尹 麗，宗蘭蘭，蒲曉輝，李蒙蒙，袁 琦

1. 河南大學(xué) 藥物研究所，河南 開封 475004； 2. 河南大學(xué) 納米材料工程研究中心，河南 開封 475004

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薄層色譜法在藥物分析中的應(yīng)用

1. 河南大學(xué) 藥物研究所，河南 開封 475004； 2. 河南大學(xué) 納米材料工程研究中心，河南 開封 475004

〔目的〕綜述薄層色譜法在藥物分析中的應(yīng)用。〔方法〕對近年來國內(nèi)外與薄層色譜法的文獻(xiàn)進(jìn)行檢索與分析?！步Y(jié)果〕薄層色譜法在藥物分析中的很多方面都有應(yīng)用。常用于鑒別、雜質(zhì)檢查、含量測定等。 〔結(jié)論〕隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，薄層色譜法也得到快速發(fā)展，并逐步用于藥物分析中的新領(lǐng)域，使其應(yīng)用更為廣泛。

薄層色譜法；鑒別；雜質(zhì)檢查；含量測定

薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)系將適宜的固定相涂于玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層。待點(diǎn)樣、展開后，根據(jù)比移值(Rf值)與適宜的對照物按同法所得色譜圖的Rf值作對比，用以進(jìn)行藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測定的方法。薄層色譜法是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也用于跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。薄層色譜自1938年發(fā)明以來，自身的理論和技術(shù)得到了長足的發(fā)展，其應(yīng)用范圍極其廣泛，成為現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室不可或缺的一種技術(shù)手段。TLC法被許多國家藥典用于藥物中雜質(zhì)的檢查、藥物分析等方面，且是目前藥典中收載最多的鑒別與有關(guān)物質(zhì)檢查方法之一，具有設(shè)備簡單、操作簡便、分離速度快、靈敏度和分辨率較高等優(yōu)點(diǎn)[1]。可以同時(shí)分離多個(gè)樣品，分析成本低，對樣品預(yù)處理要求低，對固定相、展開劑的選擇自由度大，適用于含有不易從分離介質(zhì)脫附或含有懸浮微粒或需要色譜后衍生化處理的樣品分析。在定性鑒定、半定量以及定量分析中發(fā)揮著重要作用。但是，在藥物分析中應(yīng)用最為廣泛，應(yīng)用與有機(jī)化合物的分析鑒定、植物藥有效部位的分離精制、有機(jī)合成、結(jié)構(gòu)分析、生物測定等，我們就應(yīng)用最多的藥物分析方面做一綜述。

1　TLC用于藥品定性鑒別

根據(jù)藥物的分子結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)，采用化學(xué)、物理化學(xué)或生物學(xué)方法來鑒別藥物，是檢驗(yàn)工作的首要任務(wù)，是雜質(zhì)檢查和含量測定的前提。因此，藥物鑒別在藥物質(zhì)量檢查中有著至關(guān)重要的地位。另外，薄層色譜法是藥物鑒別最基本簡便，使用最廣泛的方法，分別在化學(xué)藥品、抗生素、中藥材、中成藥以及基層藥品的鑒別檢查中起重要作用。

