李　娟,盧士玲,王慶玲,*,孫丹丹,侯扶琴

(1.新疆石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832000; 2.新疆喀爾萬食品科技有限公司,新疆石河子 832000)

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真空包裝牛肉冷藏過程理化和微生物變化

李娟1,盧士玲1,王慶玲1,*,孫丹丹1,侯扶琴2

(1.新疆石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832000; 2.新疆喀爾萬食品科技有限公司,新疆石河子 832000)

將牛肉真空包裝貯藏在4 ℃條件下,每3 d測(cè)定其pH、揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)、菌落總數(shù),并利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電脈(PCR-DGGE)技術(shù)來研究其貯藏過程的菌相變化。結(jié)果表明:4 ℃條件下,真空包裝冷卻牛肉菌落總數(shù)在12 d超過6.0 lg cfu/g,pH在貯藏21 d時(shí)超過6.0,TVB-N在貯藏18 d時(shí)超過25 mg/100 g,根據(jù)理化指標(biāo)結(jié)果顯示可知真空包裝冷卻牛肉貯藏期為12 d;貯藏初期主要存在蒼白桿菌、巨球菌、Boseavestrisii;貯藏末期主要含有成團(tuán)泛菌、乳酸桿菌、熱死環(huán)絲菌、慢生根瘤菌屬、廣布肉桿菌、美洲愛文氏菌、拉恩氏菌、腸桿菌。

PCR-DGGE,菌相,理化指標(biāo),真空包裝,冷卻牛肉,貯藏時(shí)間

牛肉含有優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、維生素B和礦物質(zhì)如鋅,硒,磷和鐵,能提高機(jī)體抗病能力?？v觀各類食用肉中消費(fèi)量中,牛肉消費(fèi)量排名第三僅次于豬肉和家禽肉,且中國為牛肉消費(fèi)大國,據(jù)統(tǒng)計(jì)新疆2003年牛肉產(chǎn)量為37.8萬噸同比增長4.4%[1-3]。

研究表明,牛肉在貯藏過程中其質(zhì)量、安全、營養(yǎng)狀況在很大程度上受到內(nèi)因以及外因的制約,內(nèi)因如牛肉中存在的酶、牛肉的纖維結(jié)構(gòu),外因如前處理、包裝方式、貯藏溫度等。牛肉在貯藏過程中理化性質(zhì)以及微生物菌群在不同時(shí)期會(huì)發(fā)生不同變化,而這些變化也暗示著肉的品質(zhì)變化,預(yù)示著牛肉食用的安全期,因此,研究牛肉在貯藏過程中的理化指標(biāo)與微生物指標(biāo)非常重要[4-5]。

本實(shí)驗(yàn)將利用 pH、TVB-N來評(píng)價(jià)牛肉貯藏過程中理化指標(biāo)變化,細(xì)菌總數(shù)、微生物種類來研究貯藏過程的微生物變化。

然而,自然界只有1%左右的細(xì)菌能夠用傳統(tǒng)的培養(yǎng)的方法鑒別,具有費(fèi)時(shí)、費(fèi)力等局限性;16S rDNA和變性梯度凝膠電泳是一種基于DNA的指紋圖譜技術(shù),該技術(shù)理論上,在合適的溫度與梯度條件下能夠?qū)⒕哂幸粋€(gè)堿基差異的DNA在聚丙烯酰胺膠上分開,簡化了細(xì)菌的鑒定,為研究貯藏過程中的菌相變化提供了便捷方法[6-7]。目前將DGGE技術(shù)應(yīng)用于研究鮮肉牛變質(zhì)過程菌相變化已有研究[8]。

因此,本實(shí)驗(yàn)主要目的是利用理化指標(biāo)結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)分析4 ℃下真空包裝牛肉的貯藏期及貯藏期內(nèi)的菌相變化,為客觀評(píng)價(jià)喀爾萬公司出廠牛肉的貯藏期以及哪些微生物導(dǎo)致牛肉品質(zhì)變化提供理論基礎(chǔ),也為進(jìn)一步研究保鮮劑的選擇及使用提供一定科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

牛肉喀爾萬食品科技有限公司;PCA培養(yǎng)基;瓊脂糖Biowest;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒TIANGEN;聚丙烯酰胺回收試劑盒康為世紀(jì)生物科技有限公司;溶菌酶、尿素、過硫酸胺Solarbio;PCR相關(guān)試劑、DGGE相關(guān)試劑均為分析純;所用引物均由上海生工合成。

