文/王玉堂

疫苗在水生動物疾病預(yù)防中的作用及應(yīng)用前景（四）

文/王玉堂

（上接2016年 第6期）

（五）母體免疫

在哺乳類和鳥類，免疫球蛋白可以通過胚盤、初乳或卵從母體傳遞給子代，以增強(qiáng)子代的保護(hù)能力，但在魚類中此方面的研究結(jié)果還有所爭議。因為研究發(fā)現(xiàn)，有一些魚類的抗病能力可以從母體那兒得到，而有一些魚類卻不能。例如Brown等（1997）證實，注射大麻哈魚體內(nèi)的抗體，在其所產(chǎn)的卵中可以測出，而同樣的大麻哈魚抗耶爾森氏菌病的抗體就不能通過母體傳遞給子代。有研究表明，IPN、IHN病和細(xì)菌性腎病的抗體則能由母體傳遞給子代。

魚類免疫學(xué)和疫苗學(xué)的發(fā)展?jié)摿薮?。因為多種魚病可以通過接種疫苗來得到控制，尤其是對于那些通過藥物治療無法控制的魚病，如許多病毒病、寄生蟲病等在接種免疫后成功地預(yù)防和控制了疾病的發(fā)生。免疫學(xué)家和疫苗學(xué)家們目前正密切配合，使其基礎(chǔ)科學(xué)與應(yīng)用科學(xué)相結(jié)合，為疫苗的開發(fā)創(chuàng)造了良好條件。近年來的研究表明，活疫苗也有較大潛力，未來疫苗的開發(fā)與研究將主要集中于活疫苗的開發(fā)方面。分子重組技術(shù)的成熟與成功應(yīng)用，為魚類疫苗技術(shù)的開發(fā)提供了新的手段和途徑，具有廣闊前景。疫苗佐劑的研究和利用也是疫苗開發(fā)利用的不可缺少部分，有待于深入研究。

七、漁用疫苗的使用方法

漁用疫苗是通過接種對象體內(nèi)產(chǎn)生免疫力不定期達(dá)到預(yù)防疾病效果的，因而，有可能因接種對象自身不夠健康而不能產(chǎn)生足夠的免疫效果。因此，要使?jié)O用疫苗最大限度地發(fā)揮效果，平時合理的飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生管理是重要的基礎(chǔ)因素。漁用疫苗只有正確使用才能達(dá)到預(yù)期效果。對魚類實施免疫接種的途徑有別于其它動物。目前，漁用疫苗的免疫接種途徑主要有如下四種：

（一）注射法

目前，國內(nèi)外漁用疫苗以注射接種法為主。注射免疫接種根據(jù)接種部位不同，又可分為皮下注射、肌肉注射和腹腔注射3種。其中腹腔注射接種是弧菌疫苗免疫接種的最常用方法。

魚類皮下注射難度較大，國內(nèi)一般采用肌肉注射和腹腔注射。肌肉注射一般采用背鰭基部注射，注射劑量控制在每尾親魚0.1mL～0.2mL，與魚體呈30度～40度角，向頭部方向插入注射器針頭，進(jìn)針深度約為0.3cm，根據(jù)魚體大小以不傷及脊椎骨為度。肌肉注射疫苗一般易吸收、無佐劑為宜，否則易形成腫塊，影響魚體正常代謝。腹腔注射，將針頭沿腹鰭基部內(nèi)側(cè)進(jìn)針，斜向胸鰭方向進(jìn)入，與魚體呈30度～40度角，向頭部方向進(jìn)針。進(jìn)針深度依魚體大小而定；有的地區(qū)習(xí)慣用胸腔注射，從胸鰭內(nèi)側(cè)基部插入，不過，個體較小的魚不適用于這種方法。如技術(shù)熟練，采用腹腔注射或胸鰭注射法藥液不易流出，比肌肉注射效果好。

國內(nèi)比較成熟的注射用水產(chǎn)疫苗是珠江水產(chǎn)研究所研制的草魚出血病滅活疫苗，2010年12月獲得國家一類新獸藥證書（證書號：（2010）新獸藥證字51號），2011年3月獲得生產(chǎn)批準(zhǔn)文號［（2011）190986013］，該疫苗的特點是用量少、效價高、保護(hù)力強(qiáng)、免疫產(chǎn)生期快、免疫期長、使用安全方便，克服了組織苗（土法疫苗）效果不穩(wěn)定和細(xì)胞來活疫苗免疫期短的缺點；主要應(yīng)用于養(yǎng)殖草魚的免疫防病，使用濃度為10-2，注射劑量0.2mL，免疫時效1年，免疫保護(hù)率最高可達(dá)100%。

