李三省，張偉豐，王亮，*，陳義勇（.昌吉州產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所，新疆昌吉800；.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊80046；.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟5500）

阿魏菇多糖超聲微波輔助提取及其抗氧化活性

李三省1，張偉豐2，王亮2，*，陳義勇3
（1.昌吉州產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所，新疆昌吉831100；2.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046；3.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500）

以阿魏菇作為原料，水作為提取溶劑，通過響應(yīng)面優(yōu)化超聲-微波協(xié)同輔助提取阿魏菇多糖工藝，并和傳統(tǒng)水浴浸提法進(jìn)行比較，采用清除DPPH·、·OH和O2-·模型對其體外抗氧化活性進(jìn)行評價。結(jié)果表明：超聲-微波輔助提取阿魏菇多糖的最佳的工藝條件為：料液比1∶50（g/mL），提取時間10min，微波功率60W。與傳統(tǒng)水浴浸提法相比，超聲-微波輔助提取縮短了提取時間，阿魏菇多糖的得率由2.23%增加到5.6%。超聲-微波協(xié)同輔助提取對阿魏菇多糖的結(jié)構(gòu)基本沒有影響。阿魏菇多糖具有較強的清除DPPH·、·OH和O2-·的能力，并與質(zhì)量濃度呈一定正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)阿魏菇多糖質(zhì)量濃度達(dá)到5mg/mL時，對DPPH·、·OH和O2-·的清除率分別達(dá)到67%、59%和63%，但弱于VC的抗氧化活性。關(guān)鍵詞：超聲-微波協(xié)同輔助提??；阿魏菇多糖；抗氧化

因此本文將超聲和微波提取技術(shù)結(jié)合起來，充分利用超聲和微波提取技術(shù)的優(yōu)點，探討超聲-微波協(xié)同輔助技術(shù)（Ultrasonic microwave assisted extraction，UMAE）提取阿魏菇多糖的最佳工藝，并和傳統(tǒng)水浴浸提（Traditional warer bath extraction，TWBE）進(jìn)行比較，同時探討阿魏菇多糖的抗氧化活性，旨在為阿魏菇多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

阿魏菇（購自烏魯木齊南山），經(jīng)新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物教研室鑒定為阿魏菇子實體。乙醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸等均為分析純。

CW-2000超聲-微波協(xié)同萃取儀：上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司；EZ-DRY冷凍干燥儀：美國FTS公司；Nicolet Nexus傅里葉紅外光譜儀：Thermo Electron公司；SHB-B循環(huán)水式真空泵：鄭州長城科工貿(mào)公司；RE－52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器公司；DJ-04粉碎機：上海淀久中藥機械制造有限公司；UV-2000紫外可見分光光度計：龍尼柯（上海）儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機：長沙湘儀離心機有限公司。

1.2方法

1.2.1阿魏菇多糖超聲-微波協(xié)同輔助提取

新鮮阿魏菇在50℃條件下真空干燥后粉碎，過80目篩，將阿魏菇粉置于超聲-微波萃取儀250 mL玻璃萃取容器中，固定超聲功率50 W，以水作為萃取溶劑，在一定的萃取時間和微波功率條件下提取阿魏菇多糖，萃取完成后冷卻，離心（1 000 r/min，15 min）得到上清液，將上清液濃縮后，按體積比1∶4加入95%乙醇，4℃條件下過夜，棄去上層液體，將沉淀冷凍干燥得到阿魏菇多糖。

1.2.2阿魏菇多糖含量測定及得率計算

阿魏菇多糖含量測定采用苯酚-硫酸法［7］，得率按下列公式計算：

阿魏菇多糖得率/%=多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量×100

1.2.3傳統(tǒng)水浴浸提法與超聲-微波輔助提取的比較

1.2.3.1得率的比較

分別在兩種提取方法的最優(yōu)工藝條件下提取阿魏菇多糖，平行提取3次，分別測定多糖得率，然后取平均值。

1.2.3.2紅外光譜分析

分別取超聲-微波協(xié)同輔助提取和傳統(tǒng)水浸提法兩種提取方法所得的阿魏菇多糖1 mg，KBr研磨壓片，采用Nicolet Nexus FT-IR于4 000 cm-1～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，分辯率為4 cm-1。

