寧亞萍,董施彬,李建霞,楊　喆,張喬會(huì),董潔瓊,王建中

(林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京林業(yè)大學(xué)，北京 100083)

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山杏花總黃酮抗氧化活性及其對(duì)酪氨酸酶抑制作用的研究

寧亞萍,董施彬,李建霞,楊喆,張喬會(huì),董潔瓊,王建中*

(林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京林業(yè)大學(xué)，北京 100083)

利用閃式提取法提取山杏花總黃酮,并以X-5大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離。通過(guò)測(cè)定分離前后山杏花總黃酮對(duì)DPPH自由基、羥基自由基的清除能力,總還原能力和總抗氧化能力,評(píng)價(jià)了其抗氧化活性;通過(guò)測(cè)定酪氨酸酶催化L-多巴氧化速率,以VC和β-熊果苷為陽(yáng)性對(duì)照,研究了分離前后山杏花總黃酮對(duì)體外酪氨酸酶活性的抑制作用。結(jié)果表明,分離前后山杏花總黃酮均具有一定的抗氧化活性,且分離后抗氧化活性得到明顯提高;分離前后山杏花總黃酮對(duì)酪氨酸酶的抑制能力均強(qiáng)于β-熊果苷弱于VC,其IC50值分別為2.24、3.08 mg/mL。綜上所述,分離前后山杏花總黃酮均具有一定的抗氧化活性,且能有效抑制酪氨酸酶的活性。

山杏花總黃酮,抗氧化活性,酪氨酸酶,抑制作用

山杏又稱(chēng)西伯利亞杏(Siberianapricot),薔薇科杏屬植物。山杏在我國(guó)分布范圍較廣,作為山杏附屬資源的山杏花,資源豐富[1]。但是,目前由于對(duì)山杏花的開(kāi)發(fā)利用研究較少,造成了山杏花資源的極大浪費(fèi)。

自由基可引起機(jī)體衰老,與人體的一些重大疾病例如癌癥等有一定的相關(guān)性[2-3]。天然植物中的提取物例如茶多酚、黃酮類(lèi)物質(zhì)具有良好的抗氧化性,與傳統(tǒng)的化學(xué)合成的抗氧化劑相比,安全性更高[4],因此具有良好的開(kāi)發(fā)前景。酪氨酸酶在黑色素的合成過(guò)程中起著關(guān)鍵性的作用,酪氨酸酶抑制劑可以通過(guò)抑制酪氨酸酶活性預(yù)防和治療黑色素瘤、色素沉著等,在醫(yī)藥、化妝品和食品工業(yè)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[5-6]。劉杰超等[7]以L-酪氨酸和L-多巴作為酶促反應(yīng)底物研究了桃花甲醇提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用,研究表明桃花甲醇提取物中總黃酮含量為92.28 mg/g,提取物對(duì)酪氨酸酶單酚酶和二酚酶活性IC50分別為0.057,0.030 g/L。任紅榮等[8]以L-酪氨酸為底物測(cè)定了香水蓮花水提物、醇提物及總黃酮提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率,結(jié)果表明總黃酮提取物抑制作用最強(qiáng)。

本文旨在研究山杏花總黃酮的抗氧化活性以及對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用,為山杏花在保健食品、醫(yī)藥、化妝品領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ),為山杏花資源的開(kāi)發(fā)拓寬思路。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

山杏花(采于內(nèi)蒙古包頭);1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl,DPPH),Alfa Aesar公司;羥自由基測(cè)定試劑盒南京建成生物工程研究所;2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS)北京科百奧生物技術(shù)有限公司;酪氨酸酶(25 ku),Worthington公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、過(guò)硫酸鉀、無(wú)水乙醇,均為分析純北京科百奧生物技術(shù)有限公司;X-5大孔樹(shù)脂北京科百奧生物技術(shù)有限公司;L-多巴,熊果苷,抗壞血酸北京科百奧生物技術(shù)有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

