張彥波，肖　磊，張文娟，張清華，董　策，張希太（.邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北邯鄲05600；.邯鄲市農(nóng)業(yè)局，河北邯鄲05600）

小麥SRAP-PCR反應(yīng)程序的優(yōu)化及引物篩選

張彥波1，肖磊1，張文娟2，張清華1，董策1，張希太1
（1.邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北邯鄲056001；2.邯鄲市農(nóng)業(yè)局，河北邯鄲056002）

為建立最佳的小麥SRAP-PCR反應(yīng)體系，進(jìn)一步對(duì)小麥品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)小麥SRAP-PCR程序中的變性時(shí)間、復(fù)性時(shí)間、延伸時(shí)間以及后35個(gè)循環(huán)的復(fù)性溫度進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)。結(jié)果表明：當(dāng)小麥SRAP-PCR擴(kuò)增程序以變性30 s、復(fù)性60 s、延伸60 s，后35個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度55益時(shí)，擴(kuò)增效果最好。應(yīng)用該體系從65對(duì)SRAP引物組合中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富的23對(duì)引物組合，驗(yàn)證了該體系具有穩(wěn)定性和可靠性，可進(jìn)一步用于小麥的分子標(biāo)記、輔助育種與遺傳分析研究。

小麥；SRAP-PCR反應(yīng)程序；條件優(yōu)化；引物篩選

序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是繼RAPD和SSR以后出現(xiàn)的新型分子標(biāo)記技術(shù)，由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜系的Li和Quiros博士于2001年提出[1]。通過設(shè)計(jì)獨(dú)特的雙引物，對(duì)基因的ORFs（Open reading frames）特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，其中，上游引物長(zhǎng)17 bp，對(duì)外顯子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增；下游引物長(zhǎng)18 bp，對(duì)內(nèi)含子區(qū)域、啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增。因不同個(gè)體以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不同而產(chǎn)生多態(tài)性。該標(biāo)記具有簡(jiǎn)便、高效、產(chǎn)率高、高共顯性、重復(fù)性好、易測(cè)序、便于克隆目標(biāo)片段的特點(diǎn)，目前已成功地應(yīng)用于作物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀標(biāo)記以及相關(guān)基因克隆等方面[2，3]。

SRAP-PCR反應(yīng)程序采用復(fù)性變溫法擴(kuò)增，最初Li等[1]設(shè)計(jì)的程序?yàn)?4益預(yù)變性5 min；94益變性60 s，35益復(fù)性60 s，72益延伸60 s，5個(gè)循環(huán)；94益變性60 s，50益復(fù)性60 s，72益延伸60 s，30耀35個(gè)循環(huán)；72益延伸5 min，4益保存。隨著在不同物種上的應(yīng)用，該程序相應(yīng)地有了不同的調(diào)整。SRAP分子標(biāo)記技術(shù)在小麥研究中已有初步應(yīng)用[4耀6]，但針對(duì)小麥中SRAP-PCR反應(yīng)程序的優(yōu)化尚未見報(bào)道，小麥最佳的擴(kuò)增程序有待確定。作者對(duì)小麥SRAP-PCR反應(yīng)程序進(jìn)行優(yōu)化，并篩選出適合于小麥的引物組合，旨為進(jìn)一步小麥分子標(biāo)記、輔助育種與遺傳分析研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

小麥（Triticum aestivum L.）品種為衡5229，由河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所提供。SRAP引物18條（正向引物5條，反向引物13條）[8耀10]（表1），由上海生工生物公司合成。使用英國(guó)TECHNE公司生產(chǎn)的TC-5000 PCR儀進(jìn)行SRAP-PCR反應(yīng)。

表1　SRAP引物序列Table1　Primer sequence used for SRAP analysis

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取與引物組合取小麥葉片，采用CTAB法提取基因組DNA，電泳檢測(cè)其質(zhì)量與純度，濃度稀釋至10 mg/L。

1.2.2PCR反應(yīng)體系設(shè)計(jì)20滋L的反應(yīng)體系：10伊Buffer 2滋L，Mg2+2 mmol/L，Taq聚合酶2 U，dNTPs 0.2 mmol/L，模板DNA約40 ng，引物0.6滋mol/L，無菌超純水補(bǔ)足20 mL[7]。

