石瑞，張寧，李志英，何瑞瑞，余慧菁（忻州師范學(xué)院生物系，山西忻州034000）

β-環(huán)糊精超聲輔助提取山楂中熊果酸的研究

石瑞，張寧，李志英，何瑞瑞，余慧菁
（忻州師范學(xué)院生物系，山西忻州034000）

研究超聲輔助β-環(huán)糊精（β-CD）介質(zhì)中提取山楂中的熊果酸，分光光度法測(cè)定山楂中熊果酸的得率。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)，以山楂中的熊果酸含量為指標(biāo)，分別考察所選的各因素對(duì)超聲波法提取工藝的影響，并研究其抗菌作用。結(jié)果表明：最佳的提取工藝條件為乙醇濃度為80%，超聲波功率240 W，超聲提取時(shí)間30 min，液料比30∶1（mL/g），溫度為50℃，β-CD的用量m（山楂）∶m（β-CD）為1∶1為最佳工藝條件。山楂中的熊果酸得率為：7.264 mg/g。β-CD的加入有效的提高了熊果酸的得率。通過對(duì)照試驗(yàn)可知熊果酸對(duì)大腸桿菌，枯草桿菌具有抗菌作用。

山楂；熊果酸；超聲波法；β-環(huán)糊精

山楂為薔薇科植物山里紅（Crataegus pinnatifida Bge.Var.magcr N.E.Br）及大果山楂C.pinnatifida Bge.的干燥成熟果實(shí)，主要功能為消食健胃、行氣散瘀。為藥食兩用的藥材，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，山楂中含有熊果酸等三萜類成分［1］。

熊果酸，又名烏索酸［2］，具有廣泛的生物學(xué)活性，如抗菌瘤、抗肝炎、抗病毒、抗輻射、抗氧化、降血糖、降血脂、降血壓、提高免疫力、美白等［3-6］，廣泛的用于醫(yī)藥、保健食品及化妝品等領(lǐng)域。

環(huán)糊精（CD）具有疏水性的內(nèi)腔和親水性的表面，是超分子化學(xué)中的基礎(chǔ)物質(zhì)之一，它的包合特性使其在理論及實(shí)際應(yīng)用中得到迅速發(fā)展［7］。尤其在醫(yī)藥方面，CD和CD衍生物與傳統(tǒng)藥物載體材料相比，具有無毒，性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，此外，它結(jié)構(gòu)獨(dú)特，可用于提高藥物溶解度和穩(wěn)定性，增強(qiáng)藥物利用率［8-9］。

近年來超聲波法提取方法作為一種優(yōu)良的提取方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然植物中有效成分的提?。?0-13］。本試驗(yàn)通過擬使用β-環(huán)糊精的醇溶液通過超聲輔助方法提取山楂中的熊果酸，以期代替了傳統(tǒng)的水浸法，醇提法，以提高山楂中熊果酸的提取效率。優(yōu)化超聲提取山楂中熊果酸的最佳工藝條件。

1　材料和方法

1.1材料、試劑與儀器

山楂；熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品；香草醛；高氯酸；冰醋酸；β-環(huán)糊精；試驗(yàn)試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為一次蒸餾水。

0.1 mg/mL熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：準(zhǔn)確稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，以無水乙醇為溶劑，定容于100 mL容量瓶中，即得0.1 g/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品。

0.05 g/mL的香草醛-冰醋酸溶液的制備：取2.50 g香草醛，然后用冰醋酸定容到50 mL。

電子天平（FA2204B）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-2550）：島津公司，蘇州；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋）：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；中草藥粉碎機(jī)（FW135型）：天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2原料預(yù)處理

取干山楂，去除雜質(zhì)，用粉碎機(jī)粉碎。過60目篩，得到山楂粉末，儲(chǔ)藏備用。

1.3山楂中熊果酸的提取方法

稱取山楂粉末1 g于容量瓶中，用80%乙醇提取，超聲波功率為60%，液料比為30∶1（mL/g），溫度為50℃，β-CD的用量m（山楂）∶m（β-CD）為1∶1，超聲波輔助提取30 min。冷卻至室溫，脫色［14］。過濾，將所得濾液定容到50 mL容量瓶中作為樣品提取液。

