高 星，李 欣，李 錚，杜曼婷，張彩霞，張德權(quán)，丁 武

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

宰后肌肉中肌球蛋白磷酸化調(diào)控肌動(dòng)球蛋白解離作用機(jī)制

高 星1，2，李 欣2，李 錚2，杜曼婷2，張彩霞2，張德權(quán)2，丁 武1

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

【目的】研究宰后肌肉中肌球蛋白磷酸化與肌動(dòng)球蛋白解離之間的關(guān)系，分析其磷酸化水平的變化對(duì)肌動(dòng)球蛋白解離的影響，探究肌球蛋白磷酸化對(duì)宰后肌肉肌節(jié)長度與嫩度的作用。【方法】取宰后30 min內(nèi)的羊背最長肌，在4℃條件下分別成熟6、24、48和72 h，通過SDS-PAGE電泳、Pro-Q染色和蛋白質(zhì)免疫印跡測定肌球蛋白的磷酸化水平和肌動(dòng)球蛋白解離程度隨宰后時(shí)間的變化；測定肌動(dòng)球蛋白ATP酶的活性，分析宰后不同時(shí)間點(diǎn)肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白結(jié)合作用力的強(qiáng)弱；采用透射電鏡分析宰后肌節(jié)長度隨時(shí)間的變化。【結(jié)果】研究發(fā)現(xiàn)宰后肌肉中肌球蛋白輕鏈2的磷酸化水平在0.5—48 h快速降低（P＜0.05），并在48 h達(dá)到最低點(diǎn)，在48—72 h有所升高（P＜0.05），但其最終磷酸化水平明顯低于初始值。肌動(dòng)球蛋白的解離程度在宰后初期（0.5—6 h）顯著降低（P＜0.05），在6—48 h顯著升高（P＜0.05），并于48—72 h維持穩(wěn)定，其最終解離程度顯著高于宰后0.5 h的初始值。肌動(dòng)球蛋白ATPase活性在宰后初期（0.5—6 h）略有升高，6—24 h快速上升（P＜0.05），并在24 h達(dá)到最高點(diǎn)，24—72 h逐漸降低；而肌節(jié)長度的變化則與之相反，呈先下降后上升的趨勢，并在24 h達(dá)到肌節(jié)最短點(diǎn)?！窘Y(jié)論】羊宰后肌肉中的肌球蛋白輕鏈2磷酸化水平的變化對(duì)肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白的相互作用有較大的影響，且肌節(jié)收縮（肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白的相互作用力）與肌動(dòng)球蛋白的解離（肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白的相互作用量）并不是一個(gè)同步的進(jìn)程。肌球蛋白輕鏈2的磷酸化修飾負(fù)向調(diào)控肌動(dòng)球蛋白解離和肌動(dòng)球蛋白ATPase活性，導(dǎo)致肌節(jié)的收縮與舒張，進(jìn)而調(diào)控肉品最終的嫩度。