1.2.4阿魏菇多糖的抗氧化活性

1.2.4.1羥基自由基（·OH）清除能力的測定［8］

加入不同質(zhì)量濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）1 mL的阿魏菇多糖溶液置于不同燒杯中，然后分別加入9 mmol/L FeSO41 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇1 mL，最后加入8.8mmol/LH2O21mL啟動反應(yīng)，37℃反應(yīng)0.5h，以蒸餾水為參比，在510 nm下測量各濃度的吸光度?？紤]到多糖本身的吸光值，以9 mmol/L FeSO41 mL、9 mmol/L水楊酸-乙酸1 mL、不同濃度的多糖溶液1mL 和1 mL蒸餾水做為多糖的本底吸收值。每個質(zhì)量濃度做3個平行管，結(jié)果取平均值。根據(jù)公式（1）計算羥基自由基（·OH）清除率，按上述步驟測定抗壞血酸對羥自由基的清除率。

式中：A0為空白對照液的吸光度；Ax為加入多糖溶液后的吸光度；Ax0為不加顯色劑H2O2多糖溶液本底吸光度。

1.2.4.2清除超氧陰離子自由基（O2-·）的測定［9］

加入不同質(zhì)量濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）1 mL的阿魏菇多糖溶液5 mL置于不同燒杯中，空白組、自氧化組分別加入5 mL蒸餾水，然后分別加入50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.2）4.5 mL，混勻后在25℃水浴中保溫20 min，取出后樣品組和自氧化組立即加入在25℃預(yù)熱過的3 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL（以10 mmol/L HCl配制），空白組加0.3 mL 10 mmol/L HCl溶液，迅速搖勻后倒入比色杯，325 nm下每隔30秒測定吸光度，計算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的變化率，并與空白液比較，根據(jù)公式（2）計算超氧陰離子自由基（O2-·）清除率，按照上述步驟測定抗壞血酸對超氧陰離子自由基的清除率。

式中：ΔA0為鄰苯三酚的自氧化速率；ΔA為加入多糖溶液后鄰苯三酚的自氧化速率；單位均為吸光度每分鐘的增值。

1.2.4.3清除DPPH自由基的測定［10］

準(zhǔn)確移取2 mL DPPH溶液（0.1 mmol/L），加入2 mL不同質(zhì)量濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）的多糖樣品溶液，混勻，黑暗中放置30 min后，517 nm波長處測吸光度。以95%乙醇為空白，測定2.0 mL多糖溶液與2.0 mL DPPH溶液吸光度值A(chǔ)i，測定2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL 60%乙醇吸光度值A(chǔ)0以及2.0 mL多糖溶液與2.0 mL 60%乙醇混合液吸光度值A(chǔ)j。按式（3）計算DPPH自由基清除率，按照上述步驟測定抗壞血酸對DPPH自由基的清除率。

式中：A0為乙醇加DPPH溶液的吸光度；Ai為多糖加DPPH溶液的吸光度；Aj為多糖加乙醇的吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1超聲-微波協(xié)同輔助提取阿魏菇多糖工藝參數(shù)的優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以微波功率、提取時間和料液比作為主要因素，以阿魏菇多糖得率作為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的二次回歸方程來擬合因素和指標(biāo)（響應(yīng)值）之間的函數(shù)關(guān)系，確定阿魏菇多糖提取的工藝參數(shù)。根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，分別用X1、X2、X3表示料液比、提取時間和微波功率，按方程Xi=（Xi-X0）/ΔX對自變量進(jìn)行編碼。以阿魏菇多糖得率為響應(yīng)值（Y），每一自變量的低、中、高實驗水平分別以－1、0、+1進(jìn)行編碼。因素編碼及自變量水平見表1，試驗結(jié)果見表2。

表1　超聲-微波提取阿魏菇多糖提物工藝條件的因素編碼Table 1　The encoding values of the factors of the process conditions of extracting PFP by UMAE