1.1化學(xué)藥品及其復(fù)方制劑

近年來，TLC法以其快速、簡便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，在化學(xué)藥物成分的研究中，原料藥的純度檢查、降解產(chǎn)物分析以及制劑的有關(guān)物質(zhì)檢查等均可通過薄層色譜法進(jìn)行。應(yīng)用薄層掃描法，可以很容易地對合成藥物復(fù)方制劑或單方制劑進(jìn)行原料分析和含量測定。撲炎痛中微量雜質(zhì)的測定可以用CS-930型薄層掃描儀：在硅膠GF254薄層板上，以石油醚、乙酸乙酯、氯仿、冰乙酸(12∶5∶3∶2.5)為展開劑，利用雙波長(λs=244nm，λr=280nm)鋸齒掃描隨行外標(biāo)法，測定撲炎痛中去乙酰物含量。復(fù)方降壓膠囊中的組成成分有10種。董海彥[2]以TLC同時(shí)鑒別處方中的利血平、利眠寧和鹽酸異丙嗪三種成分：取三種對照品及供試品制成溶液，分別點(diǎn)于硅膠GF254板上，以苯、丙酮(3∶2)為展開劑，置254 nm紫外光燈下檢視，供試品與對照品的3個(gè)斑點(diǎn)位置一致，Rf值適中，斑點(diǎn)明顯。Hamryt[3]等用TLC方法研究了12個(gè)精神類藥物的親脂性：選用Merck C18硅膠GF254HPTLC薄層板(10 cm×10 cm)，考察了多種流動(dòng)相組合，結(jié)果表明，最好的流動(dòng)相為甲醇、水、0.01 mol/L的SDS-10%的醋酸鹽緩沖液(pH=4.75)、醇、水、1%的氨水、乙腈、水、1%的氨水和二氧六環(huán)、水、1%的氨水。波蘭Jagiellonian大學(xué)的Ekiert等[4]用TLC測定唑類抗真菌劑，這是抗真菌唑類藥物成分檢測的新方法，目前鮮有報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)對酮康唑、聯(lián)苯芐唑、氟康唑和伊曲康唑4種抗真菌劑進(jìn)行了測定：經(jīng)選擇TLC板用硅膠60F254熒光板，展開劑選用正己烷、醋酸乙酯、甲醇、水、冰醋酸(42∶40∶15∶2∶1)，UV檢測波長260 nm。該法準(zhǔn)確簡便，專屬性強(qiáng)，可作為抗菌素類藥物TLC法研究的參考。

1.2植物藥成分的鑒別

TLC法在植物藥成分鑒別方面的應(yīng)用已極為廣泛。印度M.S.大學(xué)的Murthy等[5]在2008年首次報(bào)道了關(guān)于莕菜屬植中樺木酸的TLC檢測方法：將2.5 g N.macrospermum根粗粉用25 mL甲醇溶液水浴加熱回流提取30 min，同法提取4次后合并提取液，濾過、離心后制成一定濃度的甲醇溶液；將該樣品溶液與樺木酸甲醇對照液同時(shí)在TLC硅膠G60F254預(yù)制板上點(diǎn)樣，用環(huán)己烷、醋酸乙酯、冰醋酸(7∶3∶0.03)溶劑系統(tǒng)展開，30 min后取出吹干，并用茴香醛2硫酸溶劑噴淋，110 ℃加熱3 min顯色，斑點(diǎn)在紫外可見光下檢視。結(jié)果顯示，分離效果良好，Rf=0.60。該方法在樺木酸的檢測方面以快速、簡便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)優(yōu)于其他方法。布達(dá)佩斯的Ligor等[6]研究了多種茶葉中活性物質(zhì)黃酮類的TLC檢測方法，提出將經(jīng)典液相萃取提取方法(liquid extraction，LE)和超臨界液體萃取法(supercritical fluid extraction，SFE)作比較，并用TLC法檢測在不同提取方法下活性成分的量。該實(shí)驗(yàn)中檢測的植物有紅茶、綠茶和路依保斯茶，對照成分包括蘆丁、兒茶酚、咖啡因、橡黃素、山柰酚等。LE法為甲醇溶液浸泡24 h后除去不溶雜質(zhì)，低溫貯藏；SFE法采用SE-1提取器，CO2氣體加壓(1 151×107Pa)、50 ℃提取。展開劑選用丙酮、氯仿、水(80∶20∶10)，衍生試劑為10 g/L硼酸甲醇溶液和50 g/L質(zhì)量濃度的乙醇溶液，100 ℃下加熱5 min。結(jié)果顯示，用普通液相萃取提取方法得到黃酮的量較高，分離效果比較理想，Rf=0.28～0.87。