磷酸化；肌球蛋白重鏈；肌球蛋白輕鏈2；肌動(dòng)球蛋白；解離；羊背最長肌

0　引言

【研究意義】蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中最常見、最重要的一種共價(jià)鍵修飾［1］，它可以調(diào)控靶蛋白的功能、位置及結(jié)合特異性［2］。生物體的細(xì)胞發(fā)育、增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡、肌肉收縮等大部分生命活動(dòng)幾乎都受蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化這一可逆過程的調(diào)節(jié)［3］。磷酸化的肌球蛋白是維持細(xì)胞骨架活性及細(xì)胞功能的重要效應(yīng)因子［4-5］。肌球蛋白輕鏈周期性的磷酸化與去磷酸化的狀態(tài)，是細(xì)胞發(fā)生運(yùn)動(dòng)和收縮的必備條件［6］，對(duì)肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白的相互作用具有重要的調(diào)控作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白是肌原纖維中含量最豐富的兩種蛋白質(zhì)，分別約占肌原纖維蛋白總量的 50%和 20%［7］。GOLL等［8］提出宰后肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白相互作用的改變，即僵直過程中所形成的肌動(dòng)球蛋白的解離可能也是導(dǎo)致嫩度改善的原因之一。其他研究也得出了相似結(jié)論，牛、羊宰后24 h內(nèi)肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白相互作用的加強(qiáng)使得肌節(jié)長度縮短，肉品嫩度顯著降低，而在解僵成熟階段肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的結(jié)合減弱，使得肌節(jié)變長，這可能促進(jìn)了宰后成熟過程中肌肉嫩度的增加［9］。TAKAHASHI等［10-11］研究也表明，肌節(jié)長度的增加說明僵直后肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白之間的相互作用發(fā)生改變，弱化了肌原纖維的緊密結(jié)構(gòu)。1973年，PERRIE等［12］首次在兔骨骼肌中發(fā)現(xiàn)肌球蛋白輕鏈2的磷酸化現(xiàn)象，隨后人們圍繞其磷酸化的形成機(jī)制和功能作用做了一系列相關(guān)的研究。有研究表明，肌球蛋白輕鏈2的磷酸化修飾會(huì)破壞肌肉粗絲和細(xì)絲的相互作用，使肌球蛋白重鏈頭部遠(yuǎn)離粗絲［13-15］，促進(jìn)了肌球蛋白單體與活躍的收縮細(xì)絲的結(jié)合，并且調(diào)控肌球蛋白的活性［16］，同時(shí)對(duì)肌節(jié)的長度也會(huì)產(chǎn)生影響［17-18］。【本研究切入點(diǎn)】肌球蛋白輕鏈2磷酸化會(huì)影響肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白的相互作用，但在宰后成熟過程中，肌球蛋白輕鏈2的磷酸化水平及肌動(dòng)球蛋白解離是如何變化的，以及如何調(diào)控肌動(dòng)球蛋白解離和肌節(jié)收縮的機(jī)制并不明確。因此，本研究通過分析宰后肌肉中肌球蛋白磷酸化與肌動(dòng)球蛋白解離之間的關(guān)系，初步探索肌球蛋白的磷酸化修飾對(duì)肌動(dòng)球蛋白解離以及其對(duì)肉品嫩度的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】以羊背最長?。╫vine longissimus dorsi）為原料，通過分析宰后肌肉肌球蛋白輕鏈2的磷酸化水平、肌動(dòng)球蛋白解離程度、肌動(dòng)球蛋白 ATPase活性和肌節(jié)長度等指標(biāo)的變化，探究宰后成熟過程中肌肉中肌球蛋白輕鏈2的磷酸化修飾對(duì)肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白相互作用的影響。

1　材料與方法

試驗(yàn)于2015年3—7月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工研究所肉品質(zhì)與加工實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 宰后立刻取羊（5只）的背最長肌，剔除可見的筋膜及結(jié)締組織，4℃分別放置 0、6、24、48和72 h時(shí)取樣，電鏡樣品放置于2.5%的戊二醛固定液（pH 7.2）中保存；其余樣品裝于凍存管液氮速凍后，-80℃保存。

1.1.2 試劑 蛋白濃度測定試劑盒購自美國 Pierce公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris Base）、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺、ATP酶活性測定試劑盒購自美國Sigma公司；Pro-Q Diamond、SYPRO Ruby染色液購自美國Invitrogen公司；氯化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、乙醇、乙酸、乙腈等為國產(chǎn)分析純試劑，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白提取 肌漿及肌原纖維蛋白的提取參照LAMETSCH等［19］的方法：將1 g肌肉組織加入6 mL預(yù)冷的蛋白提取液（0.1 mol·L-1Tris，0.01 mol·L-1二硫代蘇糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT），pH 8.3，蛋白酶抑制劑（50 mL/片），磷酸酶抑制劑（10 mL/片））中，用Ultra Turrax T25勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿（2次，15 s/次），然后離心（20 000×g，4℃，30 min），得到上清液（肌漿蛋白溶液）和沉淀（肌原纖維蛋白）。沉淀溶解于 5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液（60℃）后勻漿 30 s，80℃加熱20 min，即得到肌原纖維蛋白溶液。蛋白濃度用二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）試劑盒測定。