表2　Box-Behnken設(shè)計方案及試驗結(jié)果Table 2　Box-Behnken design and results

續(xù)表2　Box-Behnken設(shè)計方案及試驗結(jié)果Continue table 2　Box-Behnken design and results

應(yīng)用Design-Expert 8.06軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合和回歸方差分析，結(jié)果見表3。

表3　回歸方程的方差分析Table 3　Analysis of variance of the regression equation

料液比（X1）、提取時間（X2）、功率（X3）多糖得率

用確立的回歸方程來預(yù)測模型，結(jié)果表明多糖得率回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2值達(dá)到了0.929 9，由P值可知，模型具有顯著性（P=0.002 8），方程的回歸模型失擬項P值為0.750 5，無顯著性影響，說明數(shù)據(jù)沒有異常點，模型適當(dāng)。該回歸方程能夠較好地描述因素與得率之間的真實關(guān)系，可以用來預(yù)測最佳提取工藝條件。

根據(jù)所建立的數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化得到最佳條件為：料液比為1∶52.04（g/mL），提取時間為9.82 min，微波功率為61 W，得率為5.89%。結(jié)合實際，將參數(shù)修正在優(yōu)化參數(shù)附近，最終確定最佳工藝條件為：料液比1∶50（g/mL），提取時間10 min，微波功率60 W。在此條件下阿魏菇多糖理論得率為5.38%。采用上述最優(yōu)條件進(jìn)行阿魏菇多糖提取試驗，進(jìn)行驗證試驗，平行3次試驗取平均值，實際測得的多糖得率為5.6%，與預(yù)測值無顯著差異，說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的工藝條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的實踐價值。

2.2傳統(tǒng)水浴浸提法與超聲-微波協(xié)同提取法的比較

2.2.1得率的比較

在預(yù)試驗及正交試驗的基礎(chǔ)上，得出水浴提取阿魏菇多糖的最佳條件：提取溫度為70℃，時間4 h，料液比1∶40（g/mL），分別在超聲-微波輔助提取最佳工藝［料液比1∶50（g/mL），時間10 min，功率60 W］。和傳統(tǒng)水浴最佳條件進(jìn)行3次阿魏菇多糖的提取試驗，然后取平均值，比較傳統(tǒng)水浴法與超聲-微波輔助提取法對阿魏菇多糖得率的影響，結(jié)果見表4。

表4　不同提取方法對阿魏菇多糖得率的影響Table 4　Effect of different methods on the yield of PFP

從表4可以看出：超聲-微波輔助提取阿魏菇多糖的得率明顯高于水浴浸提法，得率由2.23%增加到5.6%，原因是微波升溫快速、萃取效率高，超聲波具有機械振動作用和空化作用，可以有效的破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)［11］，從而使阿魏菇細(xì)胞內(nèi)的多糖更多的釋放，從而提高多糖得率。

2.2.2紅外光譜的比較

為了比較傳統(tǒng)水浴浸提與超聲-微波協(xié)同輔助提取對阿魏菇多糖重要基團(tuán)的影響，對兩種方法提取的阿魏菇多糖進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果見圖1。

圖1　 紅外光譜對比圖Fig.1　Comparison of infrared spectra of PFP

從圖1可以看出：在3 340.1 cm-1及附近出現(xiàn)的寬峰是糖分子內(nèi)或分子間氫鍵O-H伸縮振動峰，在2 750 cm-1～3 000 cm-1出現(xiàn)一個弱峰是次甲基（-CH2-）中的C-H的伸縮振動的吸收峰，在1 024.2 cm-1及附近出現(xiàn)的吸收峰是由糖環(huán)上C-O伸縮振動所引起的，兩種方法所得的阿魏菇多糖的峰形位置基本相同，表明超聲-微波協(xié)同輔助提取對阿魏菇多糖的結(jié)構(gòu)基本沒有影響。