D-37520高速冷凍離心機(jī)德國LED熱電子公司;PCR儀美國Barloworld Scientific有限公司;Bio-RadDcode apparatus DGGE電泳儀、GelDoc 2000system凝膠成像儀美國Bio-Rad公司;DYY-8C水平電泳儀北京市六一儀器廠;SW-CF-1F超凈工作臺(tái)、海爾控溫冰箱、ZXRD-7-80搖床上海智誠有限公司;DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱、LDZX-40Ⅱ壓力滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠;DZ-400/2C真空包裝機(jī)上海青浦食品包裝機(jī)械廠;HI8424NEW pH計(jì)上海加惠儀器儀表有限公司；半微量凱氏定氮儀北京市通潤源機(jī)電技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品處理牛肉后腿肉為當(dāng)日清晨屠宰2 h內(nèi)的肉,無菌操作條件下剔除多余脂肪,分成100 g左右的肉塊,真空包裝后貯藏于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2pH測(cè)定分別于0、3、6、9、12、15、18、21和24 d取肉樣10 g無菌剪刀剪碎,放入裝有90 mL蒸餾水的錐形瓶中,混勻振蕩30 min,過濾后測(cè)其pH。重復(fù)三次,取平均值[9]。參考標(biāo)準(zhǔn):一級(jí)鮮度pH5.4～5.6;二級(jí)鮮度 pH5.7～5.9;變質(zhì)肉pH≥6.0[4]。

1.2.3揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)測(cè)定采用GB/T 5009.44-2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中的半微量凱氏定氮法,分別于0、3、6、9、12、15、18、21和24 d測(cè)定牛肉中的總揮發(fā)性鹽基氮。參考標(biāo)準(zhǔn):一級(jí)鮮肉≤15 mg/100 g,二級(jí)鮮肉≤20 mg/100 g,變質(zhì)肉≥20 mg/100 g。

1.2.4細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定分別于0、3、6、9、12、15、18、21和24 d無菌條件下取25 g肉樣(兩個(gè)平行),無菌剪刀剪碎,加入225 mL滅菌生理鹽水112 r/min搖床振搖30 min。取1 mL上清液進(jìn)行10倍梯度稀釋,選擇合適的稀釋梯度,每個(gè)稀釋度2個(gè)重復(fù),采用PCA培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)48 h[10]。培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)數(shù),結(jié)果以lg cfu/g表示。指標(biāo)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為:參考標(biāo)準(zhǔn)為:一級(jí)鮮度<4.0 lg cfu/g,二級(jí)鮮度 4.0～6.0 lg cfu/g,變質(zhì)肉>6.0 lg cfu/g。

1.2.5細(xì)菌總DNA提取根據(jù)Vitor[11]等方法略有修改。肉樣(無菌操作取10 g樣品,無菌剪刀剪碎,放入90 mL滅菌生理鹽水中)112 r/min搖床振搖30 min,靜置5 min,取上清液4 ℃,2000×g離心5 min,取上清液于4 ℃,10000×g離心15 min,取沉淀于1.5 mL離心管中參照DNA提取試劑盒說明提取細(xì)菌總DNA。所提取的DNA溶于TE緩沖液中,于-20 ℃貯藏備用。

1.2.6PCR擴(kuò)增上游引物為帶GC夾子的U968,下游引物為L1401。對(duì)細(xì)菌的16S rRNA的V6～V8區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,條帶片段約為450 bp。

上游引物GC(U968為5′-CGC CCG GGG CGC GCCCCG GGC GGG GCGGGG GCA CGG GGG GAA CGCGAA GAA CCTTAC-3′;下游引物L(fēng)1401為5′-CGG TGT GTACAA GACCC-3′。

PCR反應(yīng)體系為25 μL:DNA模板1 μL,GC-U968和L1401各1 μL,PCR Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 mL。

PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性2 min,35個(gè)循環(huán)(94 ℃、30 s,60 ℃、30 s,72 ℃、30 min),最終72 ℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)后于-20 ℃貯藏備用。