1.4山楂中熊果酸的測(cè)定方法

使用香草醛-冰醋酸法［1］。

熊果酸得率的計(jì)算公式：得率/（mg/g）=250×1000×（吸光度A+0.015 5）/0.027 4

1.5培養(yǎng)基的制備

普通瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂條20 g，水1 000 mL，滅菌前濃度2 mol/L，用氫氧化鈉調(diào)pH值至7.0～7.2。

1.6菌懸液的制備

將供試菌種接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，進(jìn)行斜面活化，恒溫37℃培養(yǎng)18 h～24 h，用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落分別接種于新鮮肉湯培養(yǎng)基中，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h～24 h，采用滅菌水稀釋菌懸液后備用。

2　結(jié)果與分析

2.1吸收光譜的研究

按1.3的試驗(yàn)方法提取，以試劑空白作參比，在400nm～800nm之間測(cè)定吸光度，所得譜圖如圖1所示。

由圖1可知，當(dāng)提取介質(zhì)為β-CD乙醇溶液時(shí)，山楂中熊果酸的得率最高，β-CD能夠增加熊果酸的得率，計(jì)算此條件下的熊果酸得率為：5.152 mg/g。比傳統(tǒng)方法得率提高1.41倍，故選擇β-CD+乙醇為山楂中熊果酸的提取介質(zhì)。

2.2乙醇濃度對(duì)熊果酸得率的影響

準(zhǔn)確稱取1 g山楂粉末，固定其它條件不變，只改變乙醇濃度：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，按1.3的方法提取，按1.4的方法測(cè)定，結(jié)果見表1。

由表1知，隨著乙醇濃度的增大，山楂中熊果酸得率也在增大，濃度超過80%時(shí)，增大幅度不大?？紤]其節(jié)省藥品及得率。故取80%的乙醇為提取溶劑。

2.3超聲波提取功率的影響

圖1　 紫外光譜圖Fig.1　The UV absorbance spectrum

準(zhǔn)確稱取1 g山楂粉末，固定其它條件不變，只改變超聲波功率：160、200、240、280、320 W，按1.3的方法提取，按1.4的方法測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2　超聲波功率對(duì)熊果酸得率的影響Table 2　Effect of ultrasonic power on extraction of ursolic acid

表1　乙醇濃度對(duì)熊果酸得率的影響Table 1 Effects of ethanol concentrations on extraction of ursolic acid

由表2，隨著超聲波提取功率的增大，山楂中熊果酸得率也在增大，且有下降趨勢(shì)?？紤]其節(jié)能方面及得率。故取功率240 W為最優(yōu)超聲波提取功率。

2.4超聲波提取時(shí)間的影響

準(zhǔn)確稱取1 g山楂粉末，固定其它條件不變，只改變超聲波時(shí)間：15、20、30、45、60 min，按1.2.2的方法提取，按1.4的方法測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3　提取時(shí)間對(duì)熊果酸得率的影響Table 3　Effects of extracting time on extraction of ursolic acid

由表3可知，隨著超聲波提取時(shí)間的增大，得率先增大，后減小。后半段時(shí)間可能是由于提取時(shí)間過長，部分熊果酸分解等原因造成。綜上，30 min為最優(yōu)超聲波提取時(shí)間。

2.5液料比的選擇

準(zhǔn)確稱取1 g山楂粉末，固定其它條件不變，只改變液料比：10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g），按1.3的方法提取，按1.4的方法測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4　 液料比對(duì)熊果酸得率的影響Table 4　Effects of liquid-solid ratio on extraction of ursolic acid

由表4可知，隨著液料比的增大，得率先增大后減小，在液料比為30∶1（mL/g）時(shí)得率最高，故選取30∶1（mL/g）為最佳液料比。

2.6β-CD用量的選擇

準(zhǔn)確稱取1 g山楂粉末，固定其它條件不變，只改變?chǔ)?CD的量m（山楂）∶m（β-CD）為1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，按1.3的方法提取，按1.4的方法測(cè)定結(jié)果見表5。

表5 β-CD用量對(duì)熊果酸得率的影響Table 5　Effects of β-CD dosage on extraction of ursolic acid

由表5可知，隨著β-CD的增加，吸光度先增大后減小。綜合考慮。故選擇m（山楂）∶m（β-CD）=1∶1。

2.7溫度的選擇

準(zhǔn)確稱取1 g山楂粉末，固定其它條件不變，只改變溫度：30、40、50、60、70℃，按1.3的方法提取，按1.4的方法測(cè)定，結(jié)果見表6。