肌動(dòng)蛋白及肌動(dòng)球蛋白的提取參考 OKITANI等［20］的方法，并稍作修改：取2 g肉樣，加入25 mL Weber-Edsall 溶液（0.6 mol·L-1KCl，0.04 mol·L-1NaHCO3，0.01 mol·L-1Na2CO3，蛋白酶抑制劑50 mL/片，pH 7.2），用Ultra Turrax T25勻漿機(jī)勻漿3 次（30 s/次，中間間隔10 s）。勻漿液置于4℃培養(yǎng)箱內(nèi)，搖床震蕩24 h后，用兩層尼龍網(wǎng)過濾除去不溶物質(zhì)，取10 mL溶液，即為總肌動(dòng)蛋白溶液。取10 mL剩余溶液加入20 mL超純水稀釋，使提取液中KCl的濃度至0.2 mol·L-1，然后4℃搖床振蕩60 min ，離心（4℃，15 000×g，20 min），上清液即為游離肌動(dòng)蛋白溶液。將沉淀溶解于3 mL KCl-Tris溶液中（0.6 mol·L-1KCl，0.02 mol·L-1Tris-HCl，pH 7.2），即為肌動(dòng)球蛋白溶液。蛋白濃度用BCA試劑盒測定。

1.2.2 肌球蛋白磷酸化水平的測定 將肌原纖維蛋白樣品與上樣緩沖液等體積混合后在沸水浴中加熱 5 min，冷卻后離心（12 000×g，1 min），取上清液上樣，肌原纖維蛋白的上樣量為5 μg。濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為15%（用于分析肌球蛋白輕鏈2的磷酸化水平），分離膠濃度為7.5%（用于分析肌球蛋白重鏈的磷酸化水平）。設(shè)置初始電壓為70 V，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，將電壓恒定在110 V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)離凝膠底部0.5 cm處。隨后進(jìn)行Pro-Q染色和Ruby染色，染色流程參考陳立娟等［21］的方法。

使用BIO RAD凝膠成像系統(tǒng)對(duì)染色后的凝膠拍照，利用Quantity One 4.6.2軟件（Bio-Rad，美國）對(duì)肌球蛋白重鏈條帶和肌球蛋白輕鏈2條帶的光密度值進(jìn)行定量，得到對(duì)應(yīng)的Pro-Q Diamond染色光密度值（P）和SYPRO Ruby染色光密度值（T），該條帶的光密度值之比P/T即為該條帶蛋白的蛋白質(zhì)磷酸化水平。

1.2.3 肌動(dòng)球蛋白解離程度的測定 將游離肌動(dòng)蛋白樣品與稀釋3倍的總肌動(dòng)蛋白樣品分別和上樣緩沖液等體積混合后在沸水浴中加熱 5 min，冷卻后離心（12 000×g，1 min），取上清液上樣，上樣量均為6 μL。電泳結(jié)束后用半干轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad，美國）將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，TBS溶液（0.01 mol·L-1Tris，0.15 mol·L-1NaCl，pH 7.5）漂洗（3次，2 min/次）。轉(zhuǎn)印后的 PVDF 膜用封閉液（含0.05% Tween-20、3%牛血清白蛋白的TBS溶液）室溫封閉2 h，然后與用封閉液 1∶1 000稀釋的肌動(dòng)蛋白抗體（A4700，Sigma）室溫孵育2 h，隨后將膜用三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液（Tris buffered saline-tween-20，TBST1）（含0.1% Tween-20的TBS溶液）漂洗3次后與二抗（二抗為辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，用封閉液1∶5 000稀釋）室溫孵育2 h，膜用TBST2溶液（0.05 mol·L-1Tris，0.15 mol·L-1NaCl，0.1% Tween-20，pH 7.5）漂洗3次后使用電化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence，ECL）顯色劑顯色，并使用凝膠成像儀拍照。采用Quantity One軟件分析蛋白免疫印跡條帶光密度值，用得到的游離肌動(dòng)蛋白與總肌動(dòng)蛋白的光密度值之比表示肌動(dòng)球蛋白的解離程度。

1.2.4 肌動(dòng)球蛋白 ATPase活性的測定 肌動(dòng)球蛋白ATPase活性的測定按照ATP酶活性測定試劑盒的說明書進(jìn)行測定?；静襟E如下：（1）制作磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）根據(jù)說明書提供的各反應(yīng)物添加量添加相應(yīng)試劑開始樣品和對(duì)照反應(yīng)，在25℃反應(yīng)1 h后添加200 μL Reagent到每個(gè)孔中25℃下再孵育30 min，終止酶反應(yīng)，同時(shí)生成比色產(chǎn)物，并在620 nm處測定吸光值。（3）計(jì)算：根據(jù)公式ΔA620=（A620）樣品-（A620）對(duì)照計(jì)算出吸光值的變化，然后根據(jù)繪制的磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中無機(jī)磷的含量［Pi］。酶活根據(jù)下列公式得出。