2.3阿魏菇多糖的抗氧化活性

阿魏菇多糖的抗氧化活性結(jié)果見圖2。

圖2　阿魏菇多糖的抗氧化活性Fig.2　Antioxidant activity of PFP

從圖2可以看出，阿魏菇多糖具有較強的清除DPPH·、·OH和O2-·的能力，并與質(zhì)量濃度呈一定正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)阿魏菇多糖質(zhì)量濃度達(dá)到5 mg/mL時，對DPPH·、·OH和O2-·的清除率分別達(dá)到67%、59%和63%，但弱于VC的抗氧化活性。

3　結(jié)論

1）確定超聲-微波輔助提取阿魏菇多糖的最佳的工藝條件為：料液比1∶50（g/mL），提取時間10 min，微波功率60 W，在此條件下阿魏菇多糖得率為5.6%。

2）與傳統(tǒng)水浴浸提法相比，超聲-微波輔助提取阿魏菇多糖縮短了提取時間，阿魏菇多糖的得率由2.23%增加到5.6%。

3）紅外光譜分析表明超聲-微波協(xié)同輔助提取對阿魏菇多糖的結(jié)構(gòu)基本沒有影響。

4）阿魏菇多糖具有較強的清除DPPH·、·OH和O2-·的能力，并與質(zhì)量濃度呈一定正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)阿魏菇多糖質(zhì)量濃度達(dá)到5 mg/mL時，對DPPH·、·OH和O2-·的清除率分別達(dá)到67%、59%和63%，但弱于VC的抗氧化活性。

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Ultrasonic Microwave Assisted Extraction Technology of Polysaccharides from Pleurotus ferulae and Its Antioxidant Activity

LI San-sheng1，ZHANG Wei-feng2，WANG Liang2，*，CHEN Yi-yong3
（1.Changji Institute of Product Quality Inspection，Changji 831100，Xinjiang，China；2.School of College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，Xinjiang，China；3.School of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

Pleurotus ferulae was used as raw material.Water was used as extraction solvent.Ultrasonic microwave assisted extraction（UMAE）technology of polysaccharides from Pleurotus ferulae（PFP）was optimized by response surface methodology.The traditional water bath extraction（TWBE）was compared with UMAE.Antioxidant activity of PFP in vitro was evaluated by hydroxyl，superoxide anion and DPPH free radical scavenging method The optimum technology condition for ultrasonic microwave assisted extraction of PFP was determined as follows：the material-liquid ratio was 1∶50（g/mL），the extraction time was 10 min and microwave power was 60 W.Compared with the traditional water bath extraction，the ultrasonic microwave assisted extraction was time saving and increased the yield from 2.23%to 5.6%.UMAE had no effect basically on structure of PFP.PFP had strong scavenging effects of DPPH radical，hydroxyl radical and superoxide anion radical.Scavenging effects had the positive correlation with the concentration.when concentration of PFP reached 5 mg/mL，scavenging rate of DPPH radical，hydroxyl radical and superoxide anion radical was 67%，59%and 63%，respectively.However，Antioxidant activity of PFP was week compared with VC.

ultrasonicmicrowaveassistedextraction；polysaccharidesfromPleurotusferulae；antioxidant阿魏菇（Pleurotus ferulae）又名阿魏側(cè)耳、阿魏蘑，因其生長在新疆干旱草原上的草本植物阿魏上而得名。其子實體具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值［1］。研究發(fā)現(xiàn)阿魏菇多糖（polysaccharides from Pleurotus ferulae，PFP）具有增強免疫力［2］、抗炎［3］等功效。近年來，超聲和微波輔助萃取技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物有效成分的提取，微波作為一種電磁能，具有提取時間短的特點。超聲波作為彈性介質(zhì)中的一種機械波，具有快捷、能耗低、不破壞有效成份、提取效率高的特點［4］。目前阿魏菇多糖的提取方法主要有傳統(tǒng)水浴浸提法［5］、超聲波法［6］，但是應(yīng)用超聲-微波輔助技術(shù)提取阿魏菇多糖的研究鮮見報道。

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.017

2013年新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項目計劃（指令性）項目（2013911071）

李三省（1964—），男（漢），高級工程師，本科，研究方向：化工產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗。

2015-07-18