張　嵐,王　丹,聶晶石

(1.吉林醫(yī)藥學院公共衛(wèi)生學院,吉林吉林 132013;2.吉林省中醫(yī)藥管理局二級實驗室,吉林吉林 132013;3.吉林省敦化市蠶業(yè)科技發(fā)展有限責任公司,吉林敦化 133700)

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蠶蛹蟲草片劑對體液免疫和細胞免疫功能的影響

張嵐1,2,王丹1,2,聶晶石3

(1.吉林醫(yī)藥學院公共衛(wèi)生學院,吉林吉林 132013;2.吉林省中醫(yī)藥管理局二級實驗室,吉林吉林 132013;3.吉林省敦化市蠶業(yè)科技發(fā)展有限責任公司,吉林敦化 133700)

本文研究了蛹蟲草片劑對小鼠體液免疫和細胞免疫功能影響。將雄性ICR小鼠隨機分為I、II、III三個大組,每大組隨機分為陰性對照組、蛹蟲草低(0.167 g/kg·bw)、中(0.333 g/kg·bw)、高(0.999 g/kg·bw)劑量組,每組10 只。每天灌胃一次,連續(xù)30 d。分別進行淋巴細胞轉化實驗、遲發(fā)型變態(tài)反應實驗、并測定抗體生成細胞及血清溶血素。結果表明,與陰性對照組相比,蛹蟲草片劑對ConA誘導小鼠的體重,脾臟/體重比值,胸腺/體重比值無顯著性影響(p>0.05)。蛹蟲草中、高劑量組對ConA誘導小鼠細胞免疫調(diào)節(jié)有顯著性影響(p<0.05);蠶蛹蟲草對小鼠體液免疫功能也具有一定調(diào)節(jié)作用,蛹蟲草低、中、高劑量組對抗體生成細胞作用均有顯著性影響(p<0.05),且中、高劑量組對HC50值影響有顯著性影響(p<0.05)。說明一定劑量的蛹蟲草片具有調(diào)節(jié)機體免疫能力,也為蛹蟲草片劑對小鼠免疫調(diào)節(jié)機制研究奠定基礎。

蛹蟲草片劑,體液免疫,細胞免疫

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris,CM)指寄生于鱗翅目昆蟲蛹體后能形成蟲菌復合體的真菌,也是人們通常所說的北冬蟲夏草,多出現(xiàn)在北半球的大部分地區(qū)[1]。與冬蟲夏草都屬于蟲草屬,但是屬于不同種類的藥用真菌。蛹蟲草對于寄主和生存環(huán)境并沒有嚴格的要求[2],加之蛹蟲草已實現(xiàn)大規(guī)模人工栽培,使其逐漸成為野生冬蟲夏草的替代品,由于具有極高的營養(yǎng)價值和保健功效,已被越來越多的消費者所接受[3]。蛹蟲草中目前已被確定的藥理學活性成分有多種,這其中包括蟲草素,蟲草氨基酸,多糖,大環(huán)內(nèi)脂類和麥角甾醇等[4]。蟲草素屬于核苷類物質(zhì),是蛹蟲草中的主要活性物質(zhì)之一,也是蟲草中含量最大的脫氧核苷類物質(zhì)?？蒲腥藛T曾從蛹蟲草的培養(yǎng)液中分離得到蟲草素[5],研究發(fā)現(xiàn)蟲草素能夠促進細胞分化、增強某些細胞株的抗腫瘤活性和巨噬細胞系的趨化性,具有調(diào)節(jié)機體免疫、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[6]。蛹蟲草中含有豐富的蛋白質(zhì)和多肽,在實驗動物和人體中,很多具有生物活性的蛋白質(zhì)具有抗腫瘤作用[4]。另外,蛹蟲草多糖也已經(jīng)被證明具有增強免疫系統(tǒng)、延緩衰老、抗腫瘤、抗輻射、降血糖等功能作用[7]。許多研究傾向于蛹蟲草多糖的分離純化,尤其針對不同部位多糖含量的研究[8],研究證明蛹蟲草多糖能夠潛在調(diào)節(jié)免疫反應[9]。此外,蛹蟲草中富含多達30種的微量元素,其中硒是一種極其重要的元素,硒的缺乏會引發(fā)機體發(fā)生多種疾病。經(jīng)過富硒培養(yǎng),蛹蟲草可將無機硒轉變?yōu)橛袡C硒,提高其藥用價值。綜上可以看出關于蛹蟲草單一成分的功效作用研究較多,但是關于蛹蟲草的免疫作用報道較少。目前許多慢性疾病的發(fā)生都與機體免疫力下降有直接關系,而在日常生活中通過飲食提高機體免疫力至關重要。而蛹蟲草中含有多種活性成分,本實驗室前期利用蛹蟲草的活性成分以其為原料開發(fā)蛹蟲草片保健食品,本論文將進一步研究蛹蟲草片對機體免疫力的作用,研究其增強免疫力生理活性的作用機理,為其應用于臨床實踐,實現(xiàn)蛹蟲草對多種疾病的靶向治療奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

