周換麗，孫　燕，鄧大同，王佑民

甲狀腺功能減退癥大鼠卵巢TSHR表達(dá)及與TNF-α、IL-6的關(guān)系

周換麗，孫燕，鄧大同，王佑民

目的 探討甲狀腺功能減退大鼠體內(nèi)腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）及促黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、雌激素（E）、孕激素（P）水平變化，并檢測(cè)大鼠卵巢中促甲狀腺激素受體（TSHR）的表達(dá)，了解TSHR是否與TNF-α和IL-6細(xì)胞因子的變化存在關(guān)聯(lián)。方法 10只雌性SD大鼠分為2組，正常組（n=5）及甲減組（n=5），正常組飲用自來(lái)水，甲減組飲用0.05%丙硫氧嘧啶（PTU）水誘導(dǎo)成年期甲狀腺功能減退大鼠模型。8周后采用ELISA法測(cè)定大鼠三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）、促甲狀腺激素（TSH）水平及各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、LH、FSH、E、P水平，并通過(guò)免疫組化檢測(cè)卵巢TSHR的表達(dá)。結(jié)果 ①與正常組比較，甲減組TNF-α、IL-6升高（P＜0.01）；②與正常組比較，甲減組LH、FSH水平升高（P＜0.05），E、P水平降低（P＜0.05）；③甲減組大鼠卵巢原始卵泡、初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡中TSHR表達(dá)強(qiáng)度較正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。甲減組大鼠卵巢黃體組織中TSHR表達(dá)強(qiáng)度高于正常組（P＜0.05）；④TNF-α、IL-6與黃體中TSHR有線性正相關(guān)性（P＜0.05）。結(jié)論 TSHR在甲狀腺功能減退大鼠卵巢黃體中表達(dá)增強(qiáng)，可能與炎性因子TNF-α、IL-6存在關(guān)聯(lián)。

甲狀腺功能減退；卵巢；TNF-α；IL-6

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-19 11：04：48 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.012.html

內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間有著雙向作用，內(nèi)分泌系統(tǒng)通過(guò)合成和釋放特殊激素，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，而與此同時(shí)，免疫系統(tǒng)可通過(guò)釋放細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)［1］。促甲狀腺激素受體（thyroid-stimulating hormone receptor，TSHR）作為促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）的受體，已被證實(shí)不僅僅存在于甲狀腺組織，在牛、大鼠卵巢以及人子宮內(nèi)膜和卵巢中都發(fā)現(xiàn)活性TSHR的存在［2-5］，證實(shí)TSHR在生殖調(diào)節(jié)中扮演著重要的角色。研究［6-7］表明，甲狀腺功能減退可以引起腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白介素6（interleukin-6，IL-6）細(xì)胞因子水平的變化。TSHR作為激素受體，在甲狀腺功能減退大鼠卵巢內(nèi)是否發(fā)生變化，是否與TNF-α、IL-6有關(guān)聯(lián)，兩者關(guān)聯(lián)是否是甲狀腺功能減退導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的又一機(jī)制，值得探討。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立甲狀腺功能減退大鼠模型，測(cè)定大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6及相關(guān)黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、雌激素（estrogen，E）、孕激素（progestin，P），并通過(guò)檢測(cè)甲狀腺功能減退大鼠卵巢TSHR的表達(dá)，初步探討TSHR在甲狀腺功能減退大鼠卵巢中的表達(dá)及其是否與TNF-α、IL-6細(xì)胞因子的變化有關(guān)，為甲狀腺功能減退通過(guò)免疫系統(tǒng)在卵巢水平影響生殖系統(tǒng)功能提供新的探索思路。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6周齡SD雌性大鼠10只，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心喂養(yǎng)，每籠5只，溫度（22±2）℃，晝夜循環(huán)，所有動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物管理和使用指南。

