張　楊,胡　磊,汪少蕓,洪　晶

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,福建福州 350116)

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響應(yīng)面優(yōu)化酶解法制備蒲公英籽蛋白抗氧化肽工藝

張楊,胡磊,汪少蕓,洪晶*

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,福建福州 350116)

以蒲公英籽蛋白質(zhì)抽提物為原料,采用響應(yīng)面分析法(RSM)優(yōu)化酶解蒲公英籽蛋白質(zhì)制備抗氧化肽工藝。采用堿性蛋白酶酶解制備蒲公英籽抗氧化肽,以酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除力為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察酶解pH、底物濃度、酶底比及酶解溫度對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法確定酶解蒲公英籽蛋白質(zhì)制備抗氧化肽工藝,同時(shí)建立酶解工藝的二次項(xiàng)數(shù)學(xué)模型并驗(yàn)證其可靠性。以酶解時(shí)間、酶底比和酶解pH為自變量,研究這3個(gè)因素的交互作用及最佳酶解工藝條件并進(jìn)行驗(yàn)證。研究表明,對(duì)酶解蒲公英籽蛋白質(zhì)制備抗氧化肽工藝的影響因素主次順序?yàn)?pH>酶底比>酶解時(shí)間,最佳酶解工藝條件:酶解時(shí)間 4.90 h,pH8.5和酶底比7.80%。在最佳工藝條件下,酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為79.13%。

響應(yīng)面法,蒲公英籽,抗氧化肽,酶解工藝

許多人工抗氧化劑如BHT、BHA等都無(wú)法避免地帶有潛在的毒副作用。通過(guò)食源性的蛋白質(zhì)水解得到的抗氧化肽抗氧化活性高,易吸收,而且無(wú)副作用,因此成為研究新型抗氧化劑的熱點(diǎn)。通過(guò)酶解法利用植物蛋白制備高活性的抗氧化肽已有廣泛研究,如用螺旋藻蛋白[1]及玉米蛋白[2]等制備抗氧化肽。

蒲公英為菊科多年草本生植物,是我國(guó)家喻戶曉的野生蔬菜和中草藥。《千金方》、《本草綱目》等中記載蒲公英具有清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋之功效[3]。現(xiàn)代研究表明,蒲公英具有抑菌、抗腫瘤、保肝利膽、促進(jìn)腸胃動(dòng)力、提高免疫力、清除自由基延緩衰老的作用[4]。除了藥用,蒲公英還可供食用,是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的野生蔬菜。蒲公英籽作為蒲公英成熟干燥的種子,其營(yíng)養(yǎng)、活性成分組成與蒲公英全草相似。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)蒲公英全草的研究較多,而且主要研究蒲公英黃酮、多糖以及萜類化合物,而對(duì)蒲公英籽的蛋白及多肽的研究很少。因此,本文以蒲公英籽為原料,采用蛋白酶酶解法制備抗氧化肽,以DPPH自由基清除活力為考察指標(biāo),采用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),通過(guò)響應(yīng)面法分析各因素對(duì)抗氧化肽制備工藝的影響,以優(yōu)化制備工藝獲得最佳工藝條件,為蒲公英籽蛋白的綜合利用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蒲公英籽福州市種子市場(chǎng),經(jīng)中藥粉碎機(jī)粉碎成粉末后備用;中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶諾特萊斯生物科技有限公司;DPPHSigma公司;其他試劑國(guó)產(chǎn)分析純。

XZ-21K型高速冷凍離心機(jī)湘智離心機(jī)儀器有限公司;EU2600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)昂拉儀器有限公司;FE20型pH計(jì)梅特勒-托利多儀器上海有限公司;KDN-102C定氮儀纖檢儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蒲公英籽蛋白的酶解工藝堿提酸沉法提取蒲公英籽蛋白,將冷凍干燥后的蒲公英籽粗蛋白粉作為酶解的原料,酶解采用下述工藝進(jìn)行。