柞蠶蛹蟲草粉敦化市蠶業(yè)科技發(fā)展有限責任公司提供。

RPM1640細胞培養(yǎng)液，小牛血清，MTT上海研瑾生物有限公司;刀豆蛋白A(ConA)，Hank’s液上海撫生酶聯(lián)試劑公司;綿羊紅細胞北京博爾西科技有限公司;補體C豚鼠血清鄭州百基生物科技有限公司;SA緩沖液百浩天生物科技有限公司;臺酚藍染色液北京美科美生物技術開發(fā)有限公司;異丙醇、生理鹽水南京安培化工科技有限公司;瓊脂糖上海江萊生物科技有限公司;行知生物科技有限公司。

二氧化碳培養(yǎng)箱上海智城;酶標儀美國伯騰;721分光光度計上海精科;離心機美國貝克曼庫爾特;手持式細胞計數(shù)器美國默克密理博。

1.2實驗方法

1.2.1蠶蛹蟲草片劑制備

1.2.2實驗動物分組及給藥方式清潔級雄性ICR小鼠160只,體重為18～22 g,由吉林大學實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(吉)-2011-0004。將動物分為I、II、III、Ⅳ四個大組,每大組40只動物。免疫I 組進行ConA 誘導的小鼠淋巴細胞轉化實驗;免疫II組進行遲發(fā)型變態(tài)反應實驗;免疫III組半數(shù)溶血值(HC50)的測定;免疫Ⅳ組抗體生成細胞數(shù)測定。每大組又隨機分為陰性對照組、蛹蟲草低、中、高劑量組,每組10 只小鼠。實驗組給藥劑量分別按人體推薦量的2.0 g/60 kg·bw(折算成人的每公斤體重劑量0.0333 g/kg·bw),5倍(0.1665 g/kg·bw)為低劑量組,10倍(0.3333 g/kg·bw)為中劑量組,30倍(0.9999 g/kg·bw)為高劑量組。每天灌胃一次,灌胃容積0.1 mL/10 g·bw,每三天稱一次體重,連續(xù)給藥30 d,陰性對照組灌胃同體積的蒸餾水。小鼠培養(yǎng)條件為:室溫20～24 ℃,濕度50%～70%。