JHBE-50S 閃式提取控制器北京金鼐科技發(fā)展有限公司;SHZ-D(III)循環(huán)水式多用真空泵上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SCIENTZ-12N 冷凍干燥機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司;FA2004電子天平上海上平儀器有限公司;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;R-210 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海申順生物科技有限公司;pHSJ-3F pH計(jì)上海瀘西分析儀器。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1山杏花的脫脂預(yù)處理將山杏花置于30 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重,經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后60目過(guò)篩,用石油醚進(jìn)行索氏抽提,除去其中的油脂和部分色素,自然晾干,于4 ℃冰箱中密封保存,備用。

1.2.2山杏花總黃酮粗提物的制備運(yùn)用閃式提取器按照液料比100∶1 mL/g,乙醇體積分?jǐn)?shù)76%,閃提溫度67 ℃,閃提時(shí)間5 min的工藝條件對(duì)經(jīng)預(yù)處理的山杏花進(jìn)行提取得到粗提液,過(guò)濾,旋蒸濃縮至水相,冷凍干燥得到山杏花總黃酮粗提物。

1.2.3山杏花總黃酮粗提物的分離利用X-5大孔樹(shù)脂分離1.2.2得到的粗提物,工藝條件為上樣流速1 mL/min、pH2、質(zhì)量濃度0.7 mg/mL的樣品水溶液上樣,5 BV水洗和5 BV的95%乙醇溶液以2 mL/min洗脫。洗脫液經(jīng)旋蒸濃縮至水相,冷凍干燥得到經(jīng)分離后的粉末狀供試樣品,簡(jiǎn)稱(chēng)為山杏花總黃酮提取物。

1.2.4黃酮含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[9],以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法測(cè)定并計(jì)算粗提物及經(jīng)分離后提取物中總黃酮的含量。

1.2.5山杏花總黃酮清除DPPH自由基的測(cè)定稱(chēng)取5.0 mg粗提物、總黃酮提取物、VC和蘆丁,分別用70%乙醇定容至25 mL容量瓶中,配制成0.2 mg/mL的母液,然后用70%乙醇稀釋成10、20、30、40、60、80 μg/mL的測(cè)定液。

參考崔潔等的方法[10],每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,取平均值。

1.2.6山杏花總黃酮清除羥基自由基(·OH)的測(cè)定稱(chēng)取50.0 mg粗提物、總黃酮提取物和VC,分別用蒸餾水定容至25 mL容量瓶中,配制成2.0 mg/mL的母液,再用蒸餾水稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的測(cè)定液。

測(cè)定方法:按照羥自由基測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管吸光度。以VC作為對(duì)照。加入測(cè)定液體積為0.2 mL。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,取平均值。

1.2.7山杏花總黃酮總還原力的測(cè)定稱(chēng)取12.5 mg粗提物、總黃酮提取物和VC,分別用蒸餾水定容至25 mL容量瓶中,配制成0.5 mg/mL的母液,再用蒸餾水稀釋成20、60、100、140、180、220 μg/mL的測(cè)定液。分別取1 mL不同濃度的測(cè)定液于10 mL離心管中,加入2 mL磷酸鹽(PBS)緩沖液(0. 2 mol/L,pH6. 6)和2 mL 1%鐵氰化鉀溶液,混勻,50 ℃水浴20 min,加入2 mL10%三氯乙酸溶液,混勻,迅速冷卻。然后取2 mL上述混合液于10 mL離心管中,加入2 mL蒸餾水和0. 4 mL 0. 1%的三氯化鐵溶液,混勻,在700 nm處測(cè)定其吸光度(A700)。以A700表示測(cè)定樣品的還原能力,以蒸餾水為空白,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,取平均值[11-12]。吸光度越高,說(shuō)明還原力越強(qiáng),則抗氧化性越強(qiáng)[13]。

1.2.8ABTS法測(cè)定山杏花總黃酮總抗氧化能力稱(chēng)取12.5 mg粗提物、總黃酮提取物和VC,分別用70%乙醇定容至25 mL容量瓶中,配制成0.5 mg/mL的母液,再用70%乙醇稀釋成所需濃度梯度的測(cè)定液。