酶活性（U·L-1）=（［Pi］（μmol）×40μL）/（10μL×T）

其中40 μL為反應(yīng)體積，10 μL為樣品體積，T為反應(yīng)時(shí)間，1 U酶活是指在試驗(yàn)條件下每分鐘催化生成1 μmol無機(jī)磷所需要的酶的量。

1.2.5 肌原纖維蛋白超微結(jié)構(gòu)分析 肌原纖維超微結(jié)構(gòu)的觀察測定參考 PRATES等［22］的方法并稍作修改。順著肌纖維方向?qū)⒋郎y樣品切成大小為5 mm×2 mm×2 mm的細(xì)絲，立即放入 2.5%的戊二醛固定液（pH 7.2）中進(jìn)行前固定，固定48 h后用0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液（pH 7.4）沖洗。然后在通風(fēng)櫥中用1%四氧化鋨進(jìn)行后固定，靜置2—3 h后，再次用磷酸緩沖液沖洗，然后用乙醇進(jìn)行梯度脫水（30%、50%、60%、70%、80%、90%、100%），之后再利用無水丙酮置換5次，每次放置7—15 min。脫水后的樣品用包埋劑包埋，然后放入烘箱聚合（聚合條件：37℃，12 h；40℃，12 h；45℃，12 h；50℃，12 h；60℃，48 h），隨后室溫冷卻（至少2 d）、修塊。修塊完成后用UC6型超薄切片機(jī)進(jìn)行超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，最后用H-7500型透射電鏡觀察、拍照。利用Image-Pro Plus 6.0軟件量取肌節(jié)長度。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)均做5次重復(fù)，每個(gè)樣品做3次平行，所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，通過最小顯著差異法（least significant difference，LSD）和鄧肯氏總重比較法（Duncans Multiple-rang test）進(jìn)行差異顯著性分析，并進(jìn)行相關(guān)性分析。

2　結(jié)果

2.1 肌球蛋白磷酸化水平隨宰后時(shí)間的變化

2.1.1 肌球蛋白重鏈磷酸化水平隨宰后時(shí)間的變化對(duì)電泳圖進(jìn)行灰度值分析，用磷酸化染色（圖 1-A）的光密度值與全蛋白染色（圖 1-B）的光密度值之比代表肌球蛋白重鏈的磷酸化水平，宰后不同時(shí)間點(diǎn)肌球蛋白重鏈的磷酸化水平如圖1-C所示。從圖中可以看出，宰后肌肉中肌球蛋白重鏈的磷酸化水平隨時(shí)間呈現(xiàn)先下降后上升再下降并趨于穩(wěn)定的趨勢，而且宰后6 h及以后各時(shí)間點(diǎn)的磷酸化水平均顯著低于0.5 h的初始值。肌球蛋白重鏈的磷酸化水平變化在宰后48 h后基本趨于穩(wěn)定，宰后72 h肌球蛋白重鏈的磷酸化水平與初始值0.5 h相比下降了18.8%。說明宰后肌肉中肌球蛋白重鏈的去磷酸化作用大于磷酸化作用，所以整體呈現(xiàn)出磷酸化水平降低的趨勢。

圖1　宰后不同時(shí)間點(diǎn)肌球蛋白重鏈的磷酸化水平Fig. 1 Variation of myosin heavy chain phosphorylation level during postmortem

2.1.2 肌球蛋白輕鏈 2磷酸化水平隨宰后時(shí)間的變化 對(duì)圖2-A、B進(jìn)行光密度值分析，宰后不同時(shí)間點(diǎn)肌球蛋白輕鏈2的磷酸化水平如圖2-C所示，宰后肌肉中肌球蛋白輕鏈2的磷酸化水平在48 h內(nèi)顯著下降，48—72 h顯著上升，但是72 h的肌球蛋白輕鏈2磷酸化水平仍顯著低于0.5 h的初始值。說明宰后肌肉中肌球蛋白輕鏈2的去磷酸化作用起主導(dǎo)作用，整體呈現(xiàn)出肌球蛋白輕鏈2磷酸化水平顯著降低的趨勢。

