張　政,劉宇佳,陳　超,郭　妍,趙風云1,,*

(1. 甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院,蘭州甘肅 730070; 2.昆明理工大學食品安全研究院,云南昆明 650500; 3.華南農業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510641; 4.華南農業(yè)大學應用化學系,廣東廣州 510641)

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云南中蜂與意蜂石榴蜜理化性質及體外抗氧化差異性研究

張政1,2,3,劉宇佳4,陳超2,郭妍2,趙風云1,2,*

(1. 甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院,蘭州甘肅 730070; 2.昆明理工大學食品安全研究院,云南昆明 650500; 3.華南農業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510641; 4.華南農業(yè)大學應用化學系,廣東廣州 510641)

本文對云南蒙自地區(qū)中華蜜蜂與意大利蜜蜂在同一地點采集的石榴蜜進行理化指標及體外抗氧化活性研究,結果表明:中蜂石榴蜜的灰分、酸度、總酚、果糖含量顯著高于意蜂石榴蜜,而葡萄糖含量、淀粉酶值、氨基酸總量以及必需氨基酸含量顯著低于意蜂石榴蜜。體外抗氧化實驗表明,中蜂石榴蜜的羥自由基清除能力和還原力均高于意蜂石榴蜜,而DPPH自由基清除能力低于意蜂石榴蜜。本研究首次報道了同一采集環(huán)境下的中、意蜂石榴蜜的差異性,為云南特色蜂蜜的開發(fā)利用提供了理論依據。

石榴蜜,中華蜜蜂,意大利蜜蜂,理化指標,抗氧化活性

蜂蜜指蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露,與自身分泌物混合后,經充分釀造而成的天然甜物質[1],其主要成分為果糖、葡萄糖及少量蔗糖,還含有氨基酸、類黃酮、多酚類、活性酶等超過180種活性物質[2],具有抗氧化、抗菌、增強免疫力等多種功效[3]。

中華蜜蜂(Apisceranaceraca,簡稱中蜂)是我國最具優(yōu)勢,分布最廣的本土蜜蜂資源。西方蜜蜂原產于歐、非洲,因有較高的生產性能,于19世紀末引入我國,西方蜜蜂中意大利蜜蜂(A.melliferaligustica,簡稱意蜂)是我國目前飼養(yǎng)的主要蜂種[4]。中蜂與意蜂同屬于蜜蜂屬的不同亞種[5],但兩種蜜蜂生存環(huán)境的差異影響了它們的進化結果,從而造成許多行為學、生物學等方面的差異,進一步導致了中、意蜂蜂蜜的差異。蜜蜂屬各種類都具有在蜂群間互相盜蜜的行為,又稱盜蜂[6]。當中蜂、意蜂同場飼養(yǎng)時,容易產生盜蜂現象,故同一地點飼養(yǎng)的中、意蜂所產蜂蜜的對比研究鮮有報道。

云南蒙自是全國石榴種植面積最大的地區(qū)之一[7],在中蜂或意蜂的授粉作用下,生產出云南特色蜂蜜——石榴蜜(Punicagranatumhoney),該地區(qū)通過科學管理在實驗蜂場同時飼養(yǎng)了中蜂和意蜂,本文對比了兩種蜜蜂在相同時間生產的石榴蜜的理化性質及體外抗氧化能力的差異性,旨為消費者科學選購蜂蜜提供參考,并可補充云南特色蜂蜜產品研究的不足。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮石榴蜜于2014年5月采自云南省農科院蜜蜂研究所實驗蜂場,中蜂與意蜂蜂場直徑距離約300 m,從不同蜂箱采集中蜂和意蜂石榴蜜各5個樣本,所有樣本均為封蓋成熟蜜;試劑均為市售分析純;果糖、葡萄糖和蔗糖標準品購自貴州迪大生物科技有限公司;乙腈色譜純,產于美國TEDIA公司;實驗用水均為超純水。

AL204型電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UPHW-I-90T優(yōu)普系列超純水機成都超純科技有限公司;TU1901型雙束紫外可見分光光度計北京普析通用有限責任公司;835-50型氨基酸自動分析儀日立(中國)研究開發(fā)有限公司;Agilent 1260高效液相色譜儀-示差折光檢測器(HPLC-RI)美國安捷倫儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1石榴蜜中理化指標的測定葡萄糖、果糖和蔗糖含量測定:采用HPLC-RI法進行測定。色譜柱為Carbomix Pb-NP糖柱7.8 cm×300 mm;流動相為超純水,使用前過濾并超聲脫氣;流速為0.450 mL/min;示差折光檢測器溫度為30 ℃;進樣量為10 μL。