1.2.3蠶蛹蟲草片劑對小鼠細胞免疫功能作用

1.2.3.1蠶蛹蟲草片劑對ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化實驗(MTT法)無菌取脾,置于無菌Hank’s液內(nèi),制成單個細胞懸液。經(jīng)過200目篩網(wǎng)過濾,用Hank’s液洗2次,每次在1000 r/min下離心10 min,然后將細胞懸浮于1 mL的完全培養(yǎng)液中,用臺酚藍染色計數(shù)活細胞數(shù)(95%以上),調(diào)整細胞濃度為3×106個/mL。淋巴增殖反應:將每一只小鼠脾細胞懸浮液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中,每孔1 mL,一孔加75 μL ConA液,另一孔作為對照孔,加培養(yǎng)液75 μL,置于50% CO2,37 ℃孵箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結束前4 h,每孔輕輕吸去上清液0.7 mL,加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,同時加入MTT 50 μL/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,培養(yǎng)結束后,每孔加入1 mL 酸性異丙醇,吹打混勻,使紫色結晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中,每個孔200μL,作3個平行,用酶標儀,以570 nm 波長測定光密度值。受試樣品的光密度值顯著高于對照組的光密度值,可判定該項實驗結果呈陽性。

淋巴細胞的增殖能力=ConA孔的光密度值-不加ConA孔的光密度值

1.2.3.2蠶蛹蟲草片劑對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)的影響每只小鼠用2%(v/v)綿羊紅細胞(SRBC)腹腔免疫,每只鼠注射0.2 mL(約為1×108個SRBC)。免疫后4 d,測量左后足趾部厚度,然后在測量部位皮下注射2%(v/v)SRBC,每只鼠20 μL(約為1×108個SRBC),注射后24h測量左后足趾部厚度,同一部位測量三次,取平均值。結果以攻擊前后足趾厚度的差值來表示DTH的程度,受試樣品組的差值顯著高于對照組的差值,可判定該項實驗結果呈陽性。

1.2.4蠶蛹蟲草片劑對小鼠體液免疫功能作用

1.2.4.1蠶蛹蟲草片劑對抗體生成細胞的檢測(Jerne改良玻片法)將1 mL壓積SRBC加入到5 mL豚鼠血清中,4 ℃冰箱放置30 min,每隔幾分鐘振蕩一次,離心上清,分裝后于-70 ℃保存。同時以SA緩沖液按1∶8稀釋,在清潔玻片上刷一薄層瓊脂粉,干后保存?zhèn)溆?。將壓積SRBC用生理鹽水制成2%(v/v)的細胞懸浮液,每只鼠腹腔注射0.2 mL。在實驗結束前5 d后的小鼠頸椎脫臼處死,取出脾臟,放在盛有Hank’s液的小平皿內(nèi),輕輕磨碎脾臟,制成細胞懸液,經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾,1000 r/min離心10 min,用Hank’s液洗2次,最后將細胞懸浮液在5 mL RPMI 1640培養(yǎng)液中,計算細胞將細胞濃度調(diào)整為5×106個/mL。將表層培養(yǎng)基加熱溶解后,放于45 ℃水浴保溫,與等量pH7.2,2倍濃度的Hank’s液混合,分裝小試管,每管0.5 mL,再向管內(nèi)加50 μL 10% SRBC(v/v用SA緩沖液配制)20 μL脾細胞懸液(5×106個/mL)迅速混勻傾倒于刷瓊脂糖薄層的玻片上,做平行片,待瓊脂凝固后,將玻片水平在片架上,放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1.5 h,然后用SA緩沖液稀釋劑(1∶8),加入到玻片架凹槽內(nèi),繼續(xù)溫育1.5 h后,計數(shù)溶血空斑數(shù)。用空斑數(shù)/106脾細胞來表示,受試樣品組的空斑數(shù)顯著高于對照組的空斑數(shù)。

表2　蠶蛹蟲草片劑對ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化的影響±SD,n=10)Table 2　Effect of CM on the spleen lymphocyte proliferation in ConA-treated ±SD,n=10)

