賴劍峰，楊榮玲，陳智毅，劉學(xué)銘

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州510610）

不同因子對釀酒酵母降解桑椹花青素的影響研究

賴劍峰，楊榮玲，陳智毅，劉學(xué)銘

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州510610）

通過改變發(fā)酵培養(yǎng)基碳源或氮源濃度，添加不同無機離子或不同濃度外源乙醇，以及調(diào)節(jié)pH值，比較發(fā)酵后主要花青素的含量變化。結(jié)果表明，凡是有利于釀酒酵母生長和酒精發(fā)酵的因素都促進釀酒酵母對桑椹花青素的降解，其中對降解矢車菊素-3-葡萄糖苷的影響更加明顯。

釀酒酵母； 花青素； 桑椹； 酒精發(fā)酵； 降解

桑椹為桑科落葉喬木桑樹Morus L.的成熟果穗，含有豐富的糖類、有機酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，還含有花青素、兒茶素、綠原酸等生物活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫、促進造血細(xì)胞生長、抗誘變、降血糖、降血脂、護肝等藥理作用，在醫(yī)藥和食品工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用［1-2］。鮮桑椹含有豐富的汁液，桑椹果汁含有豐富的糖類、有機酸及花青素和白藜蘆醇等多種成分，是發(fā)酵生產(chǎn)桑椹紅酒的良好原料。利用桑椹汁發(fā)酵生產(chǎn)的桑椹酒含有與紅葡萄酒類似的成分，已經(jīng)成為我國一個新的果酒品種，市場不斷擴大［3］。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，桑椹花青素在桑椹汁酒精發(fā)酵過程中顯著減少，發(fā)酵7 d總花青素含量下降58%，兩種主要的單體花青素下降的趨勢不同［4］。

花青素是桑椹中一類主要的功能性成分，也是桑椹果酒呈現(xiàn)顏色的基礎(chǔ)，主要的單體花青素是矢車菊素-3-葡萄糖苷（C-3-G）和矢車菊素-3-蕓香糖苷（C-3-R）［5-6］。桑椹汁發(fā)酵生產(chǎn)果酒主要是通過酵母的生長和發(fā)酵作用而實現(xiàn)的，說明酵母的生理生化特性是桑椹花青素發(fā)生降解的主要原因。如何在桑椹酒生產(chǎn)中保持高含量的活性成分，是釀酒工作者十分關(guān)心的問題。大量研究發(fā)現(xiàn)，酵母的種類會影響花青素等酚類物質(zhì)的降解［7，11］，但對影響同一酵母的不同因素的作用研究甚少。除花青素外，桑椹果汁中還含有許多非花青素酚類物質(zhì)［2］及一些其他固形物，這些化合物的存在，對研究酵母與花青素的相互作用增加了復(fù)雜性。本研究通過添加外源碳源、氮源和無機鹽配制一個成分簡單而明確的模擬酒精發(fā)酵培養(yǎng)基，添加經(jīng)過大孔樹脂純化后的富含花青素桑椹提取物來研究不同因素對釀酒酵母降解桑椹花青素的影響。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

1.1.1供試材料

富含花青素桑椹提取物：新鮮桑椹果汁經(jīng)大孔樹脂分離純化、真空濃縮和冷凍干燥制成，實驗室自制。

葡萄酒用高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

矢車菊素-3-葡萄糖苷（C-3-G）和矢車菊素-3-蕓香糖苷（C-3-R）對照品：購自法國Extrasynthese公司。

食用蔗糖、酵母膏、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaOH、濃鹽酸、無水乙醇、Fe2（SO4）3·7H2O、CaCl2·2H2O、ZnSO4、MnSO4·H2O、CuSO4·5H2O均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2儀器設(shè)備

酒精計；LC 1260型高效液相色譜儀（G1311 1260 quat Pump VL，G1314F 1260 VWD）：美國Aglient公司。

1.2實驗方法

1.2.1碳源濃度對釀酒酵母降解桑椹花青素的影響

在由KH2PO4（4.5 g/L）、MgSO4·7H2O（1.2 g/L）、酵母膏（5.6 g/L）和富含花青素桑椹提取物（7.0 g/L）組成的培養(yǎng)基中，分別添加50 g/L、100 g/L、150 g/L、200 g/L、250 g/L和300 g/L的蔗糖，10%接種量，26℃發(fā)酵7 d后分別測定酒精和主要單體花青素的含量。

1.2.2氮源濃度對釀酒酵母降解桑椹花青素的影響

固定蔗糖的濃度為250 g/L，無機鹽和富含花青素桑椹提取物含量不變，分別添加6.5 g/L、13.0 g/L、19.5 g/L 和26.0 g/L的酵母膏，同1.2.1條件接種和發(fā)酵，7 d后分別測定酒精和主要單體花青素的含量。

