秦鳳賢 賈冬舒 武軍 胡鐵軍 陳巍 莊紅

鹿血漿是鹿血經(jīng)抗凝處理后，利用離心分離技術(shù)得到的液體，占全血總量的55%左右。鹿血漿中水分占90%～92%，蛋白質(zhì)占 6.5%～8.5%，還有約2%的小分子物質(zhì)。鹿血漿中主要的生物活性物質(zhì)是鹿血漿蛋白，其主要是由球蛋白、白蛋白、纖維蛋白原組成。本研究以梅花鹿血液為原料，通過高速離心作用分離出鹿血漿，再利用蛋白酶的催化作用將其水解制備成鹿血漿肽。試驗(yàn)中以水解度為篩選指標(biāo)，考察了蛋白酶種類、復(fù)合酶配比、溫度、加酶量、pH、時(shí)間、熱處理溫度、熱處理時(shí)間對(duì)水解度的影響，并運(yùn)用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步優(yōu)化，得出最優(yōu)的酶解工藝參數(shù)，且對(duì)最優(yōu)酶解參數(shù)下制備的鹿血漿肽的抗氧化能力與酶解前的鹿血漿作了對(duì)比。

材料與方法

材料與試劑。鹿血：長(zhǎng)春嘉禾鹿業(yè)有限公司；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶為諾維信天津公司生產(chǎn)；DPPH、ABTS為Sigma公司；檬酸鈉，甲基紅、溴甲酚綠指示劑，碳酸氫鈉 ，氫氧化鈉，鹽酸，硼酸，無水乙醇，硫酸銅，硫酸鉀，濃硫酸，鐵氰化鉀，三氯乙酸、甲醛等均為北京化工廠。以上試劑均為分析純。

儀器與設(shè)備。電子分析天平、PH計(jì)、全自動(dòng)凱氏定氮儀、高速冷凍離心機(jī)、紫外可見分光光度計(jì)、磁力攪拌器。

方法。（1）鹿血漿的酶解。取10ml新鮮抗凝鹿血，根據(jù)鹿血漿中的蛋白質(zhì)含量用蒸餾水調(diào)節(jié)底物濃度，用2mol/l的HCl或NaOH調(diào)節(jié)，加入一定量的酶，在恒溫水浴振蕩器中水解一定時(shí)間，取出后沸水浴90℃，5min滅菌，冷卻至室溫，調(diào)pH 值至7，4000r/min離心10min，取上清液備用。（2）鹿血漿中蛋白質(zhì)的測(cè)定，參照 GB5009.5-2010方法進(jìn)行測(cè)定。（3）蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定。蛋白質(zhì)水解度DH=樣品中總氮/酶解液中游離氨基氮×100%；游離氨基氮的測(cè)定采用甲醛滴定法。（4）抗氧化活性測(cè)定方法。（5）DPPH自由基清除率的測(cè)定。取 25μl樣品溶液與0.7ml、0.1 mmol/L DPPH 無水乙醇溶液混勻，避光放置20min，在波長(zhǎng)517 nm 下測(cè)其吸光值 Ai；同時(shí)測(cè)其樣品對(duì)照Aj和空白對(duì)照Ac。

DPPH 清除率=

（6）ABTS 自由基清除率的測(cè)定。將 7 mmol/L ABTS 溶液與 2.45 mmol K2S2O8溶液按 1：1 混合均勻，避光放置 12-16 h，用磷酸鹽緩沖溶液（0.2 M，pH7.4）進(jìn)行稀釋，于 734 nm 波長(zhǎng)下吸光度達(dá)到 0.70±0.02，為 ABTS 測(cè)定液。取 4.0 ml ABTS 測(cè)定液，加入 100 μl樣品溶液，振蕩 30 s，在波長(zhǎng)為 734 nm 下測(cè)定吸光值（A1），空白管（A0）用磷酸鹽緩沖溶液替代樣品，對(duì)照管（A2）用磷酸鹽緩沖溶液代替 ABTS 測(cè)定液。

ABTS 自由基清除率=

（7）還原力的測(cè)定。在0.5 ml的樣品溶液中添加2.5 ml pH 值為 6.6的磷酸鹽緩沖溶液和2.5 ml 1%的鐵氰化鉀溶液，搖勻后，50℃水浴，保溫 20 min，再加入 2.5 ml 10%的三氯乙酸，4000 r/min 離心 10 min，取上清 2.5 ml 與 0.5 ml 0.1%的三氯化鐵溶液混勻，靜置10 min ，在波長(zhǎng) 700 nm 下測(cè)定吸光值，吸光度值越大，樣品還原能力越強(qiáng)。

結(jié)果與分析

酶解工藝參數(shù)的響應(yīng)面優(yōu)化。（1）響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶解溫度、加酶量、pH 值為自變量，以水解度為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行三因素三水平優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表1 所示。

（2）回歸方程的建立和模型評(píng)價(jià)。利用 RAS軟件對(duì)影響鹿血漿蛋白酶解的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，所得的二次回歸方程如下：

式中： X1-溫度（℃）；X2-加酶量（%）；X3-pH（%）。

并對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明模型的P=0.0004<0.01，說明回歸方程描述的各自變量與響應(yīng)值之間關(guān)系顯著，模型擬合性好。

鹿血漿酶解前后抗氧化能力比較。將在最優(yōu)酶解工藝條件下制備的鹿血漿酶解液與未水解的鹿血漿進(jìn)行DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力及還原能力比較，結(jié)果如表2 所示。

由上表可知，鹿血漿蛋白經(jīng)酶解處理成鹿血漿肽之后，其DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和還原能力均有明顯提高，說明鹿血漿經(jīng)酶解反應(yīng)后，保留并加強(qiáng)了其抗氧化功能。

結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)確定以中性蛋白酶和風(fēng)味酶以1：1組成復(fù)合酶，酶解梅花鹿血漿原料，其最佳酶解工藝條件為加酶量為5.8%，酶解的溫度為45.2℃，pH為7.05，所得酶解液的水解度為18.60%；酶解液的氧化還原性及自由基的清除能力，明顯優(yōu)于酶解前。

基金項(xiàng)目：長(zhǎng)春市重大科技攻關(guān)計(jì)劃（鹿血活性多肽微膠囊制備及產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)，項(xiàng)目編號(hào)：14KG070）。

作者簡(jiǎn)介：秦鳳賢（1980-），女，工程師。研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)肉產(chǎn)品；通訊作者簡(jiǎn)介：武軍（1964—），女，副教授，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。

（作者單位：秦鳳賢 賈冬舒 武 軍 胡鐵軍 陳 巍 長(zhǎng)春科技學(xué)院生物食品學(xué)院；莊 紅 吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院）