1.2.3PCR擴(kuò)增程序正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及產(chǎn)物的檢測(cè)基于統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其中4個(gè)因素分別為變性時(shí)間、復(fù)性時(shí)間、延伸時(shí)間和復(fù)性溫度（前5個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度35益不變），每因素均設(shè)3個(gè)水平（表2）。PCR反應(yīng)程序：94益預(yù)變性5 min；94益變性、35益復(fù)性和72益延伸，各階段時(shí)間按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行，共5個(gè)循環(huán)；94益變性、復(fù)性和72益延伸，各階段時(shí)間和復(fù)性溫度按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行，共35個(gè)循環(huán)；72益延伸5 min，4益保存。采用引物組合Me1/Em2、Me1/Em7和Me2/Em2，以上述PCR反應(yīng)程序設(shè)定進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每對(duì)引物均設(shè)3次重復(fù)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用6豫的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，每泳道上樣量為8滋L，在200V恒電壓下電泳2.5h，剝膠，銀染，照相，進(jìn)行擴(kuò)增條帶的分析。

表2　SRAP-PCR的L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table2　Orthogonal design for SRAP-PCR［L9（34）］

1.2.4引物篩選及優(yōu)化體系的驗(yàn)證將正向引物與反向引物隨機(jī)組合的65對(duì)引物，按照優(yōu)化后的擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR檢測(cè)，篩選出擴(kuò)增條帶清晰且多態(tài)性豐富的引物；并將這些引物再次按照優(yōu)化后的擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR，以驗(yàn)證優(yōu)化體系的穩(wěn)定性。

圖1　SRAP-PCR擴(kuò)增程序正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)電泳結(jié)果Fig.1 The electrophoresis results of SRAP-PCR program by orthogonal design

2　結(jié)果與分析

2.1SRAP-PCR擴(kuò)增程序正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的電泳結(jié)果分析

對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行直觀分析，依據(jù)擴(kuò)增條帶的數(shù)量、亮度和清晰度評(píng)分，9個(gè)試驗(yàn)結(jié)果最高為9分、最低為1分。3對(duì)引物組合Me1/Em2、Me1/Em7和Me2/Em2在擴(kuò)增條帶數(shù)量、擴(kuò)增片段大小以及清晰度上有顯著區(qū)別（圖1），其中，Me1/Em2引物組合1耀9泳道擴(kuò)增條帶評(píng)分依次為1、8、9、1、1、1、1、1、1；引物組合Me1/Em7和Me2/Em2在擴(kuò)增結(jié)果上有很大的相似性，1、2、3泳道上均有條帶出現(xiàn)，且1耀9泳道評(píng)分相同，依次為7、8、9、1、1、1、1、1、1，其中均以3泳道評(píng)分最高。表明引物組合Me1/Em2在復(fù)性時(shí)間和延伸時(shí)間較長(zhǎng)的情況下才能擴(kuò)增出條帶，并且復(fù)性時(shí)間和延伸時(shí)間同時(shí)達(dá)到最長(zhǎng)60 s時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果最好；引物組合Me1/Em7和Me2/Em2進(jìn)行條帶擴(kuò)增的3個(gè)復(fù)性溫度對(duì)結(jié)果沒有絕對(duì)影響，而在變性時(shí)間均為30 s的情況下，復(fù)性時(shí)間和延伸時(shí)間同樣都是達(dá)到60 s時(shí)評(píng)分最高。綜合分析得出，SRAP-PCR擴(kuò)增變性30 s、復(fù)性60 s、延伸60 s，后35個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度55益時(shí)，擴(kuò)增效果最好。

2.2引物的篩選及SRAP-PCR擴(kuò)增程序的驗(yàn)證

依據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳反應(yīng)程序，對(duì)已有的65對(duì)引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，出現(xiàn)條帶的引物組合為57對(duì)，占總引物組合的87.69%，擴(kuò)增條帶共計(jì)173條，表明該反應(yīng)體系具有較高的擴(kuò)增成功率。其中有23對(duì)引物組合擴(kuò)增出的條帶清晰且多態(tài)性豐富，這23對(duì)引物組合共計(jì)擴(kuò)增出109條帶，占總條帶數(shù)的63.01%。分別挑選出上述的23對(duì)引物組合再次進(jìn)行驗(yàn)證，SRAP-PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖2）顯示，篩選出的23對(duì)引物條帶豐富、多態(tài)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，可以用于小麥材料的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀標(biāo)記等，同時(shí)用于本項(xiàng)目后續(xù)的試驗(yàn)研究。

圖2　SRAP-PCR擴(kuò)增程序的驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 The verification results of SRAP-PCR program

