高羽亭1.廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室，廣東東莞　523808；2.東莞市環(huán)境醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣東東莞 523808

氫醌對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞PARP-1表達(dá)的影響

高羽亭1，2
1.廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室，廣東東莞523808；2.東莞市環(huán)境醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣東東莞 523808

目的探討氫醌（HQ）對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）PARP-1基因表達(dá)的影響。方法2015年1月—2015年3月在東莞市環(huán)境醫(yī)學(xué)重點實驗室以BMSCs為對照組，以PARP-1沉默BMSCs為處理組，磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解HQ，分別以0、2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 μmol/L HQ染毒兩組細(xì)胞，應(yīng)用實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)檢測兩組細(xì)胞PARP-1基因表達(dá)的改變。結(jié)果與PBS組對比，2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L HQ染毒24 h后，BMSCs細(xì)胞PARP-1表達(dá)量分別為1.39倍、1.65倍（P＜0.05）、1.69倍（P＜0.05）、1.76倍（P＜0.05）和1.5倍（P＜0.05）；沉默細(xì)胞PARP-1表達(dá)量分別為1.37倍（P＜0.05）、1.58倍（P＜0.05）、1.84倍（P＜0.05）、2.15倍（P＜0.05）和1.93倍（P＜0.05）；與BMSCs細(xì)胞相比，沉默細(xì)胞中PARP-1表達(dá)水平下降了78%（P＜0.05）差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 兩組細(xì)胞PARP-1表達(dá)水平隨HQ劑量增加先升后降，PARP-1沉默能增加BMSCs對HQ的敏感性。

氫醌；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1

［Abstract］Objective To explore the influences of hydroquinone（HQ）in the expression of poly（ADP-ribose）polymerase-1（PARP-1）gene in bone mesenchymal stem cells（BMSCs）.Methods We did experiment in Dongguan Key Laboratory of Environmental Medicine from January 2015 to March 2015 BMSCs with PARP-1 silencing were sorted as the treated group，while BMSCs were considered as the control group.HQ dissolved in PBS buffer at the concentrations of 0，2.5，5.0，10.0，20.0and 40.0 μmol/L were respectively given to both cells.The PARP-1 gene expression was determined by reverse transcription real-time RT-PCR assay All the differences is statistically significant.Results Compared with PBS control group，in 2.5，5.0，10.0，20，40 μmol/L HQ groups 24 h after exposure，the expressions of PARP-1 of normal cells were1.39，1.65（P＜0.05），1.69（P＜0.05），1.76（P＜0.05）and 1.5 fold（P＜0.05）and those of defective cells were1.37（P＜0.05），1.58（P＜0.05），1.84（P＜0.05），2.15（P＜0.05）and1.93 fold（P＜0.05）.Compared with the control group，the expression of PARP-1 was reduced by 78%（P＜0.05）.Conclusion The express level of PARP-1 of both cells treated with different doses of HQ increased at first and then decreased.

［Key words］Hydroquinone；Bone mesenchymal stem cells；Poly（ADP-ribose）polymerase-1

氫醌（Hydroquinone，HQ）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，人類可通過多種途徑接觸如環(huán)境、職業(yè)接觸、吸煙、食物等［1］。HQ也是苯的重要代謝物之一，在人體中主要作用于骨髓［2］。骨髓造血微環(huán)境的重要成分之一就是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （bone mesenchymal stem cells，BMSCs），它能夠維持造血干細(xì)胞的特性及歸巢［3］。作為一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的核酶，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1［Poly（ADP-ribose）polymerase-1，PARP-1］參與了DNA損傷的修復(fù)和細(xì)胞凋亡等過程，在應(yīng)對遺傳毒性反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用［4］。以往對HQ毒效應(yīng)的研究多選用淋巴細(xì)胞或造血細(xì)胞，關(guān)于HQ對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究很少。我們于2015年1月—2015年3月在東莞市環(huán)境醫(yī)學(xué)重點實驗室以體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs細(xì)胞和PARP-1沉默細(xì)胞為研究對象，以HQ為受試物，對PARP-1基因表達(dá)進(jìn)行檢測，探討PARP-1基因在氫醌導(dǎo)致的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中的作用。