氨基酸含量測定:采用氨基酸自動分析儀。

總酚含量測定:采用Folin-Ciocalteu法[8],以沒食子酸為標準品。

水分、灰分、酸度、淀粉酶值的測定均參照GH/T 18796-2012。

1.2.2石榴蜜的體外抗氧化能力測定

1.2.2.1羥自由基清除力參照Smirnoff N等[9]的方法測定。取1 mL稀釋為一定濃度梯度的蜂蜜溶液,依次加入0.3 mL 8 mmol/L的FeSO4,0.25 mL 20 mmol/L的H2O2,l mL 3 mmol/L水楊酸,混勻,37 ℃水浴30 min,取出,冷卻,加入0.45 mL的蒸餾水,混勻,2000 r/min離心10 min,取上清液于510 nm測吸光度。以蒸餾水代替樣品作為空白。以VC作為陽性對照。清除率(%)=(1-A樣/A對照)×100,IC50值表示清除率為50%時蜂蜜/VC濃度。

1.2.2.2DPPH自由基清除力參照Rodrigo S等[10]的方法測定。取0.4 mL稀釋為一定濃度梯度的蜂蜜溶液,加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液,混勻,暗處放置30 min并不斷震蕩,在517 nm處測其吸光值。以蒸餾水代替樣品作為空白。以VC作為陽性對照。清除率計算公式為:清除率(%)=(1-A樣/A對照)×100,IC50值表示清除率為50%時蜂蜜/VC濃度。

1.2.2.3還原力參照Jing H等[11]的方法測定。FRAP工作液的制備:300 mmol/L醋酸鹽緩沖液(3.1 g的乙酸鈉+16 mL冰乙酸,用蒸餾水定容到1000 mL,pH3.6),10 mmol/L的TPTZ的40 mmol/L HCl溶液,20 mmol/L的FeCl3溶液,用時以10∶1∶1的體積比混合,并37 ℃預熱備用。量取0.15 mL稀釋為一定濃度梯度的蜂蜜溶液,加入4.5 mL預熱至37 ℃的FRAP 工作液,搖勻后,37 ℃水浴反應10 min,于593 nm處測定反應液吸光值,以蒸餾水代替樣品作為空白。以VC作為陽性對照,以0～1000 μmol/L FeSO4-TPTZ復合物在593 nm處的吸光值為參考標準,蜂蜜的還原能力以達到同樣吸光值所對應的FRAP值(μmol/L FeSO4)來表示,FRAP值越大,還原能力越強。EC50值表示還原能力為500 μmol/L FeSO4時所對應的蜂蜜/VC濃度。

1.3數據統計

每個實驗重復三次,測定結果表示為平均值±標準差。實驗數據的統計利用Microsoft Office 2010軟件,顯著性分析利用SPSS 17.0軟件,差異顯著性水平為p<0.05。

2　結果與分析

2.1中蜂和意蜂釀制石榴蜜理化指標分析

通過對中、意蜂石榴蜜的各項理化指標進行測定,結果如表1所示,中蜂石榴蜜的灰分、酸度、總酚、果糖含量顯著(p<0.05)高于意蜂石榴蜜,葡萄糖含量和淀粉酶值顯著(p<0.05)低于意蜂石榴蜜,兩種石榴蜜的水分和蔗糖含量之間沒有顯著差異。

2.2中蜂與意蜂釀制石榴蜜的氨基酸分析

實驗對比了中、意蜂石榴蜜樣品中的氨基酸種類與含量。由表2可知,中蜂石榴蜜樣品中氨基酸的總量為10.011 mg/g,主要含有Asp、Glu、Leu,占總含量的56.16%;必需氨基酸含量為2.913 g/mg,占總含量的29.10%。意蜂石榴蜜樣品中氨基酸總量為12.848 mg/g,主要含有Asp、Glu、Pro、Tyr、Leu,占總含量的59.44%;必需氨基酸含量為4.026 g/mg,占總含量的31.34%。