1.3藥材及中成藥的鑒別

用薄層色譜進(jìn)行指證性鑒別，它們之間的關(guān)系是共性與個(gè)性的關(guān)系。制備試藥生藥-共性化合物-共性特征(指示性的)薄層色譜個(gè)性化合物、個(gè)性特征(Rf值、顏色)薄層色譜，為生藥提供了一個(gè)可信的“身份”。它可以提供分子水平上的鑒別作用，從而確定是不是認(rèn)定的生藥，是不是道地的生藥，是不是已失效的生藥。薄層色譜掃描法在中藥材與中成藥上的應(yīng)用，主要是藥材品種的鑒別、含量的測定、成分研究、采收期與炮制方法等對成分與含量的影響，以及成藥中藥味的鑒別與含量的測定等。此方法可以直接在薄層板上進(jìn)行中藥成分的定量分析，其掃描圖譜也可作為中藥材的質(zhì)量評價(jià)、鑒別依據(jù)。例如：用薄層掃描法可以鑒別黃連品種，并對其所含生物堿進(jìn)行定量測定；用薄層掃描法測定土荊皮中乙酸的含量，以幫助鑒別其真?zhèn)蔚取Ｒ陨鲜吕际菍χ兴幉倪M(jìn)行的測定。中成藥相對復(fù)雜，不單單只包含一味藥材制劑，多數(shù)為復(fù)方制劑，所以在薄層掃描法中，依據(jù)色譜峰的歸屬對中成藥中各味藥材的鑒別一般是通過陰、陽雙對照法進(jìn)行的。

鄭志偉[7]采用雙波長掃描法，硅膠G板點(diǎn)樣，以正丁醇、冰醋酸、水(7∶1∶2)為展開劑，測定波長425 nm，測定尿塞通片中鹽酸小檗堿的含量，線性范圍為0.063～0.318 μg，平均回收率為96.97%， RSD為1.71% 。結(jié)果表明，該方法操作簡便、準(zhǔn)確，可用于尿塞通片的質(zhì)量監(jiān)控。趙志軍等[8]建立了益康膠囊的TLC鑒別方法，對方中組成藥物人參、黃芪、何首烏、丹參及甲基橙皮苷進(jìn)行鑒別。結(jié)果顯示，斑點(diǎn)清晰，分離效果好，專屬性強(qiáng)，陽性對照無干擾。金陽[9]研究破壁靈芝孢子粉膠囊的TLC鑒別方法，通過對集中提取及展開系統(tǒng)的比較，對破壁靈芝孢子粉的鑒別選擇GF254板，以石油醚(60～90 ℃)、甲酸乙酯、甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑。結(jié)果表明，該法鑒別效果好，能很好地把破壁靈芝孢子粉和靈芝區(qū)別開來。

1.4抗生素及其制劑

TLC法在抗生素及其制劑的鑒別以及基層藥品快速檢驗(yàn)中也經(jīng)常被使用。同類抗生素的結(jié)構(gòu)很相似，主要顯色基團(tuán)也是一致的，采用顏色反應(yīng)將其區(qū)分比較困難。在快檢工作中，利用薄層色譜法在區(qū)分結(jié)構(gòu)相似品上具有很好的優(yōu)勢。GF254板，展開劑為乙酸乙酯、丙酮、冰醋酸、水(3∶2∶2∶1)。取出薄層板，置通風(fēng)處晾干，碘蒸氣熏蒸下檢視，畫出斑點(diǎn)。結(jié)果表明，各組分的分離度良好，方法簡單、準(zhǔn)確，能用于基層克林霉素類抗生素制劑的真?zhèn)舞b別。注射用頭孢喹啉鈉的引入主要目的是同時(shí)建立一種單參比的快速薄層色譜鑒別克林霉素類抗生素的方法，這樣可以減少對照品的數(shù)量、減少誤差、提高準(zhǔn)確度。

1.5基層藥品快速檢驗(yàn)