1.2.3無機鹽對釀酒酵母降解桑椹花青素的影響

在由蔗糖（250 g/L）、酵母膏（6.5 g/L）、富含花青素桑椹提取物（7 g/L）、KH2PO4（4.5 g/L）和MgSO4·7H2O（1.2 g/L）組成的培養(yǎng)基中，分別加入Fe2（SO4）3·7H2O（3.4 g/L）、CaCl2·2H2O（3 g/L）、ZnSO4（3 g/L）、MnSO4·H2O（3 g/L）、CuSO4·5H2O（3 g/L），同1.2.1條件接種和發(fā)酵，7 d后分別測定酒精和主要單體花青素的含量。

1.2.4pH值對釀酒酵母降解桑椹花青素的影響

由蔗糖（250 g/L）、酵母膏（6.5 g/L）、富含花青素桑椹提取物（7 g/L）、KH2PO4（4.5 g/L）和MgSO4·7H2O（1.2 g/L）組成的人工發(fā)酵培養(yǎng)基，用3 mol/L NaOH和3 mol/L HCl配制pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和5.5的人工酒精發(fā)酵培養(yǎng)，同1.2.1條件接種和發(fā)酵，7 d后測定酒精和主要單體花青素的含量。

1.2.5外源乙醇濃度對釀酒酵母降解桑椹花青素的影響

在由蔗糖（250 g/L）、酵母膏（6.5 g/L）、富含花青素桑椹提取物（7 g/L）、KH2PO4（4.5 g/L）和MgSO4·7H2O（1.2 g/L）組成的人工發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入無水乙醇，使得發(fā)酵液初始乙醇含量分別為0、1%vol、2%vol、3%vol、4%vol和5%vol，同1.2.1條件接種和發(fā)酵，7 d后測定酒精和主要單體花青素的含量。

1.3分析方法

pH值：使用pH計測定。

乙醇含量測定：以蒸餾法去除樣品中不揮發(fā)物質(zhì)，用酒精計法測得乙醇體積的百分?jǐn)?shù)值，按溫度校正，求得20℃時乙醇的體積分?jǐn)?shù)。

單體花青素含量測定：采用HPLC法檢測。流動相A：10%甲酸；流動相B：甲醇。分析條件：Agilent 1200高效液相色譜儀；SB-C18分析型色譜柱（4.6×250 mm，5 Micron）；檢測波長520 nm和280 nm；進樣量20μL；流速為0.8 mL/min。0～20 min用A流動相由95%梯度洗脫至40%，樣品保留時間為20 min。

2　結(jié)果與分析

2.1碳源濃度對釀酒酵母降解桑椹花青素的影響

碳源濃度對釀酒酵母酒精發(fā)酵和降解桑椹花青素的影響見圖1。

圖1　不同碳源濃度對發(fā)酵液中酒精和單體花青素含量的影響

從圖1A可以看出，碳源濃度對發(fā)酵后酒精含量有顯著影響，在一定范圍內(nèi)酒精含量與添加的碳源濃度正相關(guān)，說明釀酒酵母可以在該人工發(fā)酵培養(yǎng)基正常進行生長和酒精發(fā)酵。從圖1B可以看出，碳源濃度對發(fā)酵后桑椹主要單體花青素含量有很大影響，其中尤其對C-3-G含量的影響更為顯著。隨著碳源濃度的增加，C-3-G的含量下降顯著，當(dāng)含糖量在5%時，發(fā)酵7 d后C-3-G的含量下降到13.0 mg/L，當(dāng)含糖量增加到25%后，C-3-G的含量下降到6.2 mg/L。相對來講，在整個發(fā)酵過程中，C-3-R的含量隨著碳源濃度的增加降低較少，含糖量從5%增加到25%，其含量從18.2 mg/L下降到16.4 mg/L，下降幅度僅為8.6%。有研究表明，釀酒酵母在生長和酒精發(fā)酵過程中會釋放丙酮酸、乙醛等次級代謝產(chǎn)物到培養(yǎng)基中，并與花青素反應(yīng)生成一些大分子衍生物［12-13］。酵母的一些生物活性酶對花青素降解起重要作用［14］。由于C-3-G的結(jié)構(gòu)比C-3-R簡單，極性更大，更容易受到攻擊［15］。但這種伴隨酵母利用碳源和氮源生長和發(fā)酵同時降解花青素的現(xiàn)象與微生物降解有機污染物的共代謝機制［16］十分相似，但目前尚未看到有關(guān)微生物利用共代謝機制降解花青素的文獻報道，值得進一步研究。