1.2.7變性梯度凝膠電泳(DGGE)參照Wang[12]等方法稍作改動(dòng),對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V6～V8的擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行DGGE分析。采用Biorad Dcode apparatus電泳儀,聚丙烯酰胺膠濃度為8%(丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺37.5∶1),變性梯度為38%～58%(100%變性劑含有7 mol/L尿素和40%甲酰胺),在0.5×TAE緩沖液中,60 ℃恒溫條件下,200 V電壓下電泳10 min,85 V電壓下電泳16 h。

電泳結(jié)束后,將DGGE膠片用含0.5 mg/L溴化乙啶(Ethidium bromide,EB)染色20 min?；厥杖疽?之后將DGGE膠片用ddH2O漂洗三次,每次5 min。

1.2.8DNA回收與純化將EB染色的DGGE膠片放置于紫外燈下用無菌手術(shù)刀切下不同位置的條帶,分別放入1.5 mL的滅菌離心管中,用聚丙烯酰胺回收試劑盒回收膠條,備用。

取3 μL回收的DNA為模板進(jìn)行16S rRNAV6-V8區(qū)域擴(kuò)增,引物為U968(5′-AAC GCG AAG AAC CTTAC-3′),L1401(5′-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3′),PCR擴(kuò)增程序同1.2.6。產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖檢驗(yàn)后送往北京華大基因測(cè)序部測(cè)序。登錄NCBI,將所得序列與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行相似性比對(duì)。

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用BioEdit、Quantity one 4.6.2、Origin 8.6進(jìn)行處理。

2　結(jié)果與分析

2.1pH

由圖1可知,貯藏0 d的牛肉pH為5.98,隨著貯藏時(shí)間的延長pH先下降后上升。pH先下降是因?yàn)樘窃徒猱a(chǎn)生乳酸,三磷酸腺苷分解產(chǎn)生磷酸,乳酸和磷酸逐漸積累,從而使肉的pH下降。隨著牛肉成熟期的延長,肉中的蛋白質(zhì)在細(xì)菌、酶作用下被分解為氨和胺類化合物等堿性物質(zhì)而使pH升高,從圖1中也可知,從第15 d牛肉的pH迅速升高。

圖1　真空包裝冷卻牛肉貯藏過程中pH變化Fig.1　Change of pH value in vacuum-packaged chilled beef during storage

2.2揮發(fā)性鹽基氮

從圖2可見,冷卻牛肉中揮發(fā)性鹽基氮含量隨貯藏時(shí)間的增加而增加,這是由于氨及胺類物質(zhì)的產(chǎn)生。TVB-N在第12 d時(shí)迅速升高,在15 d時(shí)達(dá)到23.46 mg/100 g。結(jié)合圖1、圖2可以看出,在貯藏15 d內(nèi)pH隨著TVB-N含量的增加而降低,15 d后pH逐漸增加。以pH為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)的真空包裝冷卻牛肉在21 d才超出6.0,但以TVB-N為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)的真空包裝冷卻牛肉卻在15 d時(shí)已經(jīng)超過25 mg/100 g。

圖2　真空包裝冷卻牛肉貯藏過程中揮發(fā)性鹽基氮變化Fig.2　The change of TVB-N in vacuum-packaged chilled beef during storage

2.3菌落總數(shù)

從圖3可以看出,隨著貯藏時(shí)間的延長,菌落總數(shù)呈不斷增長的趨勢(shì)。由于環(huán)境的改變,微生物需要適應(yīng)新的環(huán)境即遲滯期,而使得前6 d微生物數(shù)量變化不大,從第9 d開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期,第12 d時(shí)有明顯的增長。在12 d菌落數(shù)已經(jīng)超過6.0 lg cfu/g。從pH、TVB-N、菌落總數(shù)結(jié)果可以看出,以不同指標(biāo)來衡量真空包裝冷卻牛肉的貯藏期存在顯著差異,因此需結(jié)合pH、TVB-N值及菌落總數(shù)來綜合判斷肉的新鮮度。

圖3　真空包裝冷卻牛肉貯藏過程中菌落計(jì)數(shù)Fig.3　Counts of total colonies in vacuum-packaged chilled beef during storage