蛋白抽提物→酶解→滅酶→離心→上清液→酶解液

1.2.2水解度的測(cè)定甲醛滴定法[5-6]。取水解液5.0 mL于小燒杯中,加入60 mL蒸餾水,磁力攪拌下用0.01 mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定至酸度計(jì)指示pH8.2,加入pH已調(diào)至8.2的甲醛溶液20 mL,記錄將其pH滴至9.2時(shí)所消耗的0.01 mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積。計(jì)算公式:

n=(ΔV×C/W)×(V總/V)

htot=(1×Pro%)/110

DH(%)=(n-n0/htot)×100

式(1)

式中,ΔV-滴定樣品與滴定蛋白原液所消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液體積之差;C-NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mol/L);W-原料質(zhì)量(g);V總-酶解液的總體積(mL);V-滴定取用的酶解液體積(mL);n0-水解前每克蛋白游離的氨基毫摩爾數(shù)(mmol/g);n-水解后每克蛋白游離的氨基毫摩爾數(shù)(mmol/g);htot-原料蛋白質(zhì)中所含肽鍵總數(shù)(mmol/g);Pro%-樣品的蛋白質(zhì)含量;110-氨基酸平均分子量。

1.2.3抗氧化活性測(cè)定以DPPH自由基清除活力作為指標(biāo),考察蒲公英籽酶解物抗氧化能力,參照Chen等人的方法進(jìn)行測(cè)定[7]。

取0.5 mL樣品溶液,加入0.5 mL DPPH溶液(濃度為0.1 mmol/L,溶解于95%的乙醇中進(jìn)行配制),迅速振蕩、混勻后避光30 min,在517 nm處測(cè)定反應(yīng)液的吸光值,記作Ai。DPPH自由基清除活性通過(guò)下式計(jì)算:

式(2)

式中,Ai-樣品組(DPPH溶液+樣品);Aj-對(duì)照組(95%乙醇溶液+樣品);A0-空白組(DPPH溶液+去離子水)。

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)酶解步驟如1.2.1節(jié),分別對(duì)酶的種類(木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶)、底物濃度(0.5%、1%、2%、45、6%、8%)、酶底比(4%、6%、8%、10%、12%、14%)、pH(7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)和酶解溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察各因素對(duì)蛋白質(zhì)酶解工藝的影響。采用甲醛滴定法測(cè)定酶解物的水解度,按公式(1)計(jì)算。采用DPPH自由基清除活力測(cè)定酶解物的抗氧化活性,按公式(2)計(jì)算。

1.2.5響應(yīng)面法優(yōu)化蒲公英籽抗氧化肽酶解工藝實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理,采用軟件Design Expert V8.0.6建立三因素三水平實(shí)驗(yàn),確定蒲公英籽蛋白酶解最佳工藝條件。以酶解物的DPPH自由基清除率(Y,%)為考察指標(biāo),酶解時(shí)間(A),酶底比(B)及pH(C)為自變量,因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1　因素水平編碼表Table 1　Code and level of factors chosen

2　結(jié)果與討論

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1蛋白酶種類對(duì)酶解物抗氧化活性的影響選擇木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)蒲公英籽蛋白進(jìn)行酶解。4種蛋白酶對(duì)蒲公英籽蛋白的水解度與酶解物抗氧化活性隨酶解時(shí)間的變化分別如圖1、圖2所示。由圖1、圖2分析可知,堿性蛋白酶的酶解效果最好,胰蛋白酶次之,中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解效果較差,因此選擇堿性蛋白酶為最適作用酶。由堿性蛋白酶的酶解進(jìn)程曲線分析可知,其水解度在酶解4 h時(shí)達(dá)到最大后趨于平緩,而其DPPH自由基清除率在酶解4 h以后開(kāi)始下降,故最適酶解時(shí)間選擇4 h。