TLC法作為一種快速鑒別方法被配備在藥品檢測車上，在基層藥品現(xiàn)場打假中發(fā)揮著重要作用。此外，對于結(jié)構(gòu)類似的同類化合物(十四元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素)檢測，簡便、靈敏、快速、專屬性強(qiáng)的薄層色譜系統(tǒng)的研究是極為重要的。周志凌等[10]建立了一種簡單的薄層色譜系統(tǒng)，采用硅膠GF254板，以醋酸乙酯、正己烷、氨水(10∶1.5∶1.5)為展開劑，碘蒸氣中顯色，用于十四元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素快速鑒別。通過對全國30 家生產(chǎn)企業(yè)的樣品分析，證明該方法的Rf值適中、實(shí)驗(yàn)室重現(xiàn)性好、適宜于基層現(xiàn)場快速鑒別。

2　TLC用于藥品中雜質(zhì)檢查

有關(guān)物質(zhì)檢查通常采用色譜法，可根據(jù)有關(guān)物質(zhì)的性質(zhì)選用專屬性好、靈敏度高的薄層色譜或高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)。薄層色譜法設(shè)備簡單，操作簡便，但因影響重現(xiàn)性和精密度的因素較多，可用作一般有關(guān)物質(zhì)檢查。涂莉等[11]采用TLC法，建立了雌三醇栓中有關(guān)物質(zhì)的檢查方法：以硅膠G板為吸附劑，以氯仿、甲醇、丙酮、冰醋酸(9∶0.5∶0.5∶0.5)為展開劑；展開后，晾干，噴以體積分?jǐn)?shù)為30%硫酸乙醇液，在100 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰。結(jié)果表明，三種有關(guān)物質(zhì)與原藥完全分離，Rf值適中，最低檢出量為0.2 pg，且重復(fù)性好。采用反相薄層色譜法，建立了阿德福韋酯有關(guān)物質(zhì)檢查法：以反相高效F254薄層板(HPTLC RP18 F254)為吸附劑，以甲醇、水(3∶1)為展開劑；在254 nm紫外光燈下檢視。結(jié)果表明，阿德福韋酯與其有關(guān)物質(zhì)的分離狀況良好，檢測靈敏度高，最小檢測限為0.1 μg。

3　用于藥品的含量測定

薄層掃描法也可以測定芪黃膠囊劑中黃芪甲苷的含量。用定量毛細(xì)管吸取黃芪甲苷對照品溶液、供試品溶液點(diǎn)樣于薄層板上，以氯仿、甲醇、水(13∶6∶2)下層溶液為展開劑，上行展開；在10%的硫酸乙醇中顯色，于105 ℃烘箱中烘至斑點(diǎn)顯色清晰；分別于390～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。采用雙波長反射鋸齒掃描法，狹縫0.4 mm×0.4 mm，進(jìn)行斑點(diǎn)光譜分析，得最大吸收波長為520 nm，因此，選定λS=520nm，λR=700nm。在本品含量測定中曾有人采用過高效液相紫外檢測器檢測，結(jié)果不理想，而文中的薄層掃描法簡便，結(jié)果可靠，穩(wěn)定性好，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

4　用于中藥指紋圖譜分析

色譜指紋圖譜除液相色譜外，還有最常用于中藥鑒別TLC。TLC指紋圖譜是以原來中國藥典的薄層色譜鑒別為依據(jù)，通過薄層色譜掃描儀建立的。中藥薄層圖像指紋圖譜TLC的一大優(yōu)勢是提供直觀形象的可見光或熒光圖像，特征圖像非常直觀、專屬性好、判斷速度快，非常適合基層日常分析與現(xiàn)場檢驗(yàn)使用[12]。色譜法是中藥指紋圖譜的主流方法，主要有GC、HPLC、TLC法。TLC法因其便宜、快速、開放性、靈活性等特點(diǎn)，被用于中藥指紋圖譜分析中。例如白芍總苷，它的HPLC指紋圖譜共檢出8個(gè)色譜特征峰，而TLC色譜指紋圖譜在香草醛-硫酸試劑顯色的條件下，可見原點(diǎn)部位在內(nèi)的大約15個(gè)有色條斑。袁旭江等[13]研究不同產(chǎn)地廣藿香藥材薄層色譜指紋圖譜的差別，取不同產(chǎn)地廣藿香樣品6個(gè)，采用TLC檢測其化學(xué)成分。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地廣藿香揮發(fā)油部位中成分薄層色譜行為相似，不同產(chǎn)地廣藿香甲醇提取部位與石油醚提取部位成分則存在明顯差異。崔淑芬等[14]使用薄層掃描法測定不同品種和產(chǎn)地的甘草并建立了指紋圖譜，可快速判斷藥材品質(zhì)，有效控制甘草質(zhì)量。所以說，TLC指紋圖譜庫是一種很好的有利于推進(jìn)我國中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的方法。

