何宇婧，陳 盼，朱曉松，湯曉黎，石藝尉

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介質(zhì)膜結(jié)構(gòu)空芯光纖酶基傳感器的制作與優(yōu)化

何宇婧，陳 盼，朱曉松，湯曉黎，石藝尉

( 復(fù)旦大學(xué) 通信科學(xué)與工程系，上海 200433 )

設(shè)計(jì)了一種基于介質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的空芯光纖化學(xué)發(fā)光傳感器。建立了多層膜空芯光纖非子午線幾何光學(xué)傳輸模型，對(duì)其損耗譜和發(fā)光特性進(jìn)行了仿真分析，并考慮了介質(zhì)膜界面粗糙度、介質(zhì)膜厚度等相關(guān)參數(shù)對(duì)化學(xué)發(fā)光及傳輸特性的影響。改進(jìn)了溶膠-凝膠酶基敏感膜的制作工藝，提出了分離鍍膜法，并對(duì)敏感膜厚度進(jìn)行了實(shí)測分析。搭建了基于介質(zhì)膜空芯光纖化學(xué)發(fā)光傳感器的檢測系統(tǒng)，對(duì)過氧化氫濃度進(jìn)行了實(shí)際測量。結(jié)果表明，基于本傳感器的系統(tǒng)，得到了22.8 nW/(mmol·L-1)的靈敏度以及3 μmol/L的檢測極限。實(shí)現(xiàn)了近200 h的使用壽命。且操作簡單，反應(yīng)快速，可小型化，可應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測，生物分析等領(lǐng)域。

生物傳感器；多層膜空芯光纖；化學(xué)發(fā)光；酶；溶膠-凝膠法

0 引 言

光纖生物傳感器(Optical Fiber-based Biosensors，OFB)是采用光纖或光纖束作為傳感檢測平臺(tái)的一種生物傳感器，大致可以分為以下幾類[1-2]。酶基生物傳感器、抗體免疫檢測光纖生物傳感器、核酸光纖生物傳感器、全細(xì)胞光纖生物傳感器和仿生學(xué)生物光纖傳感器。其中，酶基光纖生物傳感器是常見諸報(bào)道的光纖生物傳感器[3-5]，典型的光學(xué)檢測方法有吸收、反射、熒光、化學(xué)發(fā)光等。其中，化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence，CL)具有靈敏度高，檢測極限低，線性范圍寬和分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，成為一種非常有潛力的分析方法。其檢測設(shè)備簡便、系統(tǒng)易于搭建，并且無需激勵(lì)光源，因而也無需附加裝置來消除光源散射影響，背景噪聲大大降低，使其相對(duì)于傳統(tǒng)吸收、反射、熒光光譜等檢測方法在選擇性和靈敏度上有明顯的優(yōu)勢[6]。

在酶基化學(xué)發(fā)光傳感系統(tǒng)中，作為重要催化劑的生物酶，其固定化的方式相較于游離酶在穩(wěn)定性以及可重復(fù)使用等方面具有明顯優(yōu)勢[7-8]。固定化酶有多種方法，其中采用溶膠-凝膠(Sol-gel)包埋法是近年來常見的一種快速固定化酶的方法[9-13]。由于溶膠-凝膠是一種透明并且具有化學(xué)惰性的材料，反應(yīng)條件溫和，凝膠介孔不會(huì)影響生物分子官能團(tuán)的活性，因此能夠提供穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)以包埋生物酶分子[9-16]。已報(bào)道的大部分酶基化學(xué)發(fā)光傳感器的制作都是將催化酶溶膠凝膠涂制于透明的玻璃、比色皿等內(nèi)部，導(dǎo)入反應(yīng)劑后直接檢測其產(chǎn)生的熒光。但受限于傳感器的長度和結(jié)構(gòu)，其耦合效率和傳輸效率較低。Ramos等人則將生物酶固定在石英光纖端部進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的檢測[17]，但無法避免室內(nèi)雜光的影響，使得背景光源掩蓋了微弱的熒光信號(hào)，難以獲得較好的靈敏度。我們?cè)谇捌谘芯恐衃18]，利用空芯光纖(Hollow Fiber, HF)作為傳感腔和光傳導(dǎo)介質(zhì)，提出了包埋酶的化學(xué)發(fā)光傳感器。

