王雨村　劉宏斌　何欣　杜小正

·臨床研究·

Rb表達水平與胃癌中醫(yī)證型的相關(guān)性研究

王雨村劉宏斌何欣杜小正

目的：檢測Rb基因在胃癌不同中醫(yī)證型中的表達水平及變化，探討Rb基因與胃癌中醫(yī)證型的關(guān)系。方法：選取2012 年10月至2014年10月在甘肅省腫瘤醫(yī)院胃腸外科入院行手術(shù)治療的胃癌患者162例，以慢性淺表性胃炎或正常胃組織標(biāo)本為對照組，使用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測胃癌組織和正常組織標(biāo)本中Rb表達情況，并在顯微鏡下觀察記錄組織細(xì)胞的陽性表達水平。結(jié)果：不同類型的中醫(yī)證型中，Rb蛋白表達由弱到強依次為：氣血虧虛型＜?xì)鉁鲂停继禎衲Y(jié)型＜肝氣犯胃型＜脾胃虛寒型＜胃熱傷陰型，且Rb陽性表達與中醫(yī)證型之間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.228，P＜0.01），并與胃癌的分級、分期存在一定的相關(guān)性。結(jié)論：Rb基因的表達在不同胃癌中醫(yī)證型中存在演變趨勢。

胃癌；中醫(yī)證型；Rb；免疫組化；相關(guān)性

胃癌是常見的消化道腫瘤。全球每年大概有一百萬新發(fā)胃癌病例，約有70萬人死于胃癌及其并發(fā)癥，在惡性腫瘤死因中位列第二位［1-3］。在我國，每年大約有2萬人被檢出患有胃癌，病死率男性（40.8/10萬）和女性（18.6/10萬），分別是歐美發(fā)達國家的4.2～7.9倍和3.8～8.0倍［4，5］。研究表明，Rb基因與胃癌的侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且，原癌基因、抑癌基因及細(xì)胞因子在氣滯血瘀證和邪熱內(nèi)蘊證中的表達存在差異性，由此推測出中醫(yī)證型與胃癌發(fā)生發(fā)展過程中基因的表達可能存在關(guān)聯(lián)［6］。本研究對胃癌6個中醫(yī)證型與Rb基因表達進行分析研究，探討胃癌中“證”的實質(zhì)，以期為中醫(yī)藥治療胃癌、預(yù)測其轉(zhuǎn)歸提供新思路。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2012年10月至2014年10月就診于甘肅省腫瘤醫(yī)院胃腸外科病理確診并手術(shù)治療的胃癌患者162例，其中女性64例，男性98例，平均年齡（53.1±7.4）歲。根據(jù)胃癌分級系統(tǒng)，其中Ⅰ級41例，Ⅱ級82例，Ⅲ級39例；根據(jù)胃癌TNM分期，其中Ⅰ期28例（ⅠA期10例、ⅠB期18例），Ⅱ期49例（ⅡA期22例、ⅡB期27例），Ⅲ期46例（ⅢA期19例、ⅢB期14例、ⅢC期13例），Ⅳ期39例。根據(jù)胃癌中醫(yī)分型（中醫(yī)證型參照《中醫(yī)胃癌診療指南（草案）》［7］），其中胃熱傷陰28例，脾胃虛寒39例，痰濕凝結(jié)17例，肝氣犯胃36例，氣血虧虛19例，氣滯血瘀23例。以慢性淺表性胃炎或正常胃組織標(biāo)本為對照組。胃癌組織標(biāo)本蠟塊由甘肅省腫瘤醫(yī)院病理科提供。

1.2主要儀器與試劑CH-212型顯微鏡購自奧林巴斯集團公司，AO-82型石蠟切片機由廣州晟龍實驗儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)。鼠抗人C-erbB-2免疫組化單克隆抗體、免疫組化試劑盒、3，3-二氨基聯(lián)苯胺（Di?aminobenzidine，DAB）顯色試劑盒、檸檬酸抗原修復(fù)液、多聚賴氨酸防脫片劑、EDTA抗原修復(fù)液均購自邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1組織標(biāo)本的處理。 將組織蠟塊切成約5μm厚的切片，平鋪在載玻片上（實驗前預(yù)先用多聚賴氨酸處理）室溫下干燥。干燥后置于恒溫烤箱內(nèi)60℃過夜備用。每次染色前，均需將標(biāo)本切片再次置于恒溫烤箱內(nèi)，60℃烘烤50-60分鐘后才可使用。

