擇十分重要。配制200 ng/mL的煙酸標準溶液,在電噴霧源正離子檢測(ESI+)方式下,通過全掃描得到煙酸的母離子為123.9,屬于[M+H]+峰。然后對母離子進行子離子掃描,調節(jié)碰撞能量,選擇響應較高的兩個子離子作為定性定量離子。兩個離子中響應高的作為定量離子,另一個作為輔助定性離子。通過子離子掃描發(fā)現子離子m/z 80.4和子離子m/z 52.9具有較高的相對豐度,當碰撞能量為18 eV,錐孔電壓為30 V時兩者都達最大值,而m/z 80.4的最大豐度值大于m/z 52.9的最大豐度值,因此選擇m/z 80.4作為定量離子,m/z 52.9作為輔助定性離子。同理,調諧出煙酸-D4內標的定量離子、定性離子及最佳碰撞能量等參數。煙酸及煙酸-D4內標的MRM色譜圖見圖1,子離子掃描圖見圖2。

圖1　煙酸及煙酸-D4的MRM色譜圖Fig.1　MRM chromatograms of nicotinic acid and nicotinic acid-D4

圖2　煙酸和煙酸-D4的子離子掃描質譜圖Fig.2　Mass spectrum of nicotinic acid and nicotinic acid-D4

2.2提取方法優(yōu)化

0.5 mol/L H2SO4在121 ℃下水解30 min是測定食品中煙酸最常用的提取方法,但Ball[22]認為對于玉米等淀粉含量較高的樣品,堿水解提取效果更徹底,測定結果更接近樣品中總煙酸的真實含量。實驗隨機選擇5種樣品比較了酸水解與堿水解法作為樣品提取溶劑提取效果的差異,分別用0.5 mol/L的H2SO4和0.2 mol/L NaOH溶液對樣品在121 ℃下水解30 min進行處理,比較提取后的結果,結果見表3。從表3中可以看出,采用氫氧化鈉對谷物樣品進行預處理得到的總煙酸含量要比采用硫酸提取得到的含量高10%以上。這是因為,在谷物中,煙酸與小分子肽和碳水化合物以結合物形式存在,利用H2SO4溶液水解并不能將這部分煙酸完全釋放出來,而利用堿溶液則可使這部分低活性或無活性的煙酸釋放出來。實驗證明,經堿水解處理后可以大大提高這部分煙酸的利用度[23]。因此,選擇0.2 mol/L NaOH溶液對樣品在121 ℃下水解30 min作為樣品的提取方法。

表3　不同提取溶液結果

2.3固相萃取條件優(yōu)化

谷物樣品基質比較復雜,經過堿水解處理后會產生較多的干擾雜質,這些干擾物質可能會降低儀器的靈敏度,因此實驗采用固相萃取法對樣品處理液進行凈化除雜。

2.3.1固相萃取柱的選擇煙酸為水溶性維生素,具有較強的極性。根據固相萃取柱的基本特點和適用范圍,實驗選取了Waters Oasis HLB(60 mg,3cc)、Oasis WAX(60 mg,3cc)、Oasis MAX(60 mg,3cc)柱,在相同洗脫條件下,比較了各個柱子的回收率以及儀器響應值,見表4。結果發(fā)現,HLB和MAX固相萃取柱的回收率均可達到80%以上,而采用HLB固相萃取柱凈化的樣品較采用MAX萃取柱凈化的樣品具有更高的儀器響應峰面積,同時產生的色譜峰毛刺較少,峰型良好。因此,選擇HLB固相萃取柱對樣品進行凈化除雜。

表4　不同固相萃取柱回收率及響應值

2.3.2洗脫液比例選擇根據HLB固相萃取柱的特點,實驗選取了甲醇作為洗脫溶劑,分別配制體積濃度為0%、5%、35%、50%、65%、100%的甲醇水溶液對樣品進行洗脫,確定洗脫液中甲醇最佳比例,結果見表5。結果發(fā)現,使用35%的甲醇水溶液進行洗脫時,洗脫效果最佳,回收率最高且峰面積響應值最好,選擇35%的甲醇水溶液作為樣品的洗脫溶劑。