1.2試劑與儀器 主要試劑：丙硫氧嘧啶（propylthiouracil，PTU）（美國(guó) Sigma公司）；三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、甲狀腺素（thyroxin，T4）、促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）、TNF-α、IL-6、LH、FSH、E、P ELISA試劑盒（上海源葉生物技術(shù)有限公司）；TSHR抗體：兔抗鼠多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。主要儀器：酶標(biāo)儀RT-6000（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；離心機(jī)JW3021HR（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；電熱恒溫箱DNP-9052BS-Ⅲ（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；-80℃冰箱（合肥美菱股份有限公司）；OLYMPUSBX53顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3動(dòng)物模型設(shè)計(jì) 10只SD雌性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組，正常組（n=5）及甲減組（n=5），正常組飲用自來(lái)水，甲減組飲用0.05% PTU水，共8周［8］。后采用陰道分泌物涂片法根據(jù)細(xì)胞的變化特點(diǎn)判斷大鼠發(fā)情周期，大鼠發(fā)情周期為4～5 d，避開(kāi)大鼠發(fā)情前期及發(fā)情期，于大鼠發(fā)情后期及發(fā)情間期取材。

1.4標(biāo)本制備 血清：水合氯醛0.3 ml/100 g體重，腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心20 min后取血清置于-80℃冰箱保存待測(cè)T3、T4、TSH及TNF-α、IL-6、LH、FSH、E、P。卵巢組織：腹腔麻醉后，打開(kāi)大鼠腹腔，沿著大鼠Y型子宮，找到位于輸卵管兩端的卵巢，用生理鹽水沖洗后，放置于中性福爾馬林液固定，包埋后，送至病理科，連續(xù)4μm石蠟切片。

1.5甲狀腺激素測(cè)定 大鼠血清T3、T4、TSH及TNF-α、IL-6、LH、FSH、E、P通過(guò)ELISA法測(cè)定，具體按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.6TSHR的檢測(cè) 采用免疫組化SP法操作：①烤片，60℃、2 h；②常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；二甲苯Ⅰ10 min、二甲苯Ⅱ10 min、100%酒精5 min、95% 酒精5min、75%酒精5min；③抗原修復(fù)：置0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中，煮沸后，高壓修復(fù)1 min 40 s，自然冷卻30 min以上，再用冷水沖洗，PBS沖洗3次，每次3 min；④阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：3%H2O237℃孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；⑤正常羊血清工作液封閉，37℃、10 min，傾去勿洗；⑥滴加一抗4℃冰箱孵育過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次5 min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照）；滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；⑦滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育10 min，PBS沖洗3次，每次5 min；⑧DAB反應(yīng)染色，自來(lái)水充分沖洗后，蘇木精復(fù)染、藍(lán)化、常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。在光學(xué)顯微鏡觀察拍照，放大倍數(shù)400，所有攝片在同等參數(shù)下進(jìn)行，采用Image-Pro plus 6.0系統(tǒng)測(cè)平均光密度（average optical density，AOD）值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料數(shù)據(jù)以ˉx±s描述，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)；TNF-α、IL-6與TSHR的相關(guān)關(guān)系采用線性相關(guān)分析，進(jìn)一步采用多元逐步回歸分析判斷相關(guān)因素顯著性。

2　結(jié)果

2.1兩組甲狀腺功能水平 PTU飲用水誘導(dǎo)雌性大鼠8周后，PTU誘導(dǎo)組大鼠出現(xiàn)行動(dòng)緩慢、毛色發(fā)黃、脫毛等現(xiàn)象，且兩組大鼠血清結(jié)果顯示，與正常組比較，甲減組T3、T4明顯降低（P＜0.01），TSH升高（P＜0.05），甲狀腺功能減退模型造模成功。見(jiàn)表1。

表1　兩組甲狀腺功能水平比較

表1　兩組甲狀腺功能水平比較

與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

項(xiàng)目甲減組（n=5）　正常組（n=5）　t值　P值T3（ng/ml）　68.50±7.24**82.27±3.44　-3.842　0.005 T4（μg/L）　118.45±16.79**　151.56±10.19　-3.769　0.005 TSH（μIU/L） 1 363.50±221.41*1 086.00±100.39　2.552　0.034