2.2 肌動(dòng)球蛋白解離程度隨宰后時(shí)間的變化

利用免疫印跡測定宰后不同時(shí)間肌動(dòng)球蛋白的解離程度，其結(jié)果如圖3-A、B所示，對(duì)圖中免疫印跡條帶進(jìn)行灰度值分析，所得結(jié)果如圖3-C所示。從圖中可以看出宰后肌動(dòng)球蛋白解離程度呈現(xiàn)出先下降后上升然后趨于穩(wěn)定的趨勢。宰后0.5—6 h，肌動(dòng)球蛋白的解離程度顯著下降，說明此階段肌肉中的肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白大量結(jié)合形成肌動(dòng)球蛋白，整體呈現(xiàn)出一種結(jié)合大于解離的現(xiàn)象。而6—48 h，肌動(dòng)球蛋白的解離程度則顯著上升，肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白之間的橫橋斷裂，肌動(dòng)球蛋白不斷解離形成游離的肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白，呈現(xiàn)出一種解離大于結(jié)合的狀態(tài)。宰后 48—72 h，肌動(dòng)球蛋白的解離程度無顯著差異（P ＞0.05），此時(shí)肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的結(jié)合與解離則處于一種平衡的狀態(tài)，而且肌動(dòng)球蛋白的解離程度顯著高于初始點(diǎn)0.5 h。

圖2　宰后不同時(shí)間點(diǎn)肌球蛋白輕鏈2的磷酸化水平Fig. 2 Variation of myosin light chain 2 phosphorylation level during postmortem

圖3　宰后不同時(shí)間點(diǎn)肌動(dòng)球蛋白的解離程度Fig. 3 Variation of actomyosin dissociation degree during postmortem

2.3 肌動(dòng)球蛋白ATPase活性隨宰后時(shí)間的變化

肌動(dòng)球蛋白 ATPase活性代表肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白相互作用力的強(qiáng)弱。宰后不同時(shí)間點(diǎn)肌動(dòng)球蛋白ATPase活性的變化如圖4所示，肌動(dòng)球蛋白ATPase活性隨宰后時(shí)間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并且在24 h達(dá)到最大值，該點(diǎn)的肌動(dòng)球蛋白ATPase活性顯著高于其他各時(shí)間點(diǎn)。宰后0.5—24 h，肌動(dòng)球蛋白ATPase活性不斷增大，說明肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白的相互作用力不斷增強(qiáng)；而在24—72 h，肌動(dòng)球蛋白ATPase活性則不斷下降，肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白的相互作用力不斷減弱。

2.4 肌節(jié)長度隨宰后時(shí)間的變化

宰后不同時(shí)間點(diǎn)肌節(jié)樣品的透射電鏡圖如圖 5所示，宰后72 h的肌節(jié)暗帶已經(jīng)開始變得模糊，說明維持肌節(jié)的蛋白已經(jīng)發(fā)生了降解。在宰后 0.5—6 h，肌節(jié)長度并未發(fā)生顯著的變化，6—24 h，肌節(jié)長度顯著減小，在24 h肌節(jié)明顯變短；24—48 h，肌節(jié)長度顯著增大，肌節(jié)舒張，48—72 h則維持這種舒張的狀態(tài)，肌節(jié)長度不再發(fā)生顯著變化，但是舒張后72 h的肌節(jié)長度仍然顯著低于0.5 h的初始肌節(jié)長度（圖6）。

2.5 相關(guān)性分析

將肌球蛋白重鏈磷酸化水平、肌球蛋白輕鏈2磷酸化水平、肌動(dòng)球蛋白解離程度、肌動(dòng)球蛋白ATPase活性和肌節(jié)長度進(jìn)行相關(guān)性分析，肌動(dòng)球蛋白ATPase活性與肌節(jié)長度之間呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.890，P＜0.05），肌球蛋白輕鏈2磷酸化水平和肌動(dòng)球蛋白解離程度呈高度的負(fù)相關(guān)（r=-0.823），肌球蛋白輕鏈2的磷酸化水平和肌球蛋白重鏈磷酸化水平、肌動(dòng)球蛋白 ATPase活性、肌節(jié)長度均有一定的相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)r分別為0.575、-0.522、0.628（表1）。

