胡彥新,劉小莉,王　英,董明盛,周劍忠,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,江蘇南京 210095,2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇南京 210014)

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香腸乳桿菌(Lactobacillusfarcimini)FM-MM4產(chǎn)細菌素發(fā)酵條件和培養(yǎng)基優(yōu)化

胡彥新1,2,劉小莉2,王英2,董明盛1,周劍忠1,2,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,江蘇南京 210095,2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇南京 210014)

為提高香腸乳桿菌FM-MM4(lactobacillusfarciminisFM-MM4)乳酸菌素的產(chǎn)量,以金黃色葡萄球菌為指示菌,抑菌圈直徑為考察目標,對香腸乳桿菌FM-MM4所產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基成份進行優(yōu)化。利用單因素實驗和正交實驗優(yōu)化發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和起始pH;在Plackett-Burman實驗基礎上,利用響應面法優(yōu)化酵母粉、葡萄糖和乙酸鈉。獲得最佳的發(fā)酵條件:發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間24 h、發(fā)酵起始pH7,最佳培養(yǎng)基配方:葡萄糖24.40 g/L、酵母粉4.34 g/L、乙酸鈉5.05 g/L,其他成分保持不變。在此條件下,細菌素抑菌圈直徑達18.64 mm,較優(yōu)化前提高了40.13%。

細菌素,香腸乳桿菌,響應面,發(fā)酵條件,培養(yǎng)基優(yōu)化

發(fā)酵酸肉是侗族傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品的代表,它是經(jīng)過乳酸菌、酵母菌、葡萄球菌等多種微生物自然發(fā)酵而成,風味獨特,營養(yǎng)豐富,保質(zhì)期可達數(shù)年之久。研究表明,發(fā)酵酸肉具有較長保質(zhì)期的原因主要是酸肉中的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸形成較低的pH,另外,乳酸菌代謝過程中能夠產(chǎn)生抑制其它細菌生長的抑菌物質(zhì)細菌素[1],也有利于延長保質(zhì)期。前期從侗族酸肉中分離出一株對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、志賀氏菌等均有抑菌作用的香腸乳桿菌FM-MM4,該菌具有良好的熱、酸穩(wěn)定性,為鮮魚保鮮和食品生物防腐劑方面提供良好的應用前景。

眾多因素影響乳酸菌產(chǎn)細菌素的能力和產(chǎn)量,除了乳酸菌自身的遺傳特性的影響外,還受發(fā)酵條件的影響,如發(fā)酵溫度、初始pH、發(fā)酵時間[2-3]、培養(yǎng)基成分[4]等。本研究對香腸乳桿菌FM-MM4產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基成份進行優(yōu)化,通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化發(fā)酵條件[5],通過Plackett-Burman實驗和響應面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基[6-8],得到該菌產(chǎn)細菌素的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù),為該細菌素和同類抑菌物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

香腸乳桿菌FM-MM4(lactobacillusfarciminisFM-MM4)分離于侗族酸肉;指示菌金黃色葡萄球菌(StapHylococcusaureus)江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工所食品生物工程研究室保藏;NaOH、HCl國產(chǎn)分析純;MRS 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司。

DSX-280B立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器材廠;SW-CJ-2G超凈工作臺蘇州凈化設備有限公司;LRH-150生化培養(yǎng)箱蘇州凈化設備有限公司;3K15高速冷凍離心機美國Sigma公司。

1.2香腸乳桿菌FM-MM4的發(fā)酵流程

1.3發(fā)酵條件的確定

1.3.1單因素實驗發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、培養(yǎng)基初始pH、接種量[2-5]等影響乳酸菌產(chǎn)細菌素的能力和產(chǎn)量主要因素進行單因素實驗,以選取正交實驗的因素和水平。

采用1.2方法下的流程培養(yǎng)香腸乳桿菌FM-MM4,固定反應條件為接種量2%、發(fā)酵時間28 h、培養(yǎng)基初始pH7,考察不同發(fā)酵溫度(20、25、30、37、42 ℃)對細菌素產(chǎn)量的影響;固定反應條件為接種量2%、發(fā)酵溫度30 ℃、培養(yǎng)基初始pH7,考察不同發(fā)酵時間(4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、32、36 h)對細菌素產(chǎn)量的影響;固定反應條件為接種量2%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間24 h,考察不同培養(yǎng)基初始pH(4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0)對細菌素產(chǎn)量的影響;固定反應條件為發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間24 h、培養(yǎng)基初始pH7,考察不同接種量(1%、2%、4%、6%、8%)對細菌素產(chǎn)量的影響;