然而基于金屬結(jié)構(gòu)空芯光纖傳感器(Metallic Hollow Fiber-based CL Sensor，M-HF CL Sensor)仍然存在一些問題，比如，凝膠引起的金屬膜皺縮，顯著地影響了傳感器的使用壽命；凝膠敏感膜厚度的不確定性影響了化學(xué)發(fā)光的傳輸效率的優(yōu)化；磷酸鹽緩沖液的使用雖然加快了凝膠成膜過程，但過快的縮合速度，對(duì)鍍膜時(shí)間有了嚴(yán)格限制，也就是對(duì)凝膠敏感膜厚度有了一定的限制。

為了降低M-HF CL傳感器的傳輸損耗，提高靈敏度和穩(wěn)定性，增加使用壽命，本文設(shè)計(jì)了一種基于介質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的空芯光纖化學(xué)發(fā)光傳感器(Dielectric/metallic Hollow Fiber-based CL Sensor，D-HF CL Sensor)，并對(duì)其損耗譜特性進(jìn)行了理論分析，同時(shí)考慮了介質(zhì)膜界面粗糙度、介質(zhì)膜厚度、折射率等相關(guān)參數(shù)對(duì)化學(xué)發(fā)光傳輸特性的影響，得到了兩層膜空芯光纖非子午線幾何光學(xué)傳輸模型。

通過對(duì)數(shù)值仿真和實(shí)測結(jié)果的分析，可以在制作工藝過程中判斷各層膜厚，從而為調(diào)整工藝參數(shù)和控制各層膜厚提供依據(jù)。在仿真結(jié)果的指導(dǎo)下，我們以內(nèi)徑0.7 mm的玻璃毛細(xì)管作為基管材料，采用改良的液相鍍膜法降低膜的表面粗糙度，制作了Ag/OC300/SiO2結(jié)構(gòu)的介質(zhì)膜空芯光纖化學(xué)發(fā)光傳感器。最后，基于魯米諾(Luminol)－過氧化氫(H2O2)－辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)發(fā)光體系搭建了檢測系統(tǒng)，制作了不同厚度的介質(zhì)膜結(jié)構(gòu)空芯光纖化學(xué)發(fā)光傳感器，并對(duì)H2O2進(jìn)行了定量分析，得到了22.8 nW/(mmol·L-1)的靈敏度以及3 μmol/L的檢測極限。

1 化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)

1.1 化學(xué)發(fā)光傳感器結(jié)構(gòu)

介質(zhì)膜空芯光纖傳感器結(jié)構(gòu)如圖1所示。最外層是由玻璃毛細(xì)管構(gòu)成的基管，作為光纖的機(jī)械支撐?；軆?nèi)壁第一層是均勻銀膜，實(shí)現(xiàn)光的高反射率；第二層是玻璃質(zhì)多聚合物，用于優(yōu)化傳感頭的傳輸特性；第三層是包埋辣根過氧化物酶(HRP)的多孔二氧化硅敏感膜，即形成空芯光纖生物傳感腔?；軆?nèi)壁第一層的銀膜采用改良的液相鍍膜法鍍制，實(shí)現(xiàn)具有一定厚度的均勻光學(xué)反射膜；銀膜內(nèi)壁的介質(zhì)膜則采用了玻璃質(zhì)多聚合物(R2SiO)OC300進(jìn)行鍍制，通過調(diào)節(jié)膜厚來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)波長的低損耗傳輸[19]。最內(nèi)層則是采用Sol-gel分離鍍膜法制作的包埋HRP的多孔二氧化硅敏感膜[18, 20]。

圖1 介質(zhì)膜結(jié)構(gòu)空芯光纖化學(xué)發(fā)光傳感器結(jié)構(gòu)圖

第二層OC300介質(zhì)膜除了對(duì)于銀膜具有保護(hù)作用外，與第三層包埋HRP的多孔二氧化硅敏感膜之間可以形成Si-O-Si化學(xué)鍵，增強(qiáng)了膜的附著力，相較于金屬結(jié)構(gòu)空芯光纖傳感器可以顯著地延長使用壽命。該介質(zhì)膜在室溫下即可完成制備，主劑、稀釋劑、硬化劑混合而成的OC300溶液由蠕動(dòng)泵送液，勻速通過鍍銀空芯光纖即可生成介質(zhì)膜。在制備過程中通過調(diào)節(jié)溶液濃度、溫度、蠕動(dòng)泵流速等因素，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)