表5　不同洗脫液比較

2.4方法學驗證

2.4.1線性范圍及檢出限、定量限準確吸取煙酸標準儲備溶液,用水稀釋配制成質量濃度為0.1、10、50、100、150、200 ng/mL,煙酸-D4內標濃度均為50 ng/mL的煙酸標準溶液,以煙酸峰面積與其同位素峰面積之比乘以同位素質量濃度的乘積作為縱坐標,煙酸質量濃度為橫坐標,繪制標準曲線,得到回歸方程Y=0.134029X+0.029223,相關系數r>0.999,表明煙酸在0.1～200 ng/mL范圍內線性關系良好,適合進行定量分析。

表6　煙酸的加標回收實驗結果

表7　精密度測定結果

稀釋不同濃度的煙酸標準溶液進行進樣分析,以R(S/N)=3作為檢出限,R(S/N)=10作為定量限,得到儀器的檢出限為0.04 ng/mL,定量限為0.1 ng/mL。

圖3　煙酸標準曲線Fig.3　The calibration curve of nicotinic acid

2.4.2回收率取已知煙酸含量的玉米樣品,向其中分別添加高、中、低3個不同質量濃度的標準溶液進行回收率實驗,各個水平平行測定6次,計算加標回收率和相對標準偏差,結果見表6。煙酸三個水平的平均加標回收率在99.3%～102.6%之間,相對標準偏差均小于5%,表明該方法比較準確,適用于谷物中總煙酸的定性定量分析。

2.4.3精密度取1份玉米樣品作為實驗樣品,連續(xù)6日每日取樣1次,按照1.3的方法處理樣品后,平行測定6次,得到日內精密度以及日間精密度。日內與日間精密度見表7,測定結果的日間及日內精密度均小于10%,能滿足分析的需要。

2.4.4實際樣品測定利用所建立的方法,對市購的10種谷物樣品進行前處理后,用UPLC-MS/MS法進行測定,測定結果如表8所示。參考《中國食物成分表》中數據[24],小麥中煙酸含量一般在2000～12500 μg/100 g之間,玉米中煙酸含量一般在1200～3100 μg/100 g之間,小米中煙酸含量一般在900～2100 μg/100 g之間,大米中煙酸含量一般在1100～5000 μg/100 g,可以看出,采用所建立的方法測得的的測定值基本全部落在理論值范圍之內,說明方法具有可行性。

表8　煙酸的測定結果

3　結論

實驗建立了一種可以快速測定谷物食品中總煙酸的方法。采用堿溶液提取樣品,固相萃取法進行凈化,同時利用質譜的高選擇性,簡化了實驗步驟,獲得了穩(wěn)定良好的測定結果。該方法操作過程簡單,分析周期短,靈敏度高,重復性好,十分適合谷物中總煙酸的測定分析。

[1]Pfuhl P,K A Rcher U,H A Ring N,et al. Simultaneous determination of niacin,niacinamide and nicotinuric acid in human plasma[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2005,36(5):1045-1052.

[2]Kirkland J B. Niacin requirements for genomic stability[J]. Mutation Research & Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis,2012,733(1):14-20.

[3]Davidson M H,Rooney M,Pollock E,et al. Effect of colesevelam and niacin on low-density lipoprotein cholesterol and glycemic control in subjects with dyslipidemia and impaired fasting glucose[J]. Journal of Clinical Lipidology,2013,7(5):423-432.

[4]Bosveld-van Haandel L,Knegtering R,Kluiter H,et al. Niacin skin flushing in schizophrenic and depressed patients and healthy controls[J]. Psychiatry Research,2006,143(2):303-306.

[5]Kohlmeier M. Nutrient Metabolism:Structures,Functions,and Genetics[M]. Academic Press,2003:570-581.

[6]Sriram K,Jayanthi V,Suchitra D. Acute niacin deficiency[J].

Nutrition,1996,12(5):355-357.

[7]Tavares H,Yacubian J,Talib L L,et al. Increased phospholipase A2 activity in schizophrenia with absent response to niacin[J]. Schizophrenia Research,2003,61(1):1-6.

[8]Combs Jr G F. The vitamins:fundamental aspects in nutrition and health[J]. American Journal of Clinical Nutrition,1991,53(3):755-763.

[9]殷曉紅,楊金寶,劉波,等. 微生物法測定食品中的煙酸和煙酰胺[J]. 中國乳品工業(yè),2003,31(2):32-35.