1.3.2正交實驗設計根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取發(fā)酵溫度、發(fā)酵起始pH、發(fā)酵時間3個因素,并選取適當?shù)?水平,設計L9(33)正交實驗(表1),優(yōu)化香腸乳桿菌FM-MM4產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件。

表1　正交實驗因素水平表

1.4發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

1.4.1Plackett-Burman實驗參照Chadha[9]的實驗方法,應用Plackett-Burman設計實驗確定發(fā)酵培養(yǎng)基的主要影響因子,實驗變量數(shù)為19,其中包括10個培養(yǎng)基成分和9個虛擬因素,10個因素編碼水平見表2,應用Design Expert進行數(shù)據(jù)分析,響應值為細菌素的抑菌圈直徑Y(jié)。

表2　Plackett-Burman實驗因素水平及編碼

1.4.2響應面法優(yōu)化培養(yǎng)基成分根據(jù)Plackett-Burman實驗結(jié)果,由于培養(yǎng)基初始pH在1.3.2部分已優(yōu)化,故選取選葡萄糖(X1)、酵母粉(X2)、乙酸鈉(X3)3個因素為自變量,以細菌素的抑菌圈直徑為響應值,進行Box-Benhnken實驗,實驗因素水平及編碼見表3。

表3　實驗因素水平及編碼

1.5抑菌活性的測定

發(fā)酵液10000 r/min離心10 min取上清液,用0.22 μm濾膜過濾去除菌體,用1 mol/L NaOH調(diào)上清液的pH為6.0,采用瓊脂擴散牛津杯法[9-10]測定排酸后上清液抑菌活性,以抑菌圈直徑為考察目標,每個樣品設三個重復,取均值。

1.6數(shù)據(jù)處理

采用SAS 8.0軟件進行單因素方差分析和差異顯著性分析,采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面分析。

2　結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵條件的確定

2.1.1單因素實驗

2.1.1.1發(fā)酵溫度的影響溫度對微生物代謝產(chǎn)物合成主要體現(xiàn)在兩個方面:溫度較低時,微生物生長緩慢,發(fā)酵周期延長。溫度過高時,會影響菌體代謝過程中某些酶的活性,降低細菌素的產(chǎn)生。由圖1可知,發(fā)酵溫度對細菌素的產(chǎn)量影響顯著(p<0.05),香腸乳桿菌FM-MM4在發(fā)酵溫度為30 ℃時,抑菌活性最高(15.85 mm)。

圖1　不同發(fā)酵溫度對香腸乳桿菌FM-MM4產(chǎn)細菌素的影響Fig.1　Effect of culture temperature on bacteriocin produced by Lactobacillus farciminis FM-MM4注:圖中a、b、c等字母不同,表示差異顯著 (p<0.05)；圖2～圖4同。

2.1.1.2發(fā)酵時間的影響由圖2可知,發(fā)酵時間對細菌素的產(chǎn)量影響顯著(p<0.05),香腸乳桿菌FM-MM4在8 h左右開始產(chǎn)生細菌素,隨著發(fā)酵時間的延長,細菌素的產(chǎn)量持續(xù)增加,在24 h產(chǎn)量達到最大值,此后,細菌素的產(chǎn)量不斷下降。細菌素在生長后期抑菌活性降低可能由兩個方面造成,其一,菌體生長進入衰亡期,菌體大量死亡和自溶,細菌素部分被分解。其二,部分細菌素吸附在菌體細胞表面[12],導致發(fā)酵上清液抑菌活性降低。

圖2　不同發(fā)酵時間對香腸乳桿菌FM-MM4產(chǎn)細菌素的影響Fig.2　Effect of culture time on bacteriocin produced by Lactobacillus farciminis FM-MM4