表1　中蜂與意蜂釀制石榴蜜的理化指標對比

注:每個指標表示為平均值±標準差,n=5。同一行不同字母代表數值間的差異顯著(p<0.05)。

表2　中蜂與意蜂釀制石榴蜜的氨基酸含量對比

注:*為人體必需氨基酸;“-”代表未檢出。

2.3中蜂與意蜂釀制石榴蜜體外抗氧化活性

2.3.1羥基自由基清除能力實驗對比了同一地點飼養(yǎng)的中蜂與意蜂石榴蜜樣品在0～0.05 g/mL濃度范圍內對羥自由基的清除作用。由圖1可知,隨著蜂蜜濃度的增加,兩者對羥自由基的清除率先上升后趨于平緩。當濃度達到0.049 g/mL時,中、意蜂石榴蜜對羥自由基的清除率分別達到了78.41%和76.76%。中、意蜂石榴蜜對羥自由基均有一定清除能力,對曲線進行擬合,求得IC50值分別為0.0154 g/mL和0.0189 g/mL,中蜂石榴蜜對羥自由基的清除能力強于意蜂石榴蜜。

圖1　中蜂與意蜂石榴蜜對羥自由基的清除能力對比Fig.1　Scavenging ability to hydroxyl free radical of P. granatum honey between A. cerana cerana and A. mellifera ligustica

2.3.2DPPH自由基清除能力對比中、意蜂石榴蜜在0～0.30 g/mL濃度范圍內對DPPH自由基的清除能力,如圖2所示,中、意蜂石榴蜜對DPPH自由基有不同程度的清除作用,且清除率隨樣品濃度的升高而變大。中、意蜂石榴蜜的IC50值分別為0.2033 g/mL和0.1688 g/mL,意蜂石榴蜜對DPPH自由基的清除能力強于中蜂石榴蜜。

圖2　中蜂與意蜂石榴蜜對DPPH自由基的清除能力對比Fig.2　Scavenging ability to DPPH free radical of P. granatum honey between A. cerana cerana and A. mellifera ligustica

2.3.3還原力對比中、意蜂石榴蜜在0～0.50 g/mL濃度范圍內的還原力,由圖3可知,隨著樣品濃度提高,其吸光值增大,呈現良好的線性關系。對曲線進行擬合,求出吸光值在0.5時所需樣品的濃度值(EC50),分別為中蜂石榴蜜0.1074 g/mL,意蜂石榴蜜0.0980 g/mL。中蜂石榴蜜的還原力略高于意蜂石榴蜜。

表3　中蜂與意蜂石榴蜜羥自由基、DPPH自由基、還原力與總酚的相關性分析

圖3　中蜂與意蜂石榴蜜的還原力對比Fig.3　Reducing power of P. granatum honey between A. cerana cerana and A. mellifera ligustica

2.3.4羥自由基、DPPH自由基、還原力與總酚的相關性分析通過分析中、意蜂石榴蜜的抗氧化能力與其總酚含量之間的相關性,結果如表3所示。蜂蜜中總酚含量與羥自由基清除能力,DPPH自由基清除能力以及還原力都有良好的線性相關性。中、意蜂石榴蜜的總酚含量與還原力的相關性較為明顯,相關系數分別為R2=0.9812和R2=0.9956。

3　討論

3.1中蜂與意蜂石榴蜜理化指標差異性分析

蜜蜂通過翅膀扇風除去水分是蜂蜜釀造的重要過程,最終使成熟蜜的水分含量降至20%以下。意蜂從巢內向巢外抽風除水的效率高于中蜂從巢外向巢內鼓風的方式[12],造成中蜂蜂蜜釀造時間較長,可能促進有機酸類物質的生成,從而使得中蜂石榴蜜酸度較意蜂高。蜂箱內部溫度約為30～34 ℃,中蜂釀造時間較長的特點也可能導致蜂蜜中酶活性降低,從而造成中蜂石榴蜜淀粉酶值較意蜂低。

中、意蜂石榴蜜中灰分、葡萄糖、果糖的差異可能來源于兩種蜜蜂采集蜜源植物種類的差異。相對意蜂,中蜂更善于利用零星蜜源和低濃度花蜜,中蜂石榴蜜中可能混有較多蜜源植物種類的花蜜,造成兩種石榴蜜中葡萄糖、果糖含量的差異。本課題組前期研究表明,在相同采集環(huán)境下,中蜂蜂蜜中的花粉濃度及種類均高于意蜂蜂蜜[13],這可能是導致中蜂石榴蜜中灰分偏高的原因。本文檢測出兩種石榴蜜中均含有17種氨基酸,可能來源于花粉、酶類及蜜蜂殘骸等,但主要來自于哪一類還有待于進一步研究。