1.2.4.2蠶蛹蟲草片劑對血清溶血素的測定將1 mL壓積SRBC加入到5 mL豚鼠血清中,放4 ℃冰箱30 min,每隔幾分鐘振蕩一次,離心取上清,分裝,-70 ℃保存。用時以SA液按1∶8稀釋。將壓積SRBC用生理鹽水配成2%的細胞懸浮液,每只小鼠腹腔注射0.2 mL進行免疫,5 d后,摘除眼球取血于離心管內(nèi),放置1 h,使血清充分析出,2000 r/min離心10 min,收集血清。取血用SA緩沖液稀釋200倍,將稀釋后的血清1 mL置試管內(nèi),依次加入10%(v/v)SRBC 0.5 mL,補體1 mL(用SA液按1∶8稀釋)。另設不加血清的對照管(以SA緩沖液代替)。置于37 ℃恒溫水浴中體溫30 min后,冰浴終止反應,2000 r/min離心10 min。取上清液1 mL,加都氏試劑3 mL,同時取10%(v/v)SRBC 0.25 mL加都氏試劑至4 mL,充分混勻,放置10 min后,于540 nm處以對照管作空白,分別測定各管光密度值。溶血素的量以半數(shù)溶血值(HC50)表示,按下列公式計算,受試樣品組的HC50顯著高于陰性對照組的HC50,可判定該項實驗結果陽性。

HC50=(樣品光密度值/SCBC半數(shù)溶血時間的光密度值)×稀釋倍數(shù)

2　結果與討論

2.1蠶蛹蟲草片劑對小鼠臟器系數(shù)影響

胸腺的主要功能是產(chǎn)生T淋巴細胞和分泌胸腺素,主要參與細胞免疫;脾臟中有豐富的淋巴細胞和巨噬細胞,但B淋巴細胞比例較大,因此與體液免疫關系更為密切[10]。胸腺和脾臟指數(shù)的高低取決于其中淋巴細胞增殖的程度,在一定程度上能夠反映機體免疫功能的強弱。胸腺指數(shù)降低,機體免疫功能也會下降[11]。表1表明蠶蛹蟲草片劑量組對ConA誘導小鼠的體重,脾臟/體重比值,胸腺/體重比值的影響情況。與陰性對照組相比,蠶蛹蟲草片劑量組小鼠體重、脾臟/體重比值與胸腺/體重比值變化均不顯著(p>0.05)。說明蛹蟲草片劑對于小鼠的體重,脾臟/體重比值,胸腺/體重比值的影響較小?？梢娦Q蛹蟲草片劑對ConA誘導小鼠臟器系數(shù)調(diào)節(jié)作用并不明顯。

表1蠶蛹蟲草片劑對ConA誘導

Table 1Effect of CM on the internal organ indices of

組別體重(g)脾臟/體重(mg/g)胸腺/體重(mg/g)陰性對照37.56±1.654.12±0.241.94±0.17低劑量36.38±1.994.01±0.131.71±0.12中劑量37.15±2.044.06±0.191.96±0.17高劑量36.91±1.853.92±0.141.87±0.16

注:*表示與陰性對照組相比有顯著差異,p<0.05,表2～表4同。

2.2蠶蛹蟲草片劑對ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化實驗

蠶蛹蟲草片劑對ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化的影響見表2。

表2表明蠶蛹蟲草對ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化影響。光密度值能夠反映淋巴細胞增殖程度。與陰性對照組相比,蛹蟲草低劑量組對ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化無顯著性影響(p>0.05),蛹蟲草中高劑量組具有差異顯著性(p<0.05),由此可見,中高劑量組可判定實驗結果呈陽性。隨著蛹蟲草劑量的增加,小鼠脾淋巴細胞轉化程度逐漸增加。淋巴細胞轉化實驗能夠反映蛹蟲草免疫活性機制[12]。相關研究報道黃芪多糖對脾淋巴細胞免疫功能的作用機制是通過改變細胞內(nèi)信息分子NO、Ca2+及cAMP、cGMP來實現(xiàn)的[13]。因此可以說明脾淋巴細胞轉化與細胞內(nèi)部信號分子密切相關。另外,研究報道蛹蟲草多糖能夠顯著刺激小鼠脾細胞增殖[14]。Wang等人研究報道一定劑量的醇提蛹蟲草多糖能顯著促進淋巴細胞增殖,增強血清抗體滴度,提高血清中γ-干擾素及白細胞介素的濃度,蛹蟲草多糖可以提高新城疫疫苗的免疫功效[15]。所以,蠶蛹蟲草片劑對小鼠脾淋巴細胞轉化影響可能與其中蛹蟲草多糖成分有關,但是關于其對脾淋巴細胞轉化的信號通路相關研究報道較少,有待于進一步研究,為蛹蟲草相關保健品或者免疫輔助藥物的開發(fā)奠定基礎。