2.1.1.3發(fā)酵液初始pH的影響由圖3可知,初始pH對該菌株產(chǎn)細菌素的影響顯著(p<0.05),香腸乳桿菌FM-MM4在pH7左右時細菌素抑菌活性最大,過酸和過堿都會導致細菌素抑菌活性的降低,其原因可能是過酸、過堿可能會導致某些酶失活,也會影響菌體細胞對細菌素的吸附能力。

2.1.1.4接種量的影響由圖4可知,接種量為4%時,細菌素的抑菌活性較高,但方差分析結(jié)果顯示不同接種量對該細菌素的合成影響不顯著(p>0.05)。接種量的大小主要影響微生物的生長周期,接種量大時,會縮短微生物發(fā)酵培養(yǎng)周期,但細菌素的合成受菌體細胞群體感應調(diào)節(jié)[13]。采用不同的接種量培養(yǎng)24 h后,各處理的菌體數(shù)量基本一致,所合成的細菌素的量也基本一致。

圖3　不同初始pH對香腸乳桿菌FM-MM4產(chǎn)細菌素的影響Fig.4　Effect of initial pH on bacteriocin produced by Lactobacillus farciminis FM-MM4

圖4　不同接種量對香腸乳桿菌FM-MM4產(chǎn)細菌素的影響Fig.4　Effect of inoculum amount on bacteriocin produced by Lactobacillus farciminis FM-MM4

2.1.2正交實驗由表4可以看出,產(chǎn)細菌素的最佳發(fā)酵條件為A2B2C2。極差分析顯示,pH對細菌素抑菌活性影響最大。驗證實驗表明,最優(yōu)條件下的抑菌圈直徑達17.50 mm。相關(guān)研究表明,細菌素在低于菌體最適生長溫度條件下產(chǎn)量較高[14-16],這與細菌素的合成機制有關(guān),并且不同菌株產(chǎn)細菌素最適溫度不一樣[17-18]。

表5　Plackett-Burman實驗結(jié)果

表4　正交實驗分組及結(jié)果

2.2發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

2.2.1Plackett-Burman實驗結(jié)果分析采用Design-Expert 8.0.6軟件對Plackett-Burman(虛擬項未列出)進行回歸分析,結(jié)果見表5。得到各影響因子的偏回歸系數(shù)及其顯著性,結(jié)果見表6。根據(jù)各因素對響應值顯著性檢驗結(jié)果的p值來判斷各因子對實驗影響的程度,由表6可知,A3(酵母粉)、A4(葡萄糖)、A5(乙酸鈉)為主要影響因子,其中葡萄糖差異極顯著,從表中回歸系數(shù)值可以看出酵母粉對響應值的影響為負效應,葡萄糖和乙酸鈉為正效應,對于不顯著的因素在之后的實驗中濃度保持初始水平。

表6　回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析

2.2.2響應面模型的建立及其方差分析采用Box-Behnken實驗設計及結(jié)果見表7,利用Design Expert 8.0.6對其進行多元回歸擬合,獲得響應值抑菌圈直徑(Y)對自變量X1、X2、X3的二次多項回歸方程Y=18.56-0.17X1-0.71X2+0.12X3+0.075X1X2+0.44X1X3+0.25X2X3-1.48X12-1.62X22-1.29X32。

表7　響應面設計及結(jié)果

對上述回歸模型進行方差分析,結(jié)果見表8,結(jié)果表明,模型是極顯著的(p<0.0001),失擬項不顯著(p=0.1792),回歸模型的決定系數(shù)為0.9885,說明該模型能解釋99.85%的變化,該模型擬合程度良好,實驗誤差小,用該模型對香腸乳桿菌FM-MM4發(fā)酵條件進行優(yōu)化是合適的。

表8　回歸模型方差分析表

模型回歸系數(shù)顯著性分析見表9,由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知;模型一次項X2極顯著,X1、X3不顯著,二次項X12、X22、X32均極顯著,交叉項X1X3顯著,X1X2、X2X3不顯著,二次項系數(shù)顯著性明顯高于一次項系數(shù)和交叉項系數(shù),說明該模型呈現(xiàn)出拋物面的可能在最高,由二次項系數(shù)的p值可知,X1、X2、X3在極值可能性都高達99.99%。