2.2氮源濃度對釀酒酵母降解桑椹花青素的影響

氮源作為發(fā)酵中重要的培養(yǎng)基成分之一，其對發(fā)酵液中花青素含量的影響見圖2。

圖2　不同氮源濃度對發(fā)酵液中酒精和花青素含量的影響

從圖2A可以看出，氮源濃度對發(fā)酵后的酒精含量有一定影響，氮源含量增加，酒精含量下降，這主要是因為酵母利用營養(yǎng)物質(zhì)過度生長，導(dǎo)致能夠用于酒精轉(zhuǎn)化的碳源減少。從圖2B可以看出，氮源含量對發(fā)酵液中桑椹主要單體花青素含量也有顯著影響。C-3-G的含量隨著氮源濃度的增加而降低，當(dāng)?shù)礉舛葹?.5 g/L時，其含量為6.5 mg/L，但氮源濃度增加到26 g/L時，其含量僅為0.8 mg/L，與初始含量相比，降幅達到95.7%。同樣，C-3-R的含量隨著氮源濃度的增加也呈遞減的趨勢，當(dāng)?shù)礉舛葹?.5 g/L時，其含量為17.5 mg/L，但氮源濃度增加到26 g/L時，其含量下降到14.0 mg/L。正如前述，氮源的添加有利于酵母的生長，從而使酵母酶系更加活躍，進一步降解花青素。而C-3-G結(jié)構(gòu)比C-3-R簡單，因此更容易受到外源酶等因素的攻擊。

2.3無機鹽對釀酒酵母降解桑椹花青素的影響

本文主要研究了添加外源Fe3+、Mn2+、Ca2+、Zn2+和Cu2+對釀酒酵母酒精發(fā)酵和降解桑椹花青素的影響，其結(jié)果見圖3。

圖3　不同無機鹽對發(fā)酵液中酒精和花青素含量的影響

從圖3A可看出，當(dāng)培養(yǎng)基中添加Fe3+、Mn2+、Ca2+和Zn2+時，發(fā)酵結(jié)束后，酒精度分別為11.3%vol、11.1%vol、10.8%vol和10.6%vol，各組差別無顯著性。然而當(dāng)添加同等濃度的Cu2+后，培養(yǎng)結(jié)束后沒有乙醇生成。這是因為Cu2+具有抗菌作用，酵母生長和發(fā)酵均被抑制，發(fā)酵沒有正常進行，因此在反應(yīng)結(jié)束后檢測不到乙醇的存在。從圖3B可知，培養(yǎng)基中添加Fe3+、Mn2+、Ca2+和Zn2+時對酵母生長的影響較小，酵母對花青素的降解幅度較大，發(fā)酵結(jié)束后C-3-G的含量分別為2.5 mg/L、3.4 mg/L、3.5 mg/L 和3.9 mg/L，是初始含量的13.7%、19.2%、20.5%和21.3%。而在添加Cu2+的培養(yǎng)基中，7 d后C-3-G的含量仍達初始含量的98%，幾乎沒有降解。同樣，C-3-R的含量呈現(xiàn)相似的變化趨勢。Balik［17］發(fā)現(xiàn)Fe3+對花青素有破壞作用，而Zn2+則具有保護作用。我們也發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加硫酸鋅時，C-3-G的含量要比添加硫酸鐵時要高。由于Cu2+具有抗微生物作用，因此，添加Cu2+的發(fā)酵液中的酵母沒有生長發(fā)酵，桑椹花青素也沒有發(fā)生降解。

2.4pH值對釀酒酵母降解桑椹花青素的影響

pH值對釀酒酵母酒精發(fā)酵和降解桑椹花青素的影響見圖4。

圖4　不同pH值對發(fā)酵液中酒精和花青素含量的影響

從圖4A可以看出，發(fā)酵液pH值對釀酒酵母進行酒精發(fā)酵有較大影響，pH值低于4.0時酒精發(fā)酵受到抑制，過高的pH值也影響酒精發(fā)酵，pH4.5時酒精發(fā)酵比較完全。從圖4B可以看出，發(fā)酵液保留的桑椹主要花青素與酒精發(fā)酵的趨勢恰好相反，尤以C-3-G的含量更為明顯。當(dāng)pH3.0時發(fā)酵液中C-3-G的含量最高，為14.9 mg/L，當(dāng)pH4.5時，發(fā)酵液中C-3-G含量最低，為5.6 mg/L，只有初始含量的30.4%。C-3-R的含量受到的影響較小，當(dāng)pH4.5時發(fā)酵液中C-3-R的含量最低，為初始含量的84.9%，當(dāng)pH3.0時，C-3-R含量最高為19.3 mg/L，是初始含量的94.2%。這主要是由于當(dāng)培養(yǎng)基pH值較低時，酵母的生長受到一定的影響，從而影響了其對花青素的降解。從pH值同時影響酵母生長發(fā)酵和桑椹花青素降解的關(guān)系看，酵母降解花青素機制更符合微生物共代謝特點。