5　其他

TLC除了上述的用法外，還常用于為柱色譜選擇合適的展開劑，監(jiān)視柱色譜分離狀況和效果，用于判斷兩個(gè)化合物是否相同，用于確定混合物中含有的組分?jǐn)?shù)，用于檢測化學(xué)反應(yīng)過程和確定適宜反應(yīng)溫度和時(shí)間等其他方面。在天然藥物化學(xué)中，分離天然產(chǎn)物中的某種特定成分時(shí)，為了更好地確定藥物分離所需的展開劑，通常會(huì)先用TLC法篩選確定最合適的展開劑，使色譜柱分離狀況和效果最好。另外，在判斷兩個(gè)化合物是否相同或者混合物所含組分時(shí)，我們通常采用TLC法將樣品點(diǎn)于板上，若所點(diǎn)的樣品顯示出相同的顏色與Rf值則說明樣品相同或者樣品與對照品相同。王雪彥等[15]利用TLC法檢查牛奶中是否含有三聚氰胺這一組分。使用硅膠G預(yù)制板,以丙酮、氯仿、氨水(7∶0.5∶2)為展開劑，以1%對二甲氨基苯甲醛的鹽酸乙醇溶液為顯色劑，在365 nm紫外燈下檢視，結(jié)果顯示，我們建立的方法操作簡便快速、靈敏度高、成本低，可用于對大量樣品的篩查，特別適用于基層的推廣應(yīng)用。

傳統(tǒng)TLC技術(shù)由于精密度和重現(xiàn)性均較差，曾一度被其他快速發(fā)展起來的分離分析技術(shù)所取代。20 世紀(jì)80年代以來，薄層色譜才得到了更多的關(guān)注，這使得薄層色譜法發(fā)展成為最簡便的色譜技術(shù)。它不僅被廣泛應(yīng)用于藥物分析中的鑒別、雜質(zhì)檢查和含量測定，因其專屬性好、分析速度快、設(shè)備簡單、操作方便等特點(diǎn)，且被用于基層快檢，大大提高了藥品抽樣陽性率。加之直觀、經(jīng)濟(jì)、簡便的特點(diǎn)，將在中藥多樣品的分析中發(fā)揮更大的作用，使得薄層色譜在中藥指紋圖譜及手性藥物拆分等方面的研究倍受關(guān)注。因此，對薄層色譜技術(shù)研究的領(lǐng)域也將更加廣闊。

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[責(zé)任編輯段金卯]

Application of Thin Layer Chromatography (TLC) in pharmaceutical analysis

1. Pharmaceutical College of Henan University, Henan Kaifeng 475004, China; 2. Engineering Research Center of Henan University for Nanomaterials, Henan Kaifeng 475004, China

〔Objective〕This paper review the application of TLC in pharmaceutical analysis.〔Methods〕In this paper, domestic and foreign literatures of TLC in recent years were searched and analyzed.〔Results〕TLC was used of pharmaceutical analysis in many ways, such as identification, drug impurities of check and determination. 〔Conclusion〕With the development of modern analytical techniques, TLC has also been rapid development, and gradually for drug analysis in new areas, making it more widely used.

TLC; identification; impurity testing; assaying

1672-7606(2016)02-0077-04

2016-03-17

NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金資助項(xiàng)目(U1304826)；河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(152102310077)

尹麗(1992-)，女，河南信陽人，碩士研究生，從事藥物新材料的生物安全性研究工作。

TQ460.72

A

袁琦(1976-)，女，河南開封人，碩士，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事藥物研究工作。