ABTS工作液的配制:稱(chēng)取0.0384 g ABTS,蒸餾水定容到10 mL容量瓶;稱(chēng)取0.0331 g過(guò)硫酸鉀,蒸餾水定容到50 mL容量瓶;取適量上述兩種溶液等體積混合,避光放置14 h;取混合液(混合液現(xiàn)配現(xiàn)用),加無(wú)水乙醇稀釋至其在734 nm處測(cè)得的吸光度為0.70±0.02即可使用。

測(cè)定方法:取1.0 mL不同濃度的測(cè)定液于10 mL離心管中,加4.0 mL ABTS工作液,充分振蕩,室溫靜置6 min,在734 nm測(cè)量吸光度。以無(wú)水乙醇作為空白,以VC作陽(yáng)性對(duì)照,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,取平均值[14-15]。公式如下:

清除率(%)=(1-A1/A0)×100

式中:A0為空白樣的吸光度;A1為測(cè)定樣的吸光度。

1.2.9山杏花總黃酮對(duì)酪氨酸酶的抑制作用酪氨酸酶活力以催化L-多巴氧化反應(yīng)生成多巴醌的二酚酶活力來(lái)衡量,以β-熊果苷和VC作陽(yáng)性對(duì)照。稱(chēng)取100.0 mg的粗提物、總黃酮提取物和VC,分別用蒸餾水定容至10 mL容量瓶中,配制成10.0 mg/mL的母液,再用蒸餾水稀釋成所需濃度梯度的測(cè)定液。β-熊果苷用無(wú)水乙醇溶解配制成10.0 mg/mL的母液,用蒸餾水稀釋成所需濃度梯度。L-多巴和酪氨酸酶均用磷酸鹽(PBS)緩沖液(0. 2 mol/L,pH6. 8)溶解,分別配制成1.0 mg/mL和186 U/mL。按照表1進(jìn)行操作:

表1　實(shí)驗(yàn)操作表Table 1　Experimental operation table

30 ℃水浴10 min后,加入0.2 mL酪氨酸酶溶液,靜置反應(yīng)1 min,迅速轉(zhuǎn)移至比色皿中在475 nm處測(cè)吸光度值[16-17]。計(jì)算公式如下:

式中,A1、A2、A3、A4分別為實(shí)驗(yàn)組1、2、3、4反應(yīng)體系的吸光度。

1.2.10IC50的計(jì)算IC50是指清除率為50%時(shí)所需的樣品濃度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)計(jì)算得到的清除率,運(yùn)用SPSS17.0軟件處理,計(jì)算樣品的半數(shù)清除濃度(IC50)。

1.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel2007和SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1粗提物與分離后得到的總黃酮提取物中的總黃酮含量

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度(c,mg/mL)與吸光值(A)的回歸方程為A=11.929c-0.0059(R2=0.9992)。

根據(jù)測(cè)定及計(jì)算結(jié)果可知,1g粗提物中總黃酮含量為0.29g(RSD=1.26%),1g經(jīng)分離后得到的總黃酮提取物中總黃酮含量為0.93g(RSD=1.92%)。

2.2山杏花總黃酮抗氧化結(jié)果分析

2.2.1對(duì)DPPH自由基的清除能力測(cè)定結(jié)果DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基,其乙醇溶液在517nm處有強(qiáng)烈吸收。自由基清除劑能提供一個(gè)電子與DPPH的孤對(duì)電子配對(duì)使其褪色,褪色程度與其接受的電子呈定量關(guān)系[18]。

由圖1可知,分離前后山杏花總黃酮均有一定的清除DPPH自由基的能力。分離前后山杏花總黃酮清除DPPH·的能力均隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng),且在10～60μg/mL的范圍內(nèi)具有一定的線性關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為60μg/mL時(shí),純化后的山杏花總黃酮對(duì)DPPH·的清除率已達(dá)到90.18%。分離后的山杏花總黃酮在質(zhì)量濃度大于60μg/mL時(shí),對(duì)DPPH·的清除能力與VC相接近。分離前后山杏花總黃酮清除DPPH自由基的IC50值分別為71.35、22.10μg/mL,VC的IC50值為10.09μg/mL?？芍?jīng)過(guò)分離,山杏花總黃酮清除DPPH自由基的能力得到了明顯提高,其具有較強(qiáng)的清除DPPH·的能力。