膜厚的控制

[21-25]

。

圖2 基于介質(zhì)膜空芯光纖傳感器的化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)

1.2 化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)

如圖2所示，待測H2O2和Luminol混合后，再由蠕動(dòng)泵抽送至介質(zhì)膜空芯光纖傳感器一端，而傳感器另一端固定一個(gè)帶有透明窗片的L型二通元件。待測樣液接觸傳感器內(nèi)壁酶基敏感膜，在敏感膜包埋的HRP催化下發(fā)出中心波長為425 nm的藍(lán)色熒光。藍(lán)色熒光透過窗片被光功率計(jì)檢測頭接收。同時(shí)廢液通過二通元件排出，這樣既保持了檢測器內(nèi)待測樣液流動(dòng)的穩(wěn)定性，也避免了光學(xué)元器件被污染。檢測器采用以色列Ophir公司的PD-300UV+Nova II光功率計(jì)，可檢測的波長范圍為200 nm ~1 100 nm。

2 理論建模與仿真優(yōu)化

2.1 傳感器傳輸模型

空芯光纖的內(nèi)徑大致在一百到幾百微米。對(duì)于化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)，傳輸?shù)哪繕?biāo)波長遠(yuǎn)小于波導(dǎo)尺寸，因此可以采用幾何光學(xué)法[26-27]建模分析多層膜空芯光纖的光譜特性，并進(jìn)行介質(zhì)膜的膜厚以及化學(xué)發(fā)光傳感中各項(xiàng)參數(shù)的優(yōu)化計(jì)算。

在空芯光纖化學(xué)發(fā)光傳感器中，考慮到空芯光纖內(nèi)部各處均可被酶基敏感膜催化產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，它們分別沿著傳輸方向疊加累積同時(shí)也產(chǎn)生傳輸損耗，并且光纖內(nèi)化學(xué)發(fā)光的全向性也使得其不再滿足子午光線近似條件，等效于光線螺旋式前進(jìn)傳輸[18]。因此建立了多層膜非子午線幾何傳輸模型，對(duì)傳感器的優(yōu)化進(jìn)行仿真分析。斜光線入射示意圖如圖3。由幾何關(guān)系可得：

其單位長度的光程和反射次數(shù)分別為

則傳輸衰減常數(shù)為

圖3 斜光線入射角度示意圖

假設(shè)傳感器內(nèi)部酶基敏感膜催化激發(fā)的化學(xué)發(fā)光均勻，可將其看作在立體角上均勻發(fā)光，單位立體角上發(fā)光功率為0/4p。由立體幾何關(guān)系可得輸出光功率：

圖4(a)為化學(xué)發(fā)光傳感器在發(fā)光波段的損耗譜仿真結(jié)果，分別對(duì)應(yīng)介質(zhì)膜和金屬膜兩種結(jié)構(gòu)的空芯光纖CL傳感器?？招竟饫w長度均為8 cm，孔徑均為700 μm。敏感膜折射率經(jīng)過阿貝折射儀實(shí)測為1.361，

圖4 (a) 金屬結(jié)構(gòu)和介質(zhì)膜結(jié)構(gòu)空芯光纖化學(xué)發(fā)光傳感器在發(fā)光波段的損耗譜特性；(b) 介質(zhì)膜(OC300)厚度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系

OC300介質(zhì)膜折射率根據(jù)文獻(xiàn)[28]取值為1.46?？梢钥闯?，D-HF CL傳感器在425 nm的發(fā)光波段相較于M-HF CL傳感器的傳輸損耗更低，并且可以通過調(diào)節(jié)介質(zhì)膜厚度來改變低損傳輸?shù)牟ǘ畏秶D4(a)中實(shí)線為M-HF CL傳感器在不同波段的傳輸損耗譜，虛線由左到右分別為OC300介質(zhì)膜厚340 nm，360 nm，380 nm的D-HF CL傳感器。可以看出，360 nm介質(zhì)膜厚度的傳感器在425 nm的發(fā)光波段傳輸損耗最低。