2.5外源乙醇對釀酒酵母降解桑椹花青素的影響

添加外源乙醇對釀酒酵母酒精發(fā)酵和降解桑椹花青素的影響見圖5。

從圖5A可以看出，在不添加外源乙醇的正常發(fā)酵中發(fā)酵液酒精度為11.3%vol，隨著乙醇添加量的增加，發(fā)酵結(jié)束后的酒精度呈逐漸遞增的趨勢。當(dāng)發(fā)酵液中乙醇的添加量為5%vol時，發(fā)酵液酒精度達到13.2%vol。由此可見，發(fā)酵液中酒精度隨著乙醇添加量的增加而升高，但添加過高濃度的乙醇，發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇較理論值要低，主要是發(fā)酵液乙醇達到一定濃度時抑制了酵母的生物活性，不再進行酒精發(fā)酵。

圖5　不同乙醇添加量對發(fā)酵液中酒精和花青素含量的影響

從圖5B可以看出，培養(yǎng)基中添加一定濃度的乙醇后，酵母對C-3-G含量的影響比較顯著。隨著發(fā)酵液中初始乙醇濃度的升高，C-3-G的含量基本呈下降趨勢。當(dāng)乙醇含量為1%vol時，發(fā)酵液中C-3-G的含量最高為5.8 mg/L，為初始含量的31.4%，而當(dāng)乙醇含量為5%vol時，發(fā)酵液中C-3-G含量最低為2.6 mg/L，是初始含量的14.3%。但添加不同濃度的乙醇對發(fā)酵液中C-3-R的含量影響較小。初始培養(yǎng)基不添加乙醇時，C-3-R含量最高為16.9 mg/L，當(dāng)乙醇含量增加到4%vol時，發(fā)酵液C-3-R的含量最低為15.8 mg/L，為初始含量的77.1%，下降幅度較小。乙醇作為酵母的代謝產(chǎn)物之一，如果濃度過高會抑制酵母的代謝，理論上應(yīng)該對花青素起到保護作用，但本實驗發(fā)現(xiàn)乙醇的添加促進了酵母對花青素的轉(zhuǎn)化，具體機制有待探索。

3　結(jié)論

添加碳源和氮源以及發(fā)酵液合適的pH值等有利于釀酒酵母生長發(fā)酵的因素，有利于釀酒酵母降解桑椹花青素。添加外源Fe3+、Mn2+、Ca2+和Zn2+對釀酒酵母降解桑椹花青素的影響較小，添加較大量Cu2+完全抑制釀酒酵母的生長、發(fā)酵和對桑椹花青素的降解。添加一定量的外源乙醇盡管對釀酒酵母的發(fā)酵無顯著影響，但促進其降解桑椹花青素。凡是發(fā)生桑椹花青素降解的情況，都是結(jié)構(gòu)較簡單的C-3-G降解為主。

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Effects of Different Factors on Degradation of Mulberry Anthocyanins by Saccharomyces cerevisiae

LAI Jianfeng，YANG Rongling，CHEN Zhiyi and LIU Xueming
（Key Lab of Functional Foods of Ministry ofAgriculture，Guangdong Key Lab ofAgricultural Products Processing，Sericulture& Agri-Food Research Institute，GuangdongAcademy ofAgricultural Sciences，Guangzhou，Guangdong 510610，China）

In order to explore the effects of different factors on the degradation of mulberry anthocyanins by Saccharomyces cerevisiae，the content of two main mulberry anthocyanins（C-3-G and C-3-R）in simulated alcohol fermentation media rich in anthocyanins were investigated by changing carbon source，nitrogen source，minerals，exogenous alcohol concentrations and pH.The results showed that，those factors in favor of the growth and alcohol fermentation of Saccharomyces cerevisiae could improve the degradation of mulberry anthocyanins，especially C-3-G.

Saccharomyces cerevisiae；anthocyanin；mulberry；alcohol fermentation；degradation

TS262.7；TS261.1；TS261.4

A

1001-9286（2016）08-0036-04

10.13746/j.njkj.2016125

廣東省對外合作項目（2013B050800018）；廣州市科技計劃項目（2014J2200068）。

2016-04-12

賴劍峰（1987-），男，碩士研究生。

劉學(xué)銘（1967-），男，博士，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究，E-mail：xuemingliu@21cn.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-06-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160603.1620.008.html。