3　結(jié)論與討論

SRAP是適用于多種植物、簡(jiǎn)便高效的分子標(biāo)記檢測(cè)手段。SRAP與SSR分子標(biāo)記由于構(gòu)建原理不同，從而在諸多方面具有自己獨(dú)特的特點(diǎn)，如SRAP-PCR程序采用復(fù)性變溫法擴(kuò)增。這種擴(kuò)增程序分為2個(gè)階段，前5個(gè)循環(huán)采用較低的退火溫度，以保證2個(gè)引物與靶DNA部分配對(duì)，隨后循環(huán)中升高復(fù)性溫度，以保證前5個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物在余下循環(huán)中進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增，如果復(fù)性溫度在所有循環(huán)中都保持較低的退火溫度，擴(kuò)增片斷重復(fù)性將很低[11]。不同的引物組合對(duì)不同物種擴(kuò)增多態(tài)性影響很大，在利用不同SRAP組合進(jìn)行多態(tài)性篩選時(shí)，盡量先統(tǒng)計(jì)其多態(tài)性，再分析多態(tài)性在群體中的分離[12]。如果多種引物組合產(chǎn)生的多態(tài)性都不豐富時(shí)，有必要對(duì)PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。陳萬勝等[13]在煙草中應(yīng)用的PCR程序?yàn)樽冃?5 s，退火45 s，延伸60 s，后35個(gè)循環(huán)退火溫度52益。而楊麗麗等[14]在冬棗SRAP擴(kuò)增體系中將延伸時(shí)間提高到80 s。傅冰等[15]在藍(lán)莓SRAP-PCR反應(yīng)體系中應(yīng)用變性時(shí)間60 s，退火時(shí)間60 s，延伸時(shí)間90 s。雖然SRAP的引物可以通用，但不同的試驗(yàn)對(duì)象及不同的試驗(yàn)環(huán)境下，應(yīng)采用最適合的PCR反應(yīng)體系。

本研究通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)小麥SRAP-PCR中的擴(kuò)增程序進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果顯示，最佳的擴(kuò)增程序是94益預(yù)變性5 min；94益變性30 s，35益復(fù)性60s，72益延伸60 s，5個(gè)循環(huán)；94益變性30 s，55益復(fù)性60 s，72益延伸60s，35個(gè)循環(huán)；72益延伸5min，4益保存。篩選出23對(duì)條帶豐富、可重復(fù)性強(qiáng)的引物組合，適于小麥親本材料及其后代材料的變異、遺傳多樣性以及親緣關(guān)系檢測(cè)與分析。這23對(duì)引物分別為Me1/Em2、Me1/Em4、Me1/Em7、Me1/Em9、Me2/ Em2、Me2/Em5、Me2/Em6、Me2/Em7、Me2/Em8、Me2/Em11、Me2/Em13、Me3/Em1、Me3/Em3、Me3/ Em5、Me3/Em7、Me3/Em9、Me3/Em10、Me3/Em11、Me4/Em4、Me4/Em5、Me4/Em10、Me4/Em13、Me5/Em1。優(yōu)化后的擴(kuò)增程序較最初Li等[1]的擴(kuò)增程序在變性時(shí)間上有所減少，可以縮短PCR的時(shí)間；在后35個(gè)循環(huán)的復(fù)性溫度上有所提高，可以增加PCR擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。應(yīng)用這一優(yōu)化的擴(kuò)增程序，成功篩選了適合于小麥的SRAP引物，并充分驗(yàn)證了該程序的可靠性。

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Program Optimization and Primer Screening of SRAP-PCR for Wheat

ZHANG Yan-bo1，XIAO Lei1，ZHANG Wen-juan2，ZHANG Qing-hua1，DONG Ce1，ZHANG Xi-tai1
（1.Handan Academy of Agricultural Sciences，Handan 056001，China；2.Agriculture Bureau of Handan City，Handan 056002，China）

The purpose of this study was to determine the best system of SRAP-PCR reaction and provide afoundationforfurtherstudyingthegeneticdiversityofwheat.Usingtheorthogonaldesign，the denaturation time，annealing time，extension time and annealing temperature after 35 cycles for wheat SRAP-PCR program were optimized.The results indicated that the best program was the denaturation time of 30 seconds，annealing time of 60 seconds，extension time of 60 seconds，and annealing temperature of 55益after 35 cycles.Under the optimum reaction conditions，23 out of 65 SRAP primer combinations were selected to verify the stability and reliability of this system.This optimized conditions of SRAP could used for further research of molecular marker，auxiliary breeding and genetic diversity in wheat.

Wheat；SRAP-PCR program；Optimization；Primer screening

S512.1垣1

A

1008-1631（2016）02-0055-03

2015-08-11

張彥波（1982-），男，河北武安人，助理研究員，碩士，主要從事農(nóng)業(yè)生物技術(shù)及小麥育種研究。E-mail：zhangyanbo785@163.com。