表3　蠶蛹蟲草片劑對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響±SD,n=10)Table 3　Effects of CM on delayed type hypersensitivity of ±SD,n=10)

表4　蠶蛹蟲草片劑對抗體生成細胞的影響±SD,n=10)Table 4　Effect of CM on quantity ofantibody forming cells of ±SD,n=10)

表5 蠶蛹蟲草片劑對小鼠半數(shù)溶血值的影響±SD,n=10)Table 5　Effects of CM on hemolytic value(HC50)of ±SD,n=10)

2.3蠶蛹蟲草片劑對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)的影響

蠶蛹蟲草片劑對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)的影響。

綿羊紅細胞可以刺激T淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞,4 d后再以綿羊紅細胞攻擊時,攻擊部位會出現(xiàn)腫脹,其腫脹程度可反映遲發(fā)型變態(tài)反應程度,進而反應T淋巴細胞的增殖能力[16]。蠶蛹蟲草中含有蟲草素,研究發(fā)現(xiàn)蟲草素能夠抑制伴刀豆球蛋白誘導的脾細胞增殖,Th1和Th2細胞因子增殖,以及T細胞CD4+/CD8+[17]。表3實驗結果表示蠶蛹蟲草片劑對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應,隨著蠶蛹蟲草片劑劑量增加,小鼠左后足趾部厚度逐漸加厚。與陰性對照組相比,中、高劑量組的遲發(fā)型變態(tài)反應有顯著性差異(p<0.05);低劑量組無顯著性差異(p>0.05),由此可判斷實驗結果陽性。說明中高劑量蠶蛹蟲草片可以刺激T淋巴細胞增殖。遲發(fā)型變態(tài)反應與淋巴細胞轉化實驗共同反應機體細胞免疫功能,兩個實驗中蛹蟲草中、高劑量組均呈陽性,說明中、高劑量對小鼠細胞免疫功能具有顯著調(diào)節(jié)作用。

2.4蠶蛹蟲草片劑對抗體生成細胞的檢測

蠶蛹蟲草片劑對抗體生成細胞的檢測見表3。

脾臟抗體形成反映了B細胞介導的免疫應答即體液免疫。應答是指在綿羊紅細胞刺激下,抗原特異性B細胞活化增殖分化成熟為漿細胞,進而合成各類免疫球蛋白并產(chǎn)生免疫效應作用的應答過程。由表4結果顯示,與陰性對照組相比,蠶蛹蟲草片劑低、中、高劑量組空斑數(shù)升高,且差異具有顯著性(p<0.05),隨著蠶蛹蟲草劑量的增加,空斑數(shù)量逐漸增加。可見蠶蛹蟲草三個劑量組實驗均呈陽性。說明蛹蟲草能增強綿羊紅細胞(SRBC)致敏的正常小鼠空斑形成細胞產(chǎn)生抗體的數(shù)量,也可以推斷蛹蟲草能促進IgM抗體生成,提高小鼠的體液免疫功能。