注射法能夠保證適量的抗原準(zhǔn)確進(jìn)入受體魚體內(nèi)，具有用量少和免疫效果好的優(yōu)點，但由于注射免疫需將魚從池中撈出，費(fèi)時、費(fèi)工、增加勞動強(qiáng)度，在大規(guī)模養(yǎng)殖情況下不易推廣使用。另外，操作人員在注射前應(yīng)了解魚體內(nèi)臟器官的位置，避免在注射時損傷魚的內(nèi)臟器官，這也在一定程度上限制了疫苗的推廣應(yīng)用。

（二）浸泡法（噴霧法）

Amend等于1976年首次采用浸泡法進(jìn)行魚類免疫接種，并采用組織切片法證實了BSA已經(jīng)進(jìn)入魚體，從而開創(chuàng)了浸泡免疫的先河。隨后，Cror和Amend （1977）用稀釋的弧菌苗直接浸泡免疫大馬哈魚又獲成功。Austin采用浸泡法免疫預(yù)防日本鰻鱺弧菌病均獲成功。Sakai等報導(dǎo)，用鰻弧菌溶液浸泡免疫虹鱒后，其抗鏈球菌的LD50提高了12倍。1978年，Gould等開始采用噴霧免疫。但直到目前為止，對疫苗進(jìn)入魚體的機(jī)制尚不了解，免疫原是以可溶性狀態(tài)還是以顆粒狀態(tài)進(jìn)入魚體內(nèi)尚存在很大爭議。隨著對魚體免疫作用機(jī)理的深入研究，會找到更為便捷有效的疫苗給予途徑。

許多因素影響浸泡免疫抗原的攝取，如疫苗的濃度、浸泡時間的長短、魚的大小、佐劑的使用、抗原存在的物理狀態(tài)（顆料狀或可溶性）、水溫等。在這些因素中，抗原的濃度和浸泡時間的長短對于抗原的攝入和保護(hù)作用是最為重要的。一般來說，短時間浸泡的方法效果較差。Thume和Plum（2000）用滲浸泡的方法證明BSA的攝取隨著浸泡時間的延長而提高，但是，F(xiàn)ender和Amend （2002）則發(fā)現(xiàn)，BSA的攝取受到高鹽濃度時間的限制，疫苗濃度和浸泡時間的相互關(guān)系是很復(fù)雜的，并受到抗原類型的影響。Tatner等（1998）曾對影響浸泡免疫的因素用過研究，采用鰻弧菌疫苗浸泡免疫虹鱒，發(fā)現(xiàn)浸泡時間超過10秒鐘時，疫苗的吸收量并不隨羊時間的延長而增加，并且，疫苗折吸收量與溫度和魚體的大小有關(guān)。Teruyuki（2002）研究發(fā)現(xiàn)了一種新的免疫給予方式，即利用專門的穿刺接種器，使受體魚在疫苗苗容器中短時間浸泡的同時，在魚體兩側(cè)進(jìn)行多孔穿刺處理，2周后感染實驗表明，其免疫效果可完全等同于注射免疫。ZHOU等（2000）利用超聲波疫苗浸泡免疫青石斑魚，免疫效果與腹腔注射效果相當(dāng)，且操作方便。國內(nèi)外一些科研工作者試圖使用佐劑來提高魚類浸泡免疫效果的研究，發(fā)現(xiàn)佐劑能非特異性地增強(qiáng)哺乳動物和禽類的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和延長免疫應(yīng)答的時間，但其對魚類的免疫應(yīng)答有無影響仍有爭議。多數(shù)人認(rèn)為，在注射疫苗中，佐劑能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞的活性，增加抗體的產(chǎn)生，從而能夠增強(qiáng)免疫效果。羅霞等（2007）利用佐劑提高浸泡免疫效果的研究中發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌滅活疫苗浸泡免疫后，鱖添加佐劑（IMS1312、葡聚糖、莨菪堿、食鹽）可以提高魚粘液及血清中抗體滴度和相對免疫保護(hù)率，其中添加IMS1312組的免疫保護(hù)效果最好，達(dá)77.8%。