2.4PCR-DGGE圖譜分析

由圖4可知,貯藏初期條帶也相對(duì)較多,表明牛肉樣品中初始微生物種類相對(duì)較多,隨著貯藏時(shí)間的延長,一部分條帶變?nèi)趸蛳?一部分條帶由弱變強(qiáng),還出現(xiàn)了一些新條帶,表明在貯藏過程菌相組成發(fā)生了變化。對(duì)圖4中標(biāo)記的條帶1～18割膠、擴(kuò)增、測(cè)序并在NCBI基因庫中進(jìn)行相似性比較,結(jié)果如表1所示。由表1可知未知序列與已知序列相似性較高。

圖4　真空包裝冷卻牛肉16S rRNA基因V6～V8區(qū)DGGE圖譜Fig.4　DGGE profile of PCR products for the V6～V8 region of 16S rRNA gene extractedfrom vacuum-packaged chilled beef

結(jié)合表1可知貯藏初期真空包裝冷卻牛肉中主要存在蒼白桿菌(條帶5)、巨球菌(條帶10)、Boseavestrisii(條帶14),還有一些測(cè)序失敗條帶,圖中未標(biāo)注,表明貯藏初期牛肉中的細(xì)菌種類相對(duì)較多。

隨著貯藏時(shí)間的推移,哈夫尼(條帶1)、檸檬酸桿菌(條帶3)、蒼白桿菌(條帶5)、顆粒鏈桿菌(條帶8)、胖桿菌(條帶7)、拉恩氏菌(條帶16)、不動(dòng)桿菌(條帶18)在貯藏過程中間歇性出現(xiàn)或消失。

表1　DGGE條帶分離的主要細(xì)菌16S rRNA基因序列相似性比較

至貯藏后期主要優(yōu)勢(shì)菌為成團(tuán)泛菌(條帶2)、克雷伯氏菌(條帶4)、乳酸桿菌(條帶6)、熱死環(huán)絲菌(條帶9)、慢生根瘤菌屬(條帶12)、廣布肉桿菌(條帶13)、美洲愛文氏菌(條帶15)、腸桿菌(條帶17)。說明在貯藏過程中微生物的種類發(fā)生了變化,而這些變化可能與貯藏過程肉的酸堿度變化、肉本身所含有的營養(yǎng)物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、維生素等)、肉的水分活度、真空包裝內(nèi)的氣體成分變化、肉中的酶有關(guān)。

3　討論

本研究利用理化指標(biāo)及菌落總數(shù)結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)來探討真空包裝冷卻牛肉的貯藏期以及在貯藏期內(nèi)的微生物變化。結(jié)果表明,真空包裝冷卻牛肉的貯藏期為12 d左右,貯藏末期主要有成團(tuán)泛菌、拉恩氏菌、乳酸桿菌、熱死環(huán)絲菌、Bradyrhizobiaceae、廣布肉桿菌、美洲愛文氏菌、腸桿菌。根據(jù)Barakat[13]等研究發(fā)現(xiàn)真空包裝的畜禽肉在貯藏末期主要存在廣布肉桿菌、居魚肉桿菌、格氏乳球菌、乳酸乳球菌、糞腸球菌。Yuemei[5]等研究發(fā)現(xiàn)真空包裝鯉魚貯藏末期主要存在肉桿菌、氣單胞、愛文氏菌、乳酸菌、假單胞且貯藏期為12 d。Vasileios[14]表明包裝冷卻食品22 ℃條件下貯藏期為5 d且貯藏末期主要存在Leuconostocgasicomitatum、Leuconostocgelidum、Lactococcuspiscium。Fan Zhao[15]研究表明真空包裝冷卻豬肉貯藏期為21 d,貯藏第7 d為微生物多樣性的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn),主要有微球菌、黃桿菌、腸桿菌、乳酸菌、肉桿菌。貯藏中細(xì)菌種類不同這可能是由于取樣的環(huán)境、初始微生物種類以及樣品不同等引起的菌相不完全相同。