[10]Majewski M L,Lebiedzi N Ska A. The evaluation of selected shellfish as a source of niacin in nutrition and therapy of modern human[J]. Polish Annals of Medicine,2014,21(1):14-19.

[11]Windahl K L,Trenerry V C,Ward C M. The determination of niacin in selected foods by capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography:acid extraction[J]. Food Chemistry,1999,65(2):263-270.

[12]Hirayama S,Maruyama M. Determination of a small amount of niacin in foodstuffs by high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography A,1991,588(1):171-175.

[13]Ndaw S,Bergaentzl E M,Aoud E Werner D,et al. Enzymatic extraction procedure for the liquid chromatographic determination of niacin in foodstuffs[J]. Food Chemistry,2002,78(1):129-134.

[14]中華人民共和國衛(wèi)生部. GB 5413.15-2010 嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測定[S]. 北京:中國標準出版社,2010.

[15]李全霞,崔亞娟,趙寅菲,等. 微生物法測定食品中水溶性維生素的原理及進展[J]. 食品科學,2013,34(13):338-344.

[16]周春紅,朱書強,王榮. LC-MS/MS 在食品安全分析中的應用[J]. 食品工業(yè)科技,2011,32(2):431-435.

[17]Shin H,Kim B,Lee J. Investigation of isotope dilution mass spectrometric(ID-MS)method to determine niacin in infant formula,breakfast cereals and multivitamins[J]. Food Chemistry,2013,138(2):1109-1115.

[18]Firat E,Rudolf Y,Thomas E,et al. Quantitative Investigation of Trigonelline,Nicotinic Acid,and Nicotinamide in Foods,Urine,and Plasma By Means of LC-MS/MS and Stable Isotope Dilution Analysis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56(23):11114-11121.

[19]Perrone D,Donangelo C M,Farah A. Fast Simultaneous Analysis of Caffeine,Trigonelline,Nicotinic Acid and Sucrose in Coffee By Liquid Chromatography-Mass Spectrometry[J]. Food Chemistry,2008,110(4):1030-1035.

[20]郝剛,俞蘊莉,顧炳仁. UPLC-MS/MS法測定奶粉中煙酸的含量[J]. 中國乳業(yè),2014,11(15):54-58.

[21]黃挺,張偉,劉洋,等. 液相色譜-同位素稀釋質譜法測定配方奶粉中的煙酰胺[J]. 色譜,2007,25(6):922-925.

[22]Ball G F. Vitamins in foods:analysis,bioavailability,and stability[M]. CRC Press,2005:323-326..

[23]Juraja S M,Trenerry V C,Millar R G,et al. Asia Pacific food analysis network(APFAN)training exercise:the determination of niacin in cereals by alkaline extraction and high performance liquid chromatography[J]. Journal of Food Composition and Analysis,2003,16(1):93-106.

[24]楊月欣,王光亞,潘興昌,等. 中國食物成分表[M]. 北京:北京大學醫(yī)學出版社,2009:4-13.

Determination of niacin in cereals by using ultra performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry

LIANG Min-hui,CUI Ya-juan*,LI Quan-xia,CHEN Zhao-tian,LI Dong

(Beijing Nutrition Resources Institute,Beijing 100069,China)

An ultra performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)method for determination of niacin in cereals has been developed. After spiking nicotinic acid-D4as an internal standard,samples were extracted by sodium hydroxide and purified with solid phase extraction column. The mobile phase consisted of 10 mmol/L ammonium acetate with 0.1% formic acid and acetonitrile. The niacin was identified by multiple reaction monitoring(MRM). The results showed a good linear calibration in the range of 0.1～200 ng/mL(r>0.999),the mean recoveries and the relative standard deviations were 99.3%～102.6% and 4.24%～4.74%,respectively. The limit of detection and quantification of niacin were 0.04 ng/mL and 0.1 ng/mL. This method is sensitive,time saving,and suitable for niacin determination in cereal samples.

niacin;cereals;UPLC-MS/MS

2015-03-04

梁敏慧(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品分析，E-mail：lmh29301126@163.com。

崔亞娟(1979-)，女，博士，副研究員，研究方向：食品分析，E-mail：cuiyj66@163.com。

衛(wèi)生部行業(yè)科研專項(201202012)；北京市科委科技新星計劃項目(2011059)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)12-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.001