表9　回歸方程系數(shù)顯著性檢驗表

圖5　葡萄糖和乙酸鈉對抑菌圈直徑影響的響應面圖Fig.5　Response surface for the effect of cross-interaction between glucose and sodium acetate on diameter of antibacterial circle

2.2.3響應面分析通過二次多項回歸方程所得到的響應面見圖5(X1X2和X2X3不顯著,未列出),由圖5可知,X1X3兩個因素的交叉項顯著,葡萄糖約在(15,25),乙酸鈉約在(2,4),二者存在顯著增效作用,呈現(xiàn)正相關(guān);而葡萄糖約在(25,35),乙酸鈉約在(4,8),該菌的抑菌活性隨二者的增長而降低,最大抑菌圈直徑約為18.60 mm。

2.2.4發(fā)酵條件的優(yōu)化及模型驗證當葡萄糖、酵母粉、乙酸鈉的取值范圍分別設定在15～35、2～8、2～8 g/L,并將目標值即抑菌圈直徑設定為最大值,軟件給出5組最優(yōu)組合,并提供了預測值(表10),從表可以看出,最優(yōu)組合為葡萄糖24.40 g/L、酵母粉4.34 g/L、乙酸鈉5.05 g/L,按照優(yōu)化后的參數(shù)進行發(fā)酵,發(fā)酵液抑菌圈直徑為18.64 mm,與預測值相接近,說明優(yōu)化后的預測模型可靠,較優(yōu)化前提高了40.13%。

表10　各成分最佳組合及預測結(jié)果

3　結(jié)論

3.1通過單因素實驗和正交實驗確定香腸乳桿菌FM-MM4產(chǎn)細菌素的最佳發(fā)酵條件:發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間24 h、接種量4%、起始pH7。

3.2利用Plackett-Burman實驗篩選出培養(yǎng)基中對細菌素抑菌活性具有顯著影響的主要是葡萄糖、酵母粉和乙酸鈉。

3.3在Plackett-Burman實驗的基礎上,利用響應面法對培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化,建立抑菌圈直徑與葡萄糖、酵母粉和乙酸鈉3個因素的二次多項式回歸模型,并驗證這個模型是合理可靠的。確定香腸乳桿菌FM-MM4產(chǎn)細菌素的最佳培養(yǎng)基配方:葡萄糖24.40 g/L、酵母粉4.34 g/L、乙酸鈉5.05 g/L,其他成分保持不變。在此條件下,細菌素抑菌圈直徑達18.64 mm,較優(yōu)化前提高了40.13%。

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Optimization on fermentation conditions and medium for bacteriocin produced byLactobacillusfarcimini

HU Yan-xin1,2,LIU Xiao-li2,WANG Ying2,DONG Ming-sheng1,ZHOU Jian-zhong1,2,*

(1.College of Food Science and Technology,Nanjing Agriculture University,Nanjing 210095,China; 2.The Research Institute of Agricultural Product Processing,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China)

In order to improve the production of bacteriocin ofLactobacillusfarciminisFM-MM4,the fermentation conditions and components of medium were optimized.Staphylococcusaureuswas used as indicator bacteria and diameter of inhibition zone was used as evaluation index of antibacterial activity. The single factor test and orthogonal test were used to optimize the culture temperature,culture time and initial pH. Based on the Plackett-Burman experiment,the optimal condition for producing antibacteria components was obtained by response surface methodology with three variables of yeast powder,glucose and sodium acetate. The optimized fermentation conditions and medium component were fermentation temperature 30 ℃,initial pH7,fermentation time 24 h,glucose 24.40 g/L,yeast powder 4.34 g/L,sodium acetate 5.05 g/L. Under these optimal conditions,the diameter of inhibition zone reached up to 18.64 mm,raised by 40.13% compared that produced under the original fermentation conditions.

bacteriocin;Lactobacillusfarcimini;response surface methodology;fermentation condition;medium optimization

2015-11-24

胡彥新(1990-)，男，在讀碩士，研究方向：食品微生物，E-mail：2014108085@njau.edu.cn。

周劍忠(1965-)，男，博士，研究員，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：zjzluck@126.com。

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項目(CX(14)2118)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)10-0255-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.043