圖1　分離前后山杏花總黃酮清除DPPH自由基的能力Fig.1　The scavenging effect of separated and unseparated total flavonoids from Siberian apricot flowers on DPPH·

2.2.2對(duì)羥基自由基(·OH)的清除能力測(cè)定結(jié)果從圖2可以看出,在0.2～1.2 mg/mL的范圍內(nèi),VC、分離前后的山杏花總黃酮對(duì)·OH的清除率隨質(zhì)量濃度的增大不斷增大,在0.2～0.6 mg/mL范圍內(nèi)上升較快。在0.6～1.2 mg/mL的范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度的增大,分離前后山杏花總黃酮對(duì)·OH的清除率之間的差異逐漸減小。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí),分離前后山杏總黃酮的清除率分別達(dá)到80.88%、85.66%,其清除·OH的IC50值分別為0.48、0.27 mg/mL,VC的IC50值為0.24 mg/mL。說(shuō)明分離前后山杏花總黃酮都具有較強(qiáng)的清除·OH的能力,且分離后的山杏花總黃酮的清除能力得到了很大提高,且IC50值與VC相近,但兩者均弱于VC。

圖2　分離前后山杏花總黃酮清除羥基自由基的能力Fig.2　The scavenging effect of separated and unseparated total flavonoids from Siberian apricot flowers on·OH

2.2.3總還原力測(cè)定結(jié)果由圖3可知,各質(zhì)量濃度分離前后的山杏花總黃酮、VC均具有一定的還原能力,其還原能力與質(zhì)量濃度在20～220 μg/mL范圍內(nèi)均具有一定的線性相關(guān)性。隨著質(zhì)量濃度的增大,三者的還原能力均不斷增大,且分離后山杏花總黃酮的還原能力始終優(yōu)于純化前,但弱于VC。

圖3　分離前后山杏花總黃酮的總還原能力Fig.3　Total reduction capacity of separated and unseparated total flavonoids from Siberian apricot flowers

2.2.4總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果ABTS經(jīng)活性氧氧化可生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽(yáng)離子自由基ABTS+·,當(dāng)存在自由基清除劑時(shí),會(huì)與ABTS+·發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色。ABTS+·在734 nm處有最大吸收,可檢測(cè)其吸光度的變化[19]。

從圖4可以看出,在10～50 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),分離前后山杏花總黃酮的質(zhì)量濃度與對(duì)ABTS+·的清除率有明顯的量效關(guān)系。隨著質(zhì)量濃度的增加,清除率均呈上升趨勢(shì),但分離前的山杏花總黃酮清除ABTS+·始終弱于純化后的。VC清除ABTS+·極強(qiáng),當(dāng)質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí),清除率已達(dá)99.24%。當(dāng)質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí),分離后的山杏花總黃酮對(duì)ABTS+·的清除率為95.48%,與VC相當(dāng),說(shuō)明分離后的山杏花總黃酮對(duì)ABTS+·的清除能力也是很強(qiáng)的。從圖4可知,分離后山杏花總黃酮及VC的IC50值分別為20.61、5.99 μg/mL。

圖4　分離前后山杏花總黃酮的總抗氧化能力Fig.4　Total antioxidant capacity of separated and unseparated total flavonoids from Siberian apricot flowers