表6　 溫度對(duì)熊果酸得率的影響Table 6　Effects of temperature on extraction of ursolic acid

由表6知，隨著溫度的升高，得率先增加后減小，在溫度為50℃時(shí)熊果酸有最大得率，故選擇溫度為50℃。

2.8正交試驗(yàn)

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，選出影響熊果酸得率的4個(gè)因素：超聲波提取時(shí)間、超聲波提取功率、液料比、溫度。進(jìn)行優(yōu)化組合，以所測(cè)得吸光度為查考指標(biāo)，采用L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)選出超聲波輔助β-CD提取法提取山楂中熊果酸的最佳工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)因素水平如表7所示。

表7　正交試驗(yàn)因素水平Table 7　Factors and levels in the orthogonal array design

2.9超聲波法正交試驗(yàn)極差結(jié)果分析表

超聲波法正交試驗(yàn)極差結(jié)果分析表見表8。

表8　超聲波法正交試驗(yàn)極差結(jié)果分析表Table 8　The results of range analysis of orthogonal experiments by ultrasonic method

由極差分析可知，各因素對(duì)熊果酸提取影響因素大小為：A（時(shí)間）＞D（溫度）＞B（液料比）＞C（超聲波功率）。故最佳試驗(yàn)方案是：A1B1C2D2，即超聲波時(shí)間為30 min，液料比為20∶1（mL/g），超聲波功率為240 W，溫度為50℃。計(jì)算在此條件下的熊果得率為7.264 mg/g。而單因素的最佳提取條件下得率為6.346 mg/g，二者相差不大。

3　抗菌作用的研究

3.1熊果酸抗菌效果

在超凈工作臺(tái)上用接種環(huán)挑取各供試菌的單個(gè)菌落劃線于藥物平板上，同時(shí)以不加藥物、只加菌懸液的瓊脂平板作陽性對(duì)照，加無菌水于陰性平板上作陰性對(duì)照。然后將平板倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h～24 h，取出觀察結(jié)果。結(jié)果見圖2～圖3及表9。

圖2　熊果酸對(duì)枯草桿菌的抑菌效果圖Fig.2　The antibacterial effect of Bacillus subtilis

圖3　熊果酸對(duì)大腸桿菌的抑菌效果Fig.3　The antibacterial effect of Escherichia coli

表9　 生長抑制試驗(yàn)結(jié)果Table 9　Results of growth inhibition test

由表9可知，熊果酸對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有抗菌作用，且熊果酸對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果強(qiáng)于大腸桿菌的抑菌效果。

4　結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過正交法試驗(yàn)的優(yōu)化，獲得超聲波提取山楂中熊果酸的最佳工藝條件：乙醇濃度為80%，超聲波功率240 W，提取時(shí)間30 min，溫度為50℃，液料比30∶1（mL/g），m（β-CD）∶m（山楂）=1∶1，此時(shí)山楂中熊果酸的提取得率達(dá)7.264 mg/g。β-CD的加入有效地增加了山楂中熊果酸的得率。

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Study on the Ursolic Acid Ultrasonic-assisted Extraction of β-Cyclodextrin from the Hawthorn

SHI Rui，ZHANG Ning，LI Zhi-ying，HE Rui-rui，YU Hui-jing
（Department of Biology，Xinzhou Teachers University，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

To study the extraction of ursolic acid from Hawthorn by ultrasonic-assisted β-CD.The yield of the ursolic acid was determined by UV-spectrophotometry，based on the single factor test and orthogonal test using ursolic acid as an index.The influence of various factors on the extraction process of ultrasonic wave was detected.The optimum extraction conditions were 80%ethanol concentration，ultrasonic power of 240 W，extraction time of 30 min，liquid-solid ratio of 30∶1（mL/g），the temperature of 50℃，β-CD of the amount m（hawthorn）∶m（β-CD）of 1∶1.Ursolic acid yield of Hawthorn：7.264 mg/g.The yield of ursolic acid was obviously increased in the presence of β-CD.The results shows of contrast test：ursolic acid on escherichia coli，bacillus subtilis has antibacterial effect.

crataegus；ursolicacid；ultrasonic-assisted；β-cyclodextrin

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.022

忻州師范學(xué)院青年基金項(xiàng)目（20126）

石瑞（1985—），女（漢），助教，碩士，主要從事植物營養(yǎng)及逆境生理生化研究。

2016-01-04