圖4　宰后不同時(shí)間點(diǎn)肌動(dòng)球蛋白的ATPase活性Fig. 4 Analysis of actomyosin ATP enzyme activity during postmortem

圖5　宰后不同時(shí)間點(diǎn)透射電鏡圖（30 000×）Fig. 5 Transmission electron microscopy photos during postmortem

3　討論

肉品的宰后成熟是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，它受肌肉組織結(jié)構(gòu)、骨架蛋白降解及內(nèi)源酶等多種因素的調(diào)控。GOLL等［8］提出宰后肌肉解僵成熟過程中肌動(dòng)球蛋白的解離也有助于嫩度的改善。研究發(fā)現(xiàn)宰后肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白存在兩種不同的結(jié)合狀態(tài)，即高親和態(tài)和低親和態(tài)，而且這兩種狀態(tài)是可以相互轉(zhuǎn)化的［23］，在宰后不同階段處于不同的結(jié)合狀態(tài)，這將會(huì)影響宰后肉的成熟以及肉品最終的嫩度［24］。

在本研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，如表1所示，宰后肌動(dòng)球蛋白 ATPase活性與肌節(jié)長度顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.890，P＜0.05），肌動(dòng)球蛋白解離程度與肌節(jié)長度也具有一定的相關(guān)性（r=0.517），且均呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。0.5—24 h，肌動(dòng)球蛋白ATPase活性顯著增加，肌動(dòng)球蛋白解離程度先顯著下降隨后又顯著上升，肌節(jié)長度顯著下降，肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白相互作用力增大，兩者由低親和態(tài)轉(zhuǎn)為高親和態(tài)，同時(shí)肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白相互作用的橫橋的數(shù)量也發(fā)生顯著的變化，最終導(dǎo)致肌節(jié)收縮。這是由于在宰后成熟過程中，動(dòng)物肌肉組織中ATP的不斷消耗和糖原無氧酵解導(dǎo)致pH的下降，最終導(dǎo)致鈣泵的功能喪失［25］，大量的 Ga2+從肌漿網(wǎng)釋放到肌漿中，作用于肌鈣蛋白 C，使肌細(xì)絲的構(gòu)象發(fā)生變化，暴露出肌動(dòng)蛋白上與肌球蛋白結(jié)合的位點(diǎn)，同時(shí)肌動(dòng)球蛋白ATP酶有規(guī)律的水解ATP釋放能量［26］，促使肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白通過橫橋相互結(jié)合或解離，導(dǎo)致細(xì)絲沿著粗絲發(fā)生移動(dòng)，肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白相互作用力增大，從而致使肌原纖維發(fā)生收縮。而在24—72 h，由于蛋白降解、蛋白相互作用等的影響，肌動(dòng)球蛋白ATPase活性顯著降低，肌動(dòng)球蛋白解離程度顯著增加隨后保持穩(wěn)定，肌節(jié)長度顯著增加，肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白由高親和態(tài)轉(zhuǎn)為低親和態(tài)，誘使肌節(jié)舒張，長度增加。

表1　宰后肌動(dòng)球蛋白解離、肌球蛋白磷酸化水平和肌動(dòng)球蛋白ATPase活性隨時(shí)間變化的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of actomyosin dissociation， myosin phosphorylation and actomyosin ATPase activity during postmortem

圖6　宰后不同時(shí)間肌節(jié)長度分析Fig. 6 Analysis of the sarcomere length of different postmortem times

肌球蛋白輕鏈2的磷酸化修飾受肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈激酶、Rho kinase、蛋白激酶A和蛋白激酶C等多種酶的調(diào)控［27］。肌球蛋白輕鏈2的磷酸化作用可以增加肌動(dòng)球蛋白強(qiáng)結(jié)合橫橋的數(shù)量［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，在宰后6—24 h，肌肉中肌球蛋白輕鏈2磷酸化水平的顯著下降，肌動(dòng)球蛋白的解離程度顯著增大，肌動(dòng)球蛋白ATPase活性顯著增加，這說明肌球蛋白輕鏈2的去磷酸化有可能導(dǎo)致了肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白強(qiáng)結(jié)合橫橋數(shù)量的下降，表明在一定的生理?xiàng)l件下，有可能肌球蛋白輕鏈 2的去磷酸化會(huì)阻礙肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合。另外，由表1可知，肌動(dòng)球蛋白解離程度和肌球蛋白輕鏈2磷酸化水平呈現(xiàn)高度的負(fù)相關(guān)，說明肌球蛋白輕鏈 2的磷酸化在一定程度上可以抑制肌動(dòng)球蛋白的解離。ALAMO等［13］和BRITO等［14］的研究表明肌球蛋白輕鏈2磷酸化會(huì)破壞肌肉粗、細(xì)絲的相互作用，使肌球蛋白重鏈頭部遠(yuǎn)離粗絲，促進(jìn)肌球蛋白單體與活躍的收縮細(xì)絲的結(jié)合，與本研究結(jié)果一致。