浸泡和噴霧方法操作方便，尤其適用于魚苗的大規(guī)模大量接種，成為目前魚類免疫接種中最常用的免疫方法之一，并逐漸向生產(chǎn)領(lǐng)域推廣應(yīng)用。近年來，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所先后分離并確認(rèn)了致病性弧菌100余株，提取了6種病原菌的4種亞單位成份，克隆3種亞單位基因并表達(dá)，對提取和表達(dá)的亞單位成份進(jìn)行了免疫特性告示進(jìn)行了分析。獲取的各亞單位成份制備的疫苗嶷免疫保護(hù)性測定，當(dāng)泡免疫保護(hù)率為50%～86.7%。生產(chǎn)性應(yīng)用試驗結(jié)果顯示：免疫組比對照組提高成活率5%～37.1%，免疫海水魚類養(yǎng)殖狀態(tài)更趨良好，普遍呈生長穩(wěn)定、發(fā)病少等特點。

（三）口服法

Duffj首次應(yīng)用滅活的殺鮭氣單胞菌免疫口服免疫硬頭鱒獲得成功，開辟了魚類免疫新途徑，為控制魚類微生物感染問題提供了新思維。口服免疫不受時間、地點和魚體大小的限制，具有方便、省時、省力、少脅迫作用等優(yōu)點，對魚體也無傷害。與其它免疫接種方法相比，口報法免疫更適合大規(guī)模的養(yǎng)殖魚群，尤其適用于多次重復(fù)免疫操作，不會造成魚體的應(yīng)激反應(yīng)。但對于口服法免疫接種的效果，不同的研究者有不同的結(jié)論，有人認(rèn)為有效，也有人的研究結(jié)果恰恰相反。Muroga等（1969）用V.anguillarumPB-15菌株的活菌和徑0.01%硫柳汞滅活菌苗拌餌對日本鰻鱺每日投喂1次，連續(xù)投喂4個月后，用活對免疫組和對照組日本鰻鱺注射攻毒，結(jié)果表明，投喂組顯示出了較弱的保護(hù)力。這主要是魚類口服疫苗在實際應(yīng)用中易受胃腸道蛋白酶的消化，因此，探索一種有效的載體投遞系統(tǒng)，能避免蛋白疫苗受胃腸道消化酶及酸環(huán)境的影響。采用海藻酸鹽、PLGA、PELA等可生物降解高分子材料包裹鰻弧菌、溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等全菌疫苗，口服免疫虹鱒、鱸魚、中華鱉、草魚與銀鯽等均獲得良好的免疫效果?？诜⑶蚓忈屢呙绲难芯恳呀?jīng)開始，魚用疫苗口服給予途徑的研究又有了新進(jìn)展，其研究方向是，建立一種能在飼料和水生動物胃腸道中保持疫苗抗原穩(wěn)定性的系統(tǒng)；尋求簡單、經(jīng)濟(jì)、有效的接種方式。張小江等（2008）采用可生微降解的合成高分子聚DL-乳酸-聚乙二醇共聚物（DL-polylactide-copolyethyeneglycoLPELA），包裹哈維氏弧菌（Vidrioharveyi，Vh）重組外膜蛋白OmpK后，制備成PELA-OmpK微球，口服免疫斜帶石斑魚后的相對保護(hù)率為62.5%，顯著高于口服OmpK蛋白組（12.5%）。

魚類各種免疫方法的比較（見表1）

表1　魚類各種免疫方法的比較

目前，英國水產(chǎn)養(yǎng)殖公司（AVL）已開發(fā)出Apua Vac抗弧菌口服疫苗和Apua Vac ERM（Enteric Redmouth Disease）口服疫苗?？够【诜呙缰饕糜陬A(yù)防鰻弧菌所致的弧菌病，在希臘已獲許可證，為海鯛的提升免疫力疫苗，該疫苗可能對北歐養(yǎng)殖的鱈魚非常有用，現(xiàn)北歐正在試驗?？笶RM口服疫苗主要用于預(yù)防魯氏耶爾森氏菌所致的腸紅嘴病。日本預(yù)防魚師魚α-溶血性鏈球菌癥的滅活疫苗也是通過口服接種，具體做法是：把疫苗充分搖均后。對平均體重100g～400g的魚體，按10mL/kg（體重）·日的用量將疫苗混合在飼料中，連續(xù)投喂5天。我國漁用口服疫苗的研究工作起步較晚，目前還在試驗階段。

漁用疫苗的研究工作正在全世界范圍內(nèi)蓬勃發(fā)展，隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，漁用疫苗的使用也呈快速發(fā)展勢頭，因為其安全高效，易于施予，不會引起水產(chǎn)品質(zhì)量安全問題等。

附錄一　國外已商品化的漁用疫苗

（連載完）

作者單位：全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站