圖4(b)則模擬了不同OC300介質(zhì)膜厚度的D-HF CL傳感器的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，虛線代表了M-HF CL傳感器的發(fā)光強(qiáng)度，即OC300介質(zhì)膜厚度為0的情況。同時(shí)考慮了介質(zhì)膜的吸收和介質(zhì)膜與銀膜之間的粗糙度。由圖4(b)可以看出，OC300介質(zhì)膜在258 nm~385 nm的膜厚范圍內(nèi)，傳輸損耗均小于M-HF CL傳感器。由于實(shí)驗(yàn)中選擇了350 nm厚度OC300介質(zhì)膜，之后的理論計(jì)算中，均取該參數(shù)進(jìn)行仿真。

2.2 傳感器的長度優(yōu)化

圖5(a)給出了不同內(nèi)徑的D-HF CL傳感器長度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系。實(shí)線和虛線分別為介質(zhì)膜空芯光纖傳感器(D-HF CL sensor)和金屬結(jié)構(gòu)空芯光纖傳感器(M-HF CL sensor)。圖5(b)給出了700 μm內(nèi)徑的兩種結(jié)構(gòu)傳感器更為清晰的比較圖。在優(yōu)化OC300介質(zhì)膜膜厚的基礎(chǔ)上，鍍制酶基敏感膜，可以降低非子午線模型化學(xué)發(fā)光的傳輸損耗。可以看到相同長度和內(nèi)徑條件下D-HF CL傳感器得到的化學(xué)發(fā)光光強(qiáng)更大。

從圖5可以看出，化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度隨著光纖長度增加而加大。但隨著光纖長度繼續(xù)增加，酶促反應(yīng)釋放的熒光在傳輸過程中損耗殆盡，因而存在熒光信號(hào)強(qiáng)度的極限值。另一方面內(nèi)徑越大，損耗越低，因此輸出熒光信號(hào)強(qiáng)度越大。取出射光強(qiáng)達(dá)到最大值90%時(shí)的傳感器長度為最優(yōu)長度，可以看出，最優(yōu)長度也隨著內(nèi)徑的增大而增大。只要傳感器長度大于最優(yōu)長度便可使化學(xué)光強(qiáng)接近最強(qiáng)。理論仿真結(jié)果可以看到，700 μm內(nèi)徑的D-HF CL傳感器的最優(yōu)長度為8 cm。在傳感器的實(shí)際制作中，選取該長度。

同時(shí)，D-HF CL傳感器的最優(yōu)長度相對(duì)于M-HF CL傳感器的最優(yōu)長度有了一定提高。主要是介質(zhì)膜降低了傳輸衰減，使單位長度內(nèi)光強(qiáng)增量增加。故其達(dá)到飽和發(fā)光狀態(tài)的最優(yōu)長度增加。對(duì)于較小內(nèi)徑空芯光纖傳感器，最優(yōu)長度的增加不明顯。可以說介質(zhì)膜對(duì)較大孔徑HF CL傳感器最優(yōu)長度的影響更明顯。

圖5 (a) 不同內(nèi)徑下化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與傳感器長度的關(guān)系；(b) 700 μm內(nèi)徑D-HF CL傳感器化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與傳感器長度的關(guān)系

2.3 粗糙度的影響

在實(shí)際制作空芯光纖傳感器時(shí)，薄膜表面的粗糙度難以避免。理論上，各層膜表面粗糙度越大，則附加損耗越大。通過對(duì)光在兩種介質(zhì)分界面處的反射模型中計(jì)入散射的波矢進(jìn)行修正[21,25,29]，進(jìn)而對(duì)粗糙度引起的附加損耗進(jìn)行仿真研究。圖6分別為1 mm和700 μm內(nèi)徑D-HF CL傳感器在不同粗糙度條件下，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度和最優(yōu)長度的關(guān)系。對(duì)于相同孔徑傳感器，由上到下的曲線代表粗糙度分別取50 nm、60 nm、70 nm的不同情況?？梢钥闯龃植诙仍酱螅顑?yōu)長度越短。同時(shí)，粗糙度對(duì)于較大孔徑HF CL傳感器的最優(yōu)長度影響更明顯，即較大孔徑傳感器在不同粗糙度影響下，最優(yōu)長度的變化范圍更大。