Gill[16]研究表明真空包裝的條件下為乳酸菌、腸桿菌、腐敗希瓦氏菌、熱死環(huán)絲菌的生長提供了有利條件。真空包裝冷卻牛肉貯藏過程中,菌落總數(shù)不斷增加根據(jù)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)在貯藏12 d已經(jīng)超過6 lg cfu/g。pH在5.4～5.7的牛肉能夠保持良好的冷卻肉品質(zhì),雖然高pH更適合于加工,但好品質(zhì)的牛肉比生產(chǎn)價(jià)值更重要。本實(shí)驗(yàn)中pH在貯藏初期處較高后下降再上升,這是由于貯藏過程糖酵解產(chǎn)生酸,酸濃度與pH成正比與肉品質(zhì)成反比[17]。大多數(shù)腐敗衛(wèi)生物的最低生長pH為5.5,有的也能在pH<5的條件下生長,如Clostridiumfrigidicarnis[18]。揮發(fā)性鹽基氮在貯藏過程不斷上升,這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在微生物的作用下產(chǎn)生氨及胺類物質(zhì)。當(dāng)糖原酵解、三磷酸腺苷分解產(chǎn)生乳酸、磷酸,酸性環(huán)境為乳酸菌的生長提供了有利條件,乳酸菌利用肉中的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物乳酸使肉中的pH進(jìn)一步下降,但真空包裝肉中的糖原及三磷酸腺苷是有限的,隨著蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)生堿性物質(zhì),堿與酸發(fā)生酸堿結(jié)合從而使pH上升,這也為一些腐敗微菌的生長提供了條件[19]。熱死環(huán)絲菌是一種兼性厭氧菌能夠在高鹽(10%)、低pH(5.5～6.5)、4 ℃低溫條件下生長,在真空包裝下也能利用有限氧氣代謝,產(chǎn)生不良?xì)馕禰16]。因此,熱死環(huán)絲菌也是肉類腐敗的一個(gè)指標(biāo)[20]。Jones等[21]發(fā)現(xiàn)清酒乳桿菌存在于貯藏12周的真空包裝牛肉中,因此乳桿菌也是肉類腐敗的指標(biāo)。

4　結(jié)論

菌落總數(shù)在第12 d達(dá)到6.4 lg cfu/g,第21 d的pH為6.18,TVB-N值在15 d已經(jīng)超過了20 mg/100 g,因此,中和微生物指標(biāo)與理化指標(biāo)可知真空包裝冷卻牛肉貯藏期為12 d左右;真空包裝牛肉貯藏初期微生物種類較少,有蒼白桿菌、Boseavestrisii、巨球菌;隨著貯藏時(shí)間延長肉的理化指標(biāo)降低在貯藏末期主要含有成團(tuán)泛菌、乳酸桿菌、熱死環(huán)絲菌、Bradyrhizobiaceae、廣布肉桿菌、美洲愛文氏菌、拉恩氏菌、腸桿菌;真空包裝冷卻牛肉貯藏過程中,肉中酸堿度變化為某些細(xì)菌的生提供了有利條件,如熱死環(huán)絲菌、乳酸菌。

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Physicochemical and microflora change of vacuum-packaged beef during chilled storage

LI Juan1,LU Shi-ling1,WANG Qing-ling1,*,SUN Dan-dan1,HOU Fu-qin2

(1.Food College of Shihezi Uninersity,Shihezi 832000,China; 2.Xinjiang Calvin Wan Food Science and Technology Co.,Ltd.,Shihezi 832000,China)

The microfloral change was explored by PCR-denaturing gradient gel eletrophoresis(PCR-DGGE)and pH,TVB-N,the total number of colonies were measured every three days in vacuum-packaged beef at 4 ℃. Results showed that,vacuum-packaged beef storaged at 4 ℃,the total number of colonies during the twelfth days of storage had more than 6.0 lg cfu/g,pH during the twenty-first days of storage more than 6.0,TVB-N during the eighteenth days of storage more than 25 mg/100 g,according to physical and chemical indicators showed that vacuum packaged chilled beef storage period for 12 days.Ochrobactrumsp.,Boseavestrisii,Macrococcuscaseolyticuspredominated in early stage during chilled storage,whereas in the end of storage periodPantoeaagglomerans,Brochothrixthermosphacta,Carnobacteriumdivergens,Bradyrhizobiaceae,Lactobacillussp.,EwingellaAmericana,Rahnellaaquatilis,Enterobacteriaceaepredominated.

PCR-DGGE;microfloral;physical and chemical indexes;vacuum package;chilled beef;storage time

2015-11-09

李娟(1989-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全，E-mail:948733770@qq.com。

王慶玲(1981- )，女, 博士, 副教授，研究方向：食品安全與檢測(cè)，E-mail:Qingling1100@163.com。

宰后牛肉品質(zhì)控制技術(shù)及應(yīng)用研究(2014GY04)。

TS205.7

A

1002-0306(2016)10-0324-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.058