圖1　不同蛋白酶水解蒲公英籽蛋白的進(jìn)程曲線Fig.1　Effect of different proteases on dandelion seeds protein hydrolysis

圖2　不同蛋白酶對(duì)蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影響Fig.2　Effect of different proteases on antioxidant activity of dandelion seeds hydrolysates

2.1.2底物濃度對(duì)酶解物抗氧化活性的影響在pH10.0,酶底比8%和酶解溫度為45 ℃的條件下酶解4 h,考察不同底物濃度對(duì)蒲公英籽蛋白酶解物抗氧化活性和水解度的影響。由圖3可知,底物濃度小于2%時(shí),酶解物的DPPH自由基清除率和水解度隨底物濃度增加而增大;當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?%時(shí),其清除率和水解度基本不變甚至呈下降趨勢(shì),這是因?yàn)樵诘孜餄舛容^低時(shí),增加底物濃度能增大底物與蛋白酶接觸的機(jī)會(huì),使反應(yīng)向產(chǎn)物方向進(jìn)行,但當(dāng)?shù)孜餄舛鹊竭_(dá)飽和點(diǎn)時(shí),體系流動(dòng)性變差,反而不利于底物與酶的接觸[8],因此酶解速率下降,故最適底物濃度為2%。

圖3　底物濃度對(duì)蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影響Fig.3　Effect of substrate concentration on antioxidant activity of dandelion seeds hydrolysates

2.1.3酶底比對(duì)酶解物抗氧化活性的影響在底物濃度為2%(w/v),酶解溫度為45 ℃和pH10.0條件下酶解4 h,考察不同酶底比對(duì)蒲公英籽蛋白酶解物抗氧化活性和水解度的影響。如圖4所示,酶解物的DPPH自由基清除率和水解度隨酶量的增加而增大,當(dāng)酶底比為8%時(shí)自由基清除率和水解度都達(dá)到最大,隨后增加酶底比自由基清除率和水解度降低。這可能是因?yàn)榈孜餄舛纫欢〞r(shí),隨著酶量的不斷增加,將已生成的具有抗氧化活性的多肽進(jìn)一步酶解,生成不具有抗氧化活性或者抗氧化活性更小的肽段或氨基酸[9],因此選擇最適酶底比為8%。

圖4　酶底比對(duì)蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影響Fig.4　Effect of enzyme/substrate ratio on antioxidant activity of dandelion seeds hydrolysates

2.1.4pH對(duì)酶解物抗氧化活性的影響在底物濃度為2%(w/v),酶解溫度為45 ℃,酶底比為8%和酶解時(shí)間4 h的條件下,考察不同pH對(duì)蒲公英籽酶解物抗氧化活性和水解度的影響。結(jié)果如圖5所示,在pH為8.5時(shí),酶解產(chǎn)物的抗氧化活性和水解度都達(dá)到最大,當(dāng)pH高于或低于8.5時(shí),其抗氧化活性和水解度都呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)槊阜肿蛹暗孜锓肿拥慕怆x狀態(tài)、酶蛋白構(gòu)象等受pH的影響,進(jìn)而影響酶與底物的結(jié)合、酶穩(wěn)定性及產(chǎn)物轉(zhuǎn)化,最終影響酶促催化效果[10-11]。因此選擇最適酶解pH為8.5。

圖5　pH對(duì)蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影響Fig.5　Effect of pH on antioxidant activity of dandelionseeds hydrolysates

2.1.5酶解溫度對(duì)酶解物抗氧化活性的影響在底物濃度為2%(w/v),酶底比為8%和pH8.5的條件下酶解4 h,考察不同溫度對(duì)酶解物抗氧化活性和水解度的影響。由圖6可知,在一定范圍內(nèi),隨著溫度的上升,酶解產(chǎn)物的抗氧化活性和水解度都在增加,當(dāng)溫度高于45 ℃時(shí),其抗氧化活性和水解度都在顯著下降。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi),隨溫度升高,反應(yīng)速率增加、酶解物還原能力增強(qiáng)、水解度升高;但溫度過(guò)高會(huì)使酶失活、產(chǎn)物形成方向發(fā)生改變,導(dǎo)致水解度的下降[12]。因此最適酶解溫度選擇45 ℃。