2.3對(duì)酪氨酸酶活性抑制能力的測(cè)定結(jié)果

從圖5c可以看出,在1.0～6.0 mg/mL范圍內(nèi),隨著質(zhì)量濃度的增大,分離前后山杏花總黃酮對(duì)酪氨酸酶活性的抑制能力均逐漸增大。當(dāng)質(zhì)量濃度小于3.0 mg/mL時(shí),分離前的山杏花總黃酮對(duì)酪氨酸酶的抑制效果優(yōu)于分離后,其原因可能是在低質(zhì)量濃度下分離前的粗提物里還含有多糖等物質(zhì),某些多糖與黃酮類(lèi)物質(zhì)在協(xié)同作用下抑制酪氨酸酶的能力更強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度大于4.0 mg/mL時(shí),分離后的山杏花總黃酮的抑制效果優(yōu)于分離前,其原因可能是隨著濃度的增大,相比于分離前,分離后山杏花總黃酮中具有較強(qiáng)抑制酪氨酸酶能力的某些黃酮類(lèi)物質(zhì)的濃度相對(duì)增大。

圖5　四種物質(zhì)對(duì)酪氨酸酶活性的抑制能力Fig.5　The inhibitory effect of four substances on tyrosinase activity注：a:VC;b:β-熊果苷；c:分離前后山杏花總黃酮。

由圖5根據(jù)計(jì)算得出四種物質(zhì)的IC50值如表2所示,可知分離后的山杏花總黃酮的IC50值是β-熊果苷的10.3%,是VC的40.5倍。說(shuō)明分離前后山杏花總黃酮均有較強(qiáng)的抑制酪氨酸酶活性的能力。

表2　四種物質(zhì)抑制酪氨酸酶的IC50值Table 2　The concentration of four substances required to inhibit tyrosinase activity by 50%

3　結(jié)論

分離前后的山杏花總黃酮均具有一定的抗氧化活性,且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi),隨濃度的增大活性逐漸增強(qiáng)。經(jīng)X-5大孔樹(shù)脂分離后,山杏花總黃酮的抗氧化活性得到了明顯提高,但分離前后山杏花總黃酮的抗氧化活性均低于天然類(lèi)的抗氧化劑VC;分離前后的山杏花總黃酮對(duì)酪氨酸酶活性均具有一定的抑制能力,在一定范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度增大,抑制率逐漸升高,其IC50值分別為2.24、3.08 mg/mL,且抑制能力強(qiáng)于β-熊果苷弱于VC。

鑒于山杏花總黃酮具有較好的體外抗氧化活性以及對(duì)酪氨酸酶的抑制能力,今后可以對(duì)其進(jìn)一步分離純化、進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定以及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),為山杏花在醫(yī)藥、化妝品、保健食品等領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用提供更多的科學(xué)依據(jù)與理論指導(dǎo)。

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Antioxidant activity and inhibitory activity on Tyrosinase of total flavonoids fromSiberianApricotflowers

NING Ya-ping,DONG Shi-bin,LI Jian-xia,YANG Zhe,ZHANG Qiao-hui,DONG Jie-qiong,WANG Jian-zhong*

(Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety,College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

Total flavonoids fromSiberianapricotflowers were extracted with the method of flash extraction and purified with X-5 macroporous resins.The antioxidant activity of separated and unseparated total flavonoids fromSiberianapricotflowers were investigated by measuring scavenging effect on DPPH·and OH·,total reduction capacity,total antioxidant capacity and the inhibitory effect on tyrosinase activity was studied by measuring the rate of tyrosinase catalyzedL-DOPA oxidation taking VCandβ-arbutin as positive controls. The results showed that separated and unseparated total flavonoids fromSiberianapricotflowers had a certain antioxidant activity. After separation,the antioxidant activity was improved obviously,the inhibitory effect on tyrosinase of separated and unseparated total flavonoids fromSiberianapricotflowers was better thanβ-arbutin but worse than VC. Their half maximal inhibitory concentration(IC50)were 2.24,3.08 mg/mL,respectively. In conclusion,separated and unseparated total flavonoids fromSiberianapricotflowers had a certain antioxidant activity and can effectively inhibit tyrosinase activity.

total flavonoids fromSiberianapricotflowers;antioxidant activity;tyrosinase;inhibitory effect

2015-07-09

寧亞萍(1989-)，女，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)與利用,E-mail:nypszb@163.com。

王建中(1952-)，男，碩士，教授，研究方向：林產(chǎn)品加工利用,E-mail:w62338221@163.com。

林業(yè)公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201004081)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)05-0104-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.012