1.3.2免疫組化。石蠟切片二甲苯脫蠟、乙醇脫水后，抗原修復(fù)；將抗原修復(fù)好的切片SP法免疫組化染色，DAB顯色，蘇木素染色，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，最后鏡檢。

2.3陽性標(biāo)準(zhǔn)切片在40×10倍視野下，計數(shù)50個腫瘤細(xì)胞，每張切片至少計數(shù)5個視野范圍。陽性標(biāo)準(zhǔn)［8］：陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)≤10%計為無陽性表達；11%-30%為（+）；31%-70%為（++）；＞70%為（+++）。

2.4統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理。胃癌的各項觀察指標(biāo)采用描述性統(tǒng)計，中醫(yī)證候各組間應(yīng)用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1胃癌組織中Rb蛋白的表達水平胃癌組織中Rb的陽性率為53.7%，與正常組織及慢性胃炎組織相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。在3級腫瘤分級中，Rb陽性表達率分別為63.4%、56.1%、38.5%，與正常胃及慢性胃炎組織相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。胃癌TNM腫瘤分期中，Rb蛋白在腫瘤的4個分期中陽性率分別為64.3%、61.2%、54.3%、35.9%，與對照組相比，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表1　Rb蛋白的表達水平（例）

表2　Rb在不同胃癌分級中的表達水平（例）

表3　Rb在不同胃癌分期中的表達水平（例）

2.2中醫(yī)證型在不同胃癌分級中的表達情況Ⅰ級胃癌患者中以脾胃虛寒型最多，共12例，占29.3%，氣滯血瘀型最少，共3例，占7.3%；Ⅱ級胃癌患者中肝氣犯胃型最多，共21例，占25.6%，胃熱傷陰型最少，共7例，占8.5%；Ⅲ級胃癌患者中胃熱傷陰型最多，共17例，占43.6%，痰濕凝結(jié)型最少，共2例，占5.1%。見表4。

表4　中醫(yī)證型在不同胃癌分級中的表達情況［例（%）］

2.3中醫(yī)證型在不同胃癌分期中的表達情況將胃癌標(biāo)本按TNM體統(tǒng)分期，Ⅰ期患者中以胃熱傷陰型最多，共11例，占39.3%，痰濕凝結(jié)型最少，共1例，占3.6%；Ⅱ期患者中以肝氣犯胃型最多，共15例，占30.6%，氣滯血瘀型最少，共3例，占6.1%；Ⅲ期患者以脾胃虛寒型最多，共17例，占37.0%，氣血虧虛型最少，共2例，占4.3%；Ⅳ期以氣滯血瘀型最多，共10例，占25.6%，痰濕凝結(jié)型最少，共3例，占7.7%。見表5。

表5　中醫(yī)證型在不同胃癌分期中的表達情況［例（%）］

2.4胃癌不同中醫(yī)證型中Rb的表達情況不同中醫(yī)證型胃癌組織中Rb陽性表達不同，=11.312，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。Rb陽性表達與中醫(yī)證型之間呈負(fù)相關(guān)，r=-0.228，P＜0.01。Rb蛋白陽性表達率由弱到強依次為：氣血虧虛型（15.8%）＜?xì)鉁鲂停?1.7%）＜痰濕凝結(jié)型（29.4%）＜肝氣犯胃型（41.7%）＜脾胃虛寒型（46.2%）＜胃熱傷陰型（53.6%）。見表6。