圖6　溫度對(duì)蒲公英籽酶解物抗氧化活性的影響Fig.6　Effect of temperature on antioxidant activity of dandelion seeds hydrolysates

2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果分析

溫度、pH和酶底比是影響酶解液活性的主要因素[13],綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選用堿性蛋白酶水解蒲公英籽蛋白酶,固定底物濃度為2%(w/v),溫度為45 ℃,選酶解時(shí)間、酶底比及pH為考察因素,根據(jù)響應(yīng)面分析法Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。從單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看,水解度的變化趨勢(shì)與DPPH自由基清除率的變化趨勢(shì)基本一致,因此選擇DPPH自由基清除率為主要指標(biāo)。響應(yīng)面的設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表3　模型回歸方程方差分析Table 3　ANOVA of regression equation

注:p<0.001代表極顯著“***”;p<0.01代表較顯著“**”;p<0.05代表顯著“*”;p>0.05代表不顯著。

利用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸擬合,得到回歸模型方程:

Y=78.08-0.81X1-1.01X2-1.53X3+1.06X1X2-1.13X1X3-0.92X2X3-11.27X12-9.79X22-11.30X32

2.2.1各因素對(duì)蒲公英籽酶解液抗氧化活性的影響分析用各因素的F值可評(píng)價(jià)該因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響,F值越大,表明該因素的影響越顯著。由表3可知,F(X1)=11.09,F(X2)=17.19,F(X3)=39.82,即各因素對(duì)蒲公英籽蛋白抗氧化活性的影響順序?yàn)閜H>酶底比>酶解時(shí)間。

等高線是響應(yīng)面中水平方向的投影,等高線的形狀表明變量間的交互作用是否顯著,橢圓等高線表明變量間的交互作用顯著,圓形等高線表明交互作用不顯著[14]。由圖7至圖9可知,酶解時(shí)間、pH及酶添加量相互間的等高線都呈明顯的橢圓狀,表明三因素間具有交互作用。

表2　響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Respond surface experimental design and results

如果一個(gè)響應(yīng)曲面坡度相對(duì)平緩,表明其可以忍受處理?xiàng)l件的變異,而不影響到響應(yīng)值大小,相反,如果一個(gè)響應(yīng)曲面坡度非常陡峭,表明響應(yīng)值對(duì)于處理?xiàng)l件的改變非常敏感[15]。由圖7可知,在時(shí)間X1與酶底比X2交互作用的響應(yīng)面中,沿X2軸方向的響應(yīng)曲面的坡度明顯高于X1,說(shuō)明酶底比的變化對(duì)DPPH自由基清除率的影響相比于時(shí)間對(duì)其的影響大。從圖8和圖9中可以看出沿X3軸方向的響應(yīng)曲面比較陡峭,說(shuō)明pH的變化對(duì)DPPH自由基清除率的影響比時(shí)間和酶底比的影響大。

圖7　酶底比和酶解時(shí)間 對(duì)抗氧化肽制備工藝影響的響應(yīng)面圖(pH=8.5)Fig.7　Responsive surfaces of effect of enzyme/substrate ratio and time on preparation of antioxidant peptides(pH=8.5)

圖8　酶解時(shí)間和pH對(duì)抗氧化肽 制備工藝影響的響應(yīng)面圖(酶底比=8.0%)Fig.8　Responsive surfaces of effect of time and pH on preparation of antioxidant peptides(amount of enzyme=8.0%)

圖9　酶底比和pH對(duì)抗氧化肽 制備工藝影響的響應(yīng)面圖(時(shí)間=5.0 h)Fig.9　Responsive surfaces of effect of enzyme/substrate ratio and pH on preparation of antioxidant peptides(time=5.0 h)