2.2兩組TNF-α、IL-6及性激素水平比較 與正常組比較，甲減組TNF-α、IL-6水平顯著升高（P＜0.01）。LH、FSH水平升高（P＜0.05），E、P水平降低（P＜0.05）。

表2　兩組TNF-α、IL-6及性激素水平比較（xˉ±s）

表2　兩組TNF-α、IL-6及性激素水平比較（xˉ±s）

與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

項(xiàng)目甲減組（n=5）　正常組（n=5）　t值　P值TNF-α（ng/ml）254.060±50.440**140.650±30.550　4.300　0.003 IL-6（ng/ml）　182.260±10.010**146.360±8.600　6.080　0.000 LH（ng/L）　20.001±2.759*　15.288±1.791　3.204　0.013 FSH（IU/L）　11.449±2.298*　7.134±0.790　4.017　0.010 E（ng/L）　22.119±1.846**　33.182±5.640　-4.166　0.003 P（pmol/L）　566.990±89.946*733.150±92.412-2.881　0.020

2.3兩組卵巢TSHR表達(dá)水平 正常組大鼠卵巢組織中，TSHR表達(dá)在卵巢上皮細(xì)胞胞質(zhì)（圖1A1）、原始卵泡的卵母細(xì)胞（圖1B1）、初級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞（圖1C1）、次級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞（圖1D1）、黃體顆粒細(xì)胞（圖1E1）中；甲減組大鼠TSHR表達(dá)部位差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，卵巢上皮細(xì)胞胞質(zhì)（圖1A2）、原始卵泡的卵母細(xì)胞（圖1B2）、初級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞（圖1C2）、次級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞（圖1D2）、黃體顆粒細(xì)胞（圖1E2）。甲減組TSHR表達(dá)在原始卵泡，初級(jí)卵泡及次級(jí)卵泡中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在黃體細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)度高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

圖1　正常大鼠及甲狀腺功能減退大鼠卵巢組織　TSHR的表達(dá) SP×400A：大鼠卵巢上皮細(xì)胞；B：原始卵泡（箭頭所指為原始卵泡）；C：初級(jí)卵泡（箭頭所指為初級(jí)卵泡）；D：次級(jí)卵泡；E：黃體；1：正常組；2：甲減組

表3　兩組卵巢組織原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和黃體　TSHR表達(dá)強(qiáng)度比較

表3　兩組卵巢組織原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和黃體　TSHR表達(dá)強(qiáng)度比較

與正常組比較：*P＜0.05

項(xiàng)目甲減組正常組　t值P值原始卵泡0.002 2±0.000 70　0.001 5±0.000 48　-1.612　0.146初級(jí)卵泡　0.018 5±0.008 58　0.009 2±0.006 57　-1.493　0.210次級(jí)卵泡　0.048 1±0.012 09　0.085 5±0.003 55　2.031　0.060黃體細(xì)胞　0.104 9±0.012 82*0.090 0±0.006 15　2.346　0.047

2.4TNF-α、IL-6與黃體組織TSHR的關(guān)系TNF-α與TSHR呈正線性相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.841，P＜0.01）；IL-6也與 TSHR呈正線性相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.648，P＜0.05）。進(jìn)一步采用多元逐步回歸，分析可能對(duì)TSHR（Y）表達(dá)有影響的因素TNF-α（X1）、IL-6（X2）、T3（X3）、T4（X4）、TSH（X5）、FSH（X6）、LH（X7）、E（X8）、P（X9），其中X為參與多元回歸的自變量，P為多元復(fù)相關(guān)顯著性，R為復(fù)相關(guān)系數(shù)，β為標(biāo)準(zhǔn)偏回歸系數(shù)。建立回歸方程：Y=0.069+0.000X1，TNF-α與TSHR有顯著相關(guān)性（P＜0.05，R=0.841，β= 0.841）。