4　結(jié)論

宰后肌肉中的肌球蛋白輕鏈2的磷酸化水平和肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白間的相互作用均呈動(dòng)態(tài)變化。在宰后6—24 h，肌球蛋白輕鏈2的磷酸化水平顯著下降，肌動(dòng)球蛋白解離程度顯著增加，肌動(dòng)球蛋白 ATPase活性顯著增加，肌節(jié)長度顯著下降，說明宰后肌球蛋白輕鏈2磷酸化水平的變化對(duì)肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白的相互作用有較大的影響；而且肌節(jié)收縮（肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白的相互作用力）與肌動(dòng)球蛋白的解離（肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白的相互作用量）并不是一個(gè)同步的進(jìn)程。在一定的生理狀態(tài)下，肌球蛋白輕鏈2磷酸化修飾負(fù)向調(diào)控肌動(dòng)球蛋白解離和肌動(dòng)球蛋白 ATPase活性，最終導(dǎo)致肉品嫩度下降。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

The Mechanism of Myosin Phosphorylation Regulating Actomyosin Dissociation of Skeletal Muscle During Postmortem

GAO Xing1，2， LI Xin2， LI Zheng2， DU Man-ting2， ZHANG Cai-xia2， ZHANG De-quan2， DING Wu1
（1Food Science and Technology， Northwest A&F University， Yangling 712100， Shaanxi；2Institute of Food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-Products Processing， Ministry of Agriculture， Beijing 100193）

【Objective】The aim of this study was to investigate the effect of myosin phosphorylation modification on actomyosin dissociation by analyzing the correlation between myosin phosphorylation and actomyosin dissociation， and then reveal the function of myosin phosphorylation to sarcomere length and tenderness during postmortem.【Method】Samples of ovine longissimus dorsi after storage at 4℃ for 6， 24， 48， 72 h were collected for myosin phosphorylation and actomyosin dissociation by SDS-PAGE， Pro-Q Diamond staining and western blotting， actomyosin ATPase activity. And sarcomere length was measured by transmission electron microscope.【Result】The phosphorylation level of myosin light chain 2 decreased sharply from 0.5-48 h （P＜0.05）， then it increased from 48-72 h， and the final value was lower than the initial phosphorylation value. While to the dissociation of actomyosin， it displayed a gradual decrease from 0.5-6 h and then increased from 6-48 h （P＜0.05）， finally keptstable during 48-72 h postmortem， and the final dissociation degree was significantly higher than 0.5 h. The actomyosin ATPase activity increased to the highest value at 24 h， followed by gradual decrement from 24 to 72 h. On the contrary， the sarcomere length decreased to the shortest value at 24 h， followed by gradual sarcomere relaxation from 24 to 72 h.【Conclusion】The phosphorylation level of myosin light chain 2 had a great influence on myosin and actin interaction， in addition， the sarcomere contraction （myosin and actin interaction force） and the dissociation of actomyosin （myosin and actin interaction amount）happened out of sync during postmortem. Phosphorylation modification of myosin light chain 2 caused the sarcomere shrinkage and relaxation by negative regulating actomyosin dissociation and actomyosin ATPase activity negatively， which could control the final meat tenderness.

phosphorylation； myosin heavy chain； myosin light chain 2； actomyosin； dissociation； ovine longissimus dorsi

2015-11-16；接受日期：2016-04-01

國家現(xiàn)代肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-39）、國家農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程、國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303083）

聯(lián)系方式：高星，E-mail：gaoxing123work@163.com。通信作者張德權(quán)，E-mail：dequan_zhang0118@126.com。通信作者丁武，E-mail：dingwu10142000@hotmail.com