1　材料與方法

1.1試劑

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（立陶宛Fementas）；TRIzol Reagent（美國Invitrogene）；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒（德國Roche）；氫醌、DMSO和MTT（美國Sigma）；胎牛血清（杭州四季青）；低糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco）。

1.2BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠BMSCs細(xì)胞株由該實驗室保存，以1×105/mL接種于培養(yǎng)瓶中，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃5%CO2100%濕度條件下培養(yǎng)。

1.3PARP-1基因的RNAi表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs

以LipofectamineTM 2000介導(dǎo)，按照說明書將由本實驗室前期研究建立的PARP-1基因RNAi表達(dá)質(zhì)粒PARP-1-shRNA轉(zhuǎn)染至大鼠BMSCs。以BMSCs細(xì)胞為對照組，以PARP-1沉默BMSCs細(xì)胞為處理組。

1.4PARP-1基因mRNA表達(dá)水平檢測

1.4.1細(xì)胞總RNA提取按4×105細(xì)胞/孔密度將正常細(xì)胞和轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于6孔板，貼壁后分別給予2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L HQ染毒，設(shè)置PBS對照。24 h后提取細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計測定總RNA含量和純度，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.4.2PARP-1實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測以上述RNA樣品為模板，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA，qRT-PCR檢測PARP-1表達(dá)量，引物見表1。用2-△△CT法定量分析，采用比較Ct值法，以ACTB為內(nèi)參基因校正上樣量，計算公式為：倍數(shù)改變=2-△△CT，其中△△CT=△CT實驗-△CT對照，△CT=CTPARP-1-CTACTB，試驗重復(fù)3次。

表1　PCR引物序列

1.5統(tǒng)計方法

2　結(jié)果

染毒24 h后，qRT-PCR法檢測兩種細(xì)胞PARP-1基因表達(dá)。與BMSCs細(xì)胞相比，PARP-1-shRNA細(xì)胞中PARP-1表達(dá)水平下降了78%，說明沉默效果良好。與PBS組（1.03±0.14）相比，2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/LHQ處理的BMSCs細(xì)胞PARP-1表達(dá)量分別為（1.39±0.08）倍、（1.65±0.12）倍（P＜0.05）、（1.69± 0.19）倍（P＜0.05）、（1.76±0.19）倍（P＜0.05）和（1.5±0.03）倍（P＜0.05）；與PBS組（1.00±0.03）相比，沉默細(xì)胞PARP-1表達(dá)量分別為（1.37±0.03）倍（P＜0.05）、（1.58±0.06）倍（P＜0.05）、（1.84±0.08）倍（P＜0.05）、（2.15±0.12）倍（P＜0.05）和（1.93±0.09）倍（P＜0.05）差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。與PBS組相比，兩組細(xì)胞PARP-1表達(dá)均隨HQ劑量增加呈先增后降趨勢。HQ濃度為20 μmol/L時，2種細(xì)胞PARP-1基因表達(dá)最高。HQ濃度增加到40.0 μmol/L時，兩種細(xì)胞PARP-1表達(dá)水平明顯降低，且正常細(xì)胞降低的幅度更大，見圖1。

圖1　BMSCs及其PAPR-1沉默細(xì)胞HQ染毒24h后PARP-1基因mRNA表達(dá)水平

3　討論

作為造血微環(huán)境主要成分的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)的完整性對于保持機(jī)體造血的穩(wěn)定性非常重要［5］。職業(yè)人群接觸某些毒物后，可抑制骨髓的造血功能，造成血液系統(tǒng)病變。