2.5蠶蛹蟲草對小鼠半數(shù)溶血值的測定

蠶蛹蟲草對小鼠半數(shù)溶血值的影響見表5。

用SRBC免疫小鼠后,血清中出現(xiàn)SRBC抗體,在補體參與下,與SRBC一起孵育,可以發(fā)生溶血反應,釋放血紅蛋白。通過測定血紅蛋白含量反映動物血清中溶血素的含量,HC50可以定量地反映小鼠血清中溶血素抗體的生成量[18]。由表5可以看出蠶蛹蟲草片劑量組小鼠半數(shù)溶血值高于陰性對照組,而且隨著其劑量增加而逐漸增高。與陰性對照組比較,低劑量組小鼠半數(shù)溶血值與陰性對照組相比差異無顯著性(p>0.05);中劑量組,高劑量組小鼠半數(shù)溶血值差異具有顯著性(p<0.05),可以判定實驗結果為陽性。半數(shù)溶血值與抗體生成細胞共同反應小鼠體液免疫變化。兩者都呈陽性,說明蛹蟲草片能明顯提高實驗小鼠體液免疫功能,具有很好調(diào)節(jié)作用。

3　結論

本實驗通過研究蛹蟲草片劑對小鼠免疫功能作用,結果表明,與陰性對照組相比,蠶蛹蟲草片劑對ConA誘導小鼠的體重,脾臟/體重比值,胸腺/體重比值的影響差異無顯著性差異(p>0.05)。通過小鼠脾淋巴細胞轉化實驗和遲發(fā)型變態(tài)反應實驗發(fā)現(xiàn),蠶蛹蟲草對ConA誘導小鼠細胞免疫功能具有調(diào)節(jié)作用,尤其蠶蛹蟲草中、高劑量組實驗結果具有顯著性差異(p<0.05)。通過測定血清溶血素HC50值和抗體生成細胞發(fā)現(xiàn),蠶蛹蟲草對小鼠體液免疫功能具有一定調(diào)節(jié)作用,其中蠶蛹蟲草低、中、高劑量組對抗體生成細胞均具有顯著性差異(p<0.05),而中、高劑量組對HC50值具有顯著性差異(p<0.05)。綜上所述,一定劑量的蛹蟲草片對調(diào)節(jié)機體免疫能力具有很好的作用,同時也為減少相關疾病的發(fā)生奠定靶向作用,也為蛹蟲草片劑對小鼠免疫調(diào)節(jié)機制研究奠定基礎。

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Effect ofCordycepsmilitarison humoral immunity and cellular immunity

ZHANG Lan1,2,WANG Dan1,2,NIE Jing-shi3

(1.Department of Public and Health,Jinlin Medical college,Jilin132013,China;2.Lever Two Laboratory of Administration of Traditional Chinese Medicine of Jilin Province,Jinlin Medical College,Jilin132013,China;3.Jilin Dunhua Sericultural Sericulture Industry Development Co.,Ltd,Dunhua 133700,China)

In order to study effect ofCordycepsmilitarison humoral immunity and cellular immunity functions of mice. ICR male mice were assigned randomly to I,II,III groups. Every group was assigned to the following groups:negative control,low(0.167 g/kg·bw),medium(0.333 g/kg·bw),high(0.999 g/kg·bw)dosage CM for 30 days by intragastric infusion. Then spleen lymphocyte proliferation,delayed type hypersensitivity,quantity of antibody forming cells,and hemolytic value(HC50)were detected. The results showed thatCordycepsmilitarishad no significant effect on body weight increase,ratio of spleen weight to body weight,ratio of thymus weight to body weight(p>0.05). Medium and high dose groups had significant effect on cellular immunity(p<0.05);and had significant effect on humoral immunity,all groups had significant effect on quantity of antibody forming cells,and medium and high dose groups had significant effects on HC50(p<0.05). So it was concluded thatCordycepsmilitariscan strengthen immunity functions of mice,and lay the foundation for mechanism research of immune regulation.

Cordycepsmilitaris(CM);humoral immunity;cellular immunity

2015-07-09

張嵐(1980-),女,博士,副教授,研究方向:生物反應器與功能性食品,E-mail:lan4531@163.com。

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20130206022YY)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)05-0349-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.062