3　討論

內(nèi)分泌器官通過(guò)分泌特定激素，參與生殖調(diào)控。下丘腦、垂體、甲狀腺、腎上腺以及卵巢功能的失?？梢詫?dǎo)致女性生殖系統(tǒng)調(diào)控的紊亂［9］。甲狀腺功能減退是生育期婦女常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病，可以導(dǎo)致不孕、流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒生長(zhǎng)發(fā)育受限和低體重兒等不良妊娠結(jié)局［10-11］。探討甲狀腺功能減退影響生殖器官功能的機(jī)制對(duì)于臨床更好地防治不良妊娠的發(fā)生有著重要意義。

甲狀腺功能減退影響下丘腦-垂體-卵巢軸的功能，涉及的機(jī)制有：甲狀腺激素分泌減少，反饋抑制促甲狀腺激素釋放激素（thyrotropin-releasing hormone，TRH）分泌的作用降低，隨著TRH分泌增加，促使泌乳素、FSH以及黃體生成素（luteinizing hormone，LH）分泌增加，從而導(dǎo)致卵巢調(diào)節(jié)功能紊亂［12］。TSHR作為T(mén)SH受體，同卵泡刺激素受體（follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）及黃體生成素受體（luteinizing hormone receptor，LHR）同屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，能夠被異源二聚體糖蛋白激素（TSH、FSH、LH、HCG）激動(dòng)，這些異源二聚體糖蛋白激素有相同的GPA1亞基，與不同的β亞基（分別為T(mén)SHβ、FSHβ、LHβ、CGβ）結(jié)合后形成不同的糖激素蛋白，發(fā)揮不同的生理作用［13］。

研究［13］顯示，一種新的異源二聚體糖蛋白激素thyrostimulin成為G蛋白偶聯(lián)受體超家族中的一員，能夠與TSHR結(jié)合，在體內(nèi)外發(fā)揮作用。TSHR不僅僅存在于甲狀腺組織中，高親和力的TSH結(jié)合位點(diǎn)以及TSHR轉(zhuǎn)錄還存在于淋巴細(xì)胞、棕色脂肪組織以及紅細(xì)胞，證實(shí)TSHR在免疫、產(chǎn)熱及局部血液循環(huán)調(diào)控中扮演著重要角色。在非成熟SD大鼠卵巢組織內(nèi)，卵母細(xì)胞表達(dá)thyrostimulin，顆粒細(xì)胞表達(dá)TSHR，兩者構(gòu)成旁分泌內(nèi)環(huán)境，thyrostimulin與TSHR結(jié)合后使得細(xì)胞內(nèi)cAMP含量及c-fos蛋白含量增加，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化。該作用被促性腺激素加強(qiáng)，促性腺激素通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量，使得TSHR表達(dá)增加。而雌激素作用相反，使得 TSHR表達(dá)下降［3］。

本研究顯示，甲減組大鼠體內(nèi)FSH、LH水平增加，E、P水平降低，而卵巢黃體組織中TSHR的表達(dá)較正常組強(qiáng)，推測(cè)機(jī)制可能為：①甲狀腺功能減退使得體內(nèi)FSH及LH增加，促性腺激素水平增加，通過(guò)激活cAMP，增加TSHR的表達(dá)；②甲狀腺功能減退，體內(nèi)肝臟合成性激素結(jié)合蛋白下降，降低體內(nèi)雌激素水平，導(dǎo)致TSHR表達(dá)增加。卵巢組織中黃體細(xì)胞的形成及退化的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，不僅僅通過(guò)激素調(diào)控，且免疫系統(tǒng)包括淋巴細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及細(xì)胞因子TNF-α及IL-6在此發(fā)揮重要作用。