表6　不同中醫(yī)證型中Rb表達情況

3　討論

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，癌基因和抑癌基因的表達產(chǎn)物能反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)，臨床上可作為早期診斷和預(yù)測預(yù)后的指標(biāo)。Rb基因為機體內(nèi)一種重要的細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控基因，是最早發(fā)現(xiàn)的抑癌基因［9］。有研究［10］表明，在所有人類腫瘤細(xì)胞中，均存在Rb基因表達異常（包括調(diào)控異?；蚧蛲蛔儯?。張宇龍的研究［11］顯示，在進展期胃癌原發(fā)灶中，Rb蛋白高表達，且Rb蛋白的表達程度與胃癌腫瘤細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)。有研究［12］提示，中藥胃復(fù)春聯(lián)合維A酸可上調(diào)抑癌基因Rb表達，并下調(diào)癌基因C-erbB-2的表達治療胃癌前病變，但該研究病例數(shù)不多，觀察隨訪時間不長。Rb蛋白參與胃癌的發(fā)生，且其與組織學(xué)類型、淋巴轉(zhuǎn)移率及浸潤深度有顯著相關(guān)性［13］。說明Rb蛋白表達缺失的胃癌更具侵襲、轉(zhuǎn)移的惡性生物學(xué)行為，并越到晚期，Rb蛋白越易發(fā)生缺失。

本研究中，Rb在胃癌組織中高表達，陽性率為53.7%，在正常胃組織和慢性胃炎組織中低表達（P＜0.05），說明Rb的異常表達與胃癌發(fā)生存在一定的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)證型在胃癌分級與分期中的分布不同，且中醫(yī)證型與胃癌分期正相關(guān)，提示隨著胃癌病情的進展，腫瘤分期越來越晚，中醫(yī)證型也由實轉(zhuǎn)虛，呈現(xiàn)單純虛癥或者虛實夾雜。Rb蛋白陽性表達水平由弱到強分別為：氣血虧虛型＜?xì)鉁鲂停继禎衲Y(jié)型＜肝氣犯胃型＜脾胃虛寒型＜胃熱傷陰型。結(jié)果提示：Rb基因在不同胃癌中醫(yī)證型中存在演變趨勢。

胃癌的4個TNM分期中：Ⅰ期患者中以胃熱傷陰型最多，痰濕凝結(jié)型最少；Ⅱ期患者中以肝氣犯胃型最多，氣滯血瘀型最少；Ⅲ期患者以脾胃虛寒型最多，氣血虧虛型最少；Ⅳ期以氣滯血瘀型最多，痰濕凝結(jié)型最少。胃癌腫瘤Ⅰ期為本病的初級階段，癌腫對于胃上皮浸潤程度尚淺，病變程度較輕，本期患者正氣尚強，病情不明顯，常常未能引起患者的重視，此期以胃熱傷陰最多見；Ⅱ期患者由于癌腫已形成實體，處于邪正相爭的階段；Ⅲ期患者中以脾胃虛寒最多見，此期患者癌腫侵犯繼續(xù)加重，中醫(yī)辨證認(rèn)為該期患者癥狀表現(xiàn)屬于虛實證；Ⅳ期患者中以氣滯血瘀者最多，此期患者多為腫瘤晚期患者，機體免疫功能減退，正氣消退，形體衰敗，正不勝邪。

西醫(yī)依據(jù)腫瘤的異型性將腫瘤分為Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級，分化程度越高表明癌細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能越接近正常組織，其惡性程度越低。本次研究發(fā)現(xiàn)：腫瘤分級Ⅰ級胃癌患者中以脾胃虛寒型最多，氣滯血瘀型最少；Ⅱ級胃癌患者中肝氣犯胃型最多，胃熱傷陰型最少；Ⅲ級胃癌患者中胃熱傷陰型最多，痰濕凝結(jié)型最少。

綜上所述，胃癌組織中Rb表達水平高于正常組織及慢性胃炎組織，提示Rb基因的表達對胃癌的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移有著重要作用。疾病的證型不同，則Rb蛋白的表達情況亦不同。

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A

1004-2725（2016）08-0580-04

730050甘肅 蘭州，甘肅省腫瘤醫(yī)院婦瘤科（王雨村），病理科（何欣）；730000甘肅 蘭州，甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院（王雨村、杜小正）；730050甘肅 蘭州，蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院普外科（劉宏斌）

劉宏斌，E-mail：liuhb2012@126.com