綜上分析,各變量對(duì)酶解蒲公英籽蛋白質(zhì)制備抗氧化肽工藝的影響主次順序?yàn)?pH>酶底比>酶解時(shí)間。

2.2.2最佳提取條件的確定及驗(yàn)證由Design-Expert V8.0.6軟件分析得最佳實(shí)驗(yàn)條件為:酶解時(shí)間4.86 h,pH8.45和酶底比7.76%。鑒于實(shí)驗(yàn)的可操作性,將最佳酶解條件調(diào)整為:酶解時(shí)間4.90 h,pH8.5和酶底比7.80%,其理論DPPH自由基清除率為79.96%。通過(guò)多次(n>3)實(shí)驗(yàn)后測(cè)得最佳條件下蒲公英籽酶解液的DPPH自由基清除率為79.13%,與理論自由基清除率無(wú)顯著性差異,其相對(duì)誤差為0.59%,說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型回歸方程及最佳條件可靠。

3　結(jié)論

利用響應(yīng)面法建立酶解蒲公英籽蛋白質(zhì)制備抗氧化肽工藝的二次項(xiàng)數(shù)學(xué)模型。通過(guò)方差分析,該模型顯著,所得回歸方程擬合度好。影響酶解蒲公英籽蛋白質(zhì)制備抗氧化肽工藝的各因素主次順序?yàn)閜H>酶底比>酶解時(shí)間。最佳提取工藝條件是:pH8.5,酶解時(shí)間4.90 h和酶底比7.80%。在此條件下,測(cè)得蒲公英籽蛋白質(zhì)酶解物對(duì)DPPH自由基的清除率為79.13%,與理論自由基清除率(79.96%)無(wú)顯著性差異,說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)分析法得到的回歸方程能夠較好預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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Optimization of enzymolysis technology for preparation of antioxidant peptides from dandelion seeds-derived proteins by response surface methodology

ZHANG Yang,HU Lei,WANG Shao-yun,HONG Jing*

(College of Biological Science and Engineering,Fuzhou University,Fuzhou 350116,China)

The aim of this study was to optimize the hydrolysis technology of preparation of antioxidant peptides from dandelion seeds protein using response surface methodology(RSM). The protein extracted from dandelion seeds was hydrolyzed by alcalase and antioxidant activity of the hydrolysates was evaluated by DPPH radical scavenging activity. Effects of pH,substrate concentration,enzyme/substrate ratio and temperature on DPPH scavenging activity of hydrolysates were evaluated. Based on the results of the single factor experiments,a procedure optimized using the response surface analysis with three factors(pH,enzyme/substrate ratio and hydrolysis time)was conducted in order to obtain the optimal enzymolysis condition. The quadratic term model of the enzymatic preparation technology was established and the reliability was verified. The interaction effects of pH,enzyme/substrate ratio and time were investigated,and the optimal hydrolysis condition was obtained and checked out experimentally. The results indicated that the effect order of the three factors on antioxidant activity of protein hydrolysates was pH>enzyme/substrate ratio>hydrolysis time,and the optimal enzymolysis conditions were time of 4.90 h,pH8.5 and enzyme/substrate ratio of 7.80%. Under the optimal enzymolysis conditions,DPPH radical scavenging rate of the hydrolysates was 79.13%,which indicated that the protein hydrolysates possessed strong antioxidant activity.

response surface methodology;dandelion seed;enzymolysis technology;antioxidant peptides

2015-06-05

張楊(1991-),女,碩士研究生,研究方向:食品生物技術(shù),E-mail:xiah520@163.com。

洪晶(1981-),女,博士，副教授，研究方向:生物化學(xué)與分子生物學(xué),E-mail:jhong@fzu.edu.cn。

福建省科技廳資助項(xiàng)目(2013J05050)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)05-0258-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.042