研究［14］顯示，在牛的整個(gè)性周期中TNF存在于黃體，尤其在黃體衰退時(shí)期表達(dá)和分泌增加。TNF-α不僅由黃體細(xì)胞合成，還由巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞分泌。TNF-α受體表達(dá)于類(lèi)固醇合成細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。類(lèi)固醇合成細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞之間的相互作用在黃體溶解中扮演重要角色。而用IL-4、IL-5、IL-6等處理黃體顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)使得皮質(zhì)酮轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)醇的1型11羥類(lèi)固醇脫氫酶（11-β-hydroxysteroiddehydrogenasetype1，11β-HSD）活性增加，功能性黃體中1型11β-HSD活性增強(qiáng)，增加了黃體內(nèi)在皮質(zhì)醇的含量，抑制了局部免疫細(xì)胞的功能，進(jìn)而影響了免疫細(xì)胞在黃體形成及退化中的作用。

研究［15］表明，甲狀腺功能減退大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子水平升高。進(jìn)而設(shè)想，甲狀腺功能減退是否通過(guò)改變體內(nèi)細(xì)胞因子水平從而影響卵巢組織內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化，該作用是否與卵巢組織中TSHR表達(dá)異常關(guān)聯(lián)？本研究結(jié)果提示，在甲狀腺功能減退大鼠體內(nèi)TNF-α，IL-6水平增加，與研究［15］結(jié)果一致。甲狀腺功能減退大鼠卵巢原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡中TSHR表達(dá)與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但黃體組織中TSHR的表達(dá)較正常組強(qiáng)，TNF-α及IL-6水平升高與TSHR表達(dá)增加一致，TNF-α與TSHR顯著正相關(guān)性。表明甲狀腺功能減退可能通過(guò)影響免疫系統(tǒng)及卵巢黃體組織中TSHR表達(dá)，進(jìn)而影響生殖系統(tǒng)功能。但兩者間關(guān)聯(lián)的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，在甲狀腺功能減退狀態(tài)下，體內(nèi)炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平增加，TSHR在黃體中表達(dá)增加，兩者可能導(dǎo)致卵巢組織中局部免疫環(huán)境改變，影響生殖系統(tǒng)功能。

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The TSHR expression on ovary in hypothyroid rats and their relationship w ith TNF-αand IL-6

Zhou Huanli，Sun Yan，Deng Datong，et al
（Dept of Endocrinology，Institute of Endocrinology and Metabolism，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To detect the TNF-α，IL-6 and sex hormones in hypothyroid rats，throughmeasuring the expression of thyroid-stimulating hormone receptor（TSHR）in ovary of hypothyroid rats to know if TSHR has relationship with TNF-αand IL-6.Methods 10 ratswere divided into 2 groups，the control group（n=5）which ratswere fed with normalwater and hypothyroid group（n=5）which were fed with 0.05%propyl thiouracil（PTU）in drinking water.After 8 weeks，the levels of serum TNF-αand IL-6 of each group weremeasured aswell as the immunohistochemical expression of TSHR on the ovary.Results ①The hypothyroid group had the higher levels of TNF-α，IL-6（P＜0.01）compared to the control group；②The hypothyroid group had the higher levels of LH，F(xiàn)SH（P＜0.05）and lower E，P（P＜0.05）compared to the control group；③The expression of TSHR in primordial follicles，primary follicles and secondary follicles in hypothyroid group presented no statistical significance compared to the control group while the level of TSHR in corpus luteum in hypothyroid group was higher than that in the control group（P＜0.05）；④TNF-αand IL-6 had positive linear correlation with TSHR expressed in corpus luteum（P＜0.05）.Conclusion The high expression of TSHR on corpus luteum of ovarymay has relationship with TNF-αand IL-6.

hypothyroid；ovary；TNF-α；IL-6

R 581.2；R 339.221

A

1000-1492（2016）05-0633-05

2016-01-18接收

公益性行業(yè)專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)目（編號(hào)：201402005）；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：1608085MH207）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科、安徽省內(nèi)分泌代謝

病省級(jí)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230022

周換麗，女，碩士研究生；

王佑民，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：youminwang@21cn.com