苯暴露可導(dǎo)致人類白血病，HQ是苯毒性離體實驗研究常用的替代物質(zhì)，具有強(qiáng)氧化性，能引起DNA損傷斷裂［6］。PARP-1是DNA損傷所致的細(xì)胞早期應(yīng)激反應(yīng)的重要分子，可結(jié)合到DNA的損傷位點并被激活，參與DNA損傷的修復(fù)［7］。DNA損傷后的修復(fù)狀況對于細(xì)胞轉(zhuǎn)歸非常重要。如果不能迅速修復(fù)，則會導(dǎo)致細(xì)胞死亡；如果不能正確修復(fù)，則會導(dǎo)致基因變異，誘發(fā)癌癥。然而PARP-1表達(dá)水平的高低將影響DNA損傷修復(fù)的結(jié)局。實驗結(jié)果顯示，染毒24 h后，與PBS組相比，PARP-1-shRNA細(xì)胞中PARP-1表達(dá)水平比正常BMSCs下降了78%，2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L HQ處理細(xì)胞PARP-1的mRNA表達(dá)量分別為（1.37±0.03）倍、（1.58±0.06）倍、（1.84±0.08）倍、（2.15±0.12）倍，顯而易見，沉默細(xì)胞中PARP-1本底值雖然不高，但低劑量的HQ對其仍然具有一定的誘導(dǎo)作用。大量研究證明，PARP-1能夠參與DNA修復(fù)、細(xì)胞分化和死亡等，PARP-1表達(dá)增高有利于修復(fù)DNA的損傷［8］。當(dāng)HQ增加到40 μmol·L后，PARP-1表達(dá)開始下降。陶恭華［9］等人研究發(fā)現(xiàn)，對于16HBE細(xì)胞及其PARP-1缺陷細(xì)胞株，當(dāng)BaP染毒劑量小于10 μmol/L時，PARP-1表達(dá)隨著染毒劑量增加而增加，當(dāng)超過染毒劑量10 μmol/L時，PARP-1表達(dá)開始下降，PARP-1表達(dá)的變化趨勢與本研究結(jié)果一致，原因可能是PARP-1自身可作為多聚腺苷二磷酸（ADP）核糖基化作用的底物，發(fā)生自身修飾，可導(dǎo)致PARP-1的降解，進(jìn)而表達(dá)量下降［10］。雖然沉默細(xì)胞PARP-1表達(dá)水平下降的幅度比正常細(xì)胞小，但是因為其本底值不高，最終其表達(dá)水平仍比正常細(xì)胞低。有研究表明，由于PAPR-1沉默細(xì)胞喪失了部分修復(fù)能力，將導(dǎo)致其喪失誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力，因此在環(huán)境不良因素作用下，帶有堿基損傷的細(xì)胞可能向惡性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［11］。

綜上所述，低劑量HQ可誘導(dǎo)兩種細(xì)胞PARP-1表達(dá)水平的升高，當(dāng)HQ到達(dá)一定劑量后PARP-1表達(dá)反而會減低，且PARP-1沉默細(xì)胞對HQ的損傷敏感性更高。以上結(jié)果提示，PARP-1基因參與了HQ所引起的DNA損傷的修復(fù)過程，PARP-1的升高有利于DNA損傷的修復(fù)，過度升高或水平過低都將影響DNA損傷的修復(fù)。但是進(jìn)一步的證據(jù)以及PARP-1表達(dá)改變的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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Influences of Hydroquinone in Expression of Poly（ADP-ribose）Polymerase-1 Gene in Bone Mesenchymal Stem Cells

GAO Yu-ting1，2
1.Department of Labor Hygiene and Environmental Hygiene，School of Public Health，Guangdong Medical University，Dongguan，Guangdong Province，523808 China；2.Dongguan Key Laboratory of Environmental Medicine，Dongguan，Guangdong Province，523808 China

R329

A

2096-1782（2016）07-0001-04

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.07.001

廣東省自然科學(xué)基金資助課題（2015A030310532）；廣東省湛江市非資助科技攻關(guān)計劃課題（2013B01084）。

高羽亭（1982.10-），女，安徽安慶人，博士，講師，主要從事毒理學(xué)方面的研究。