3.2中蜂與意蜂石榴蜜的體外抗氧化能力的差異性分析

已有研究報道,酚類化合物在蜂蜜抗氧化能力中起到主要的作用[14],這與本實驗分析得到多酚含量與蜂蜜抗氧化能力有較好相關性的結論相一致。A-Rahaman等[15]研究表明,顏色深的蜂蜜較顏色淺的蜂蜜含有的總酚和總黃酮高,抗氧化能力強;這與本實驗過程中發(fā)現中蜂石榴蜜顏色較意蜂石榴蜜深,其總酚含量、對羥基自由基清除力和還原力均大于意蜂石榴蜜的結果相一致。實驗中所測得中蜂石榴蜜對DPPH自由基清除力低于意蜂石榴蜜,這可能是因為蜂蜜對DPPH自由基的清除力不僅與總酚含量有密切的關系,也與所含酚類化合物的結構有很大關系,并非所有的酚類化合物都具有相同的清除自由基功效[16]。

蜂蜜中的其他成分,如抗壞血酸、類胡蘿卜素、多肽等物質,也會起到一定的抗氧化作用,各種抗氧化成分之間存在著協同增效作用,這些成分對抗氧化活性的貢獻程度尚未明確,有必要進一步研究蜂蜜抗氧化能力與其所含抗氧化成分的內在聯系。

4　結論

云南蒙自是全國石榴種植面積最大的地區(qū)之一,本研究通過對該地區(qū)中蜂和意蜂所生產的石榴蜜進行理化性質和體外抗氧化研究,結果顯示:中蜂和意蜂石榴蜜之間的灰分、酸度、總酚含量、葡萄糖含量、果糖含量和淀粉酶值均存在差異性,意蜂石榴蜜的氨基酸總量及必需氨基酸含量均高于中蜂石榴蜜;中蜂石榴蜜的羥自由基清除能力和還原力均高于意蜂石榴蜜,DPPH自由基清除能力低于意蜂石榴蜜;兩種石榴蜜的多酚含量和羥自由基、DPPH自由基和還原力之間均存在良好的線性關系。

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Comparatively study on physicochemical characteristics and antioxidant properties ofPunicagranatumhoney produced byApisceranaceracaandA.melliferaligusticain Yunnan

ZHANG Zheng1,2,3,LIU Yu-jia4,CHEN Chao2,GUO Yan2,ZHAO Feng-yun1,2,*

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China; 2.Food Safety Institute,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China; 3.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China; 4.Department of Applied Chemistry,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

In the present work,the physicochemical characteristics and antioxidant properties ofPunicagranatumhoney,produced byApisceranaceracaandA.melliferaligusticain Yunnan,were investigated. The results showed that the ash,lactonic acidity,total phenol,and fructose contents inP.granatumhoney ofA.ceranaceracawere significantly higher than those in theP.granatumhoney ofA.melliferaligustica. However,glucose content,amylase,amino acid content and essential amino acid content inP.granatumhoney ofA.ceranaceracawere all significantly lower than those in theP.granatumhoney ofA.melliferaligustica. The results ofinvitroantioxidant experiments showed that the OH radical scavenging activity and reducing power ofP.granatumhoney produced byA.ceranaceracawere higher than those ofP.granatumhoney produced byA.melliferaligustica. While,the DPPH radical scavenging activity ofP.granatumhoney produced byA.ceranaceracawas weaker than that ofP.granatumhoney produced byA.melliferaligustica. Generally,in the present work,the difference betweenP.granatumhoney ofA.ceranaceracaandA.melliferaligusticawas reported for the first time,and the results might provide a theoretical basis for the development and utilization of honey in Yunnan.

Punicagranatumhoney;Apisceranaceraca;Apismelliferaligustica;physicochemical index;antioxidant activity

2015-10-19

張政(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail:372794280@qq.com。

趙風云(1979-)，女，博士，副教授，研究方向：食品生物技術,E-mail:zhaofy@kmust.edu.cn。

國家自然科學基金地區(qū)基金(31560576)；云南省教育廳基金項目(2014Y080)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)10-0132-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.017