圖6 不同粗糙度條件下，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與傳感器長度的關(guān)系

3 實(shí)驗(yàn)及制作參數(shù)優(yōu)化

3.1 酶基敏感膜的制作

溶膠-凝膠儲(chǔ)備液的制備參考文獻(xiàn)[18]，將1 mg辣根過氧化物酶(酶活力不小于250 U/mg)溶于0.5 mL PH=6.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)中備用。在已有的文獻(xiàn)中，都是將Sol-gel儲(chǔ)備液和溶有HRP的緩沖液混合攪拌后，進(jìn)行鍍膜工藝。在室溫的條件下混合后的溶膠凝膠溶液凝固時(shí)間大致為50 s到120 s，若要在如此短的Sol-gel儲(chǔ)備液凝固時(shí)間內(nèi)完成酶基敏感膜的鍍制，只能通過加快送液速度來實(shí)現(xiàn)。但對(duì)于孔徑較大、最優(yōu)長度較長的傳感器來說，速度過快，則敏感膜的膜厚和粗糙度顯著增加，造成傳感器性能的下降。

基于以上原因，本文在實(shí)際制作過程中，提出并采用了分離鍍膜法。其制作流程如圖7所示。將溶膠-凝膠儲(chǔ)備液和溶有HRP的PBS緩沖液分離放置，首先打開開關(guān)1，使溶膠-凝膠溶液自下而上地勻速通過，保證光纖內(nèi)壁能夠均勻黏著。接著關(guān)閉開關(guān)1并打開開關(guān)2，讓溶有HRP的PBS緩沖液以同樣的方式勻速流過。送液結(jié)束后，封閉光纖兩端，密閉老化一段時(shí)間，即完成傳感器的制作，使用阿貝折射儀測定包埋HRP的凝膠膜折射率為1.361。

采用分離鍍膜法，消除了凝固時(shí)間對(duì)鍍膜過程的限制，同時(shí)由于蠕動(dòng)泵送液速度影響著酶基敏感膜厚度[30]，還可以通過調(diào)節(jié)兩種儲(chǔ)備液的流速實(shí)現(xiàn)對(duì)膜厚的優(yōu)化。一方面，酶分子濃度固定，膜越厚，則酶分子含量越多，化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度會(huì)有所提高。另一方面，酶基敏感膜厚度越厚，吸收引起的傳感器損耗也會(huì)變大。本文通過調(diào)節(jié)兩種儲(chǔ)備液的流速制作了700 μm內(nèi)徑不同酶基敏感膜厚度的D-HF CL傳感器，并實(shí)測了相同濃度H2O2在本系統(tǒng)的發(fā)光強(qiáng)度。結(jié)果如圖8所示。

圖8(a)是固定溶有HRP的PBS緩沖液流速之后，調(diào)節(jié)sol-gel 溶液送液速度制作的一系列的D-HF CL傳感器的實(shí)測光強(qiáng)歸一化結(jié)果，當(dāng)sol-gel溶液速度為9.41 cm/min時(shí)制作的D-HF CL傳感器檢測到的固定濃度H2O2的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最高。圖8(b)是固定sol-gel溶液送液速度之后，改變?nèi)苡蠬RP的PBS緩沖液流速制作的一系列的D-HF CL傳感器的實(shí)測光強(qiáng)歸一化結(jié)果，當(dāng)緩沖液流速為4.50 cm/min時(shí)，檢測光強(qiáng)最高。經(jīng)過對(duì)損耗譜的實(shí)測發(fā)現(xiàn)，兩種流速下鍍制的敏感膜厚度為150 nm，根據(jù)仿真結(jié)果可知，介質(zhì)膜厚度為350 nm時(shí)，該酶基敏感膜厚度下，化學(xué)發(fā)光較強(qiáng)。

圖7 介質(zhì)膜結(jié)構(gòu)空芯光纖化學(xué)發(fā)光傳感器 酶基敏感膜鍍制系統(tǒng)圖

圖8 (a) 溶膠凝膠溶液的流速與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系；(b) 溶有HRP的PBS緩沖液的流速與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系

3.2 酶基敏感膜的厚度

在單層介質(zhì)膜空芯光纖結(jié)構(gòu)中，實(shí)測損耗譜中的各個(gè)干涉峰波長成倍數(shù)關(guān)系，只要得到某個(gè)干涉峰的波長便能計(jì)算[23]介質(zhì)膜膜厚。然而對(duì)多層膜結(jié)構(gòu)，已無法套用單層膜估算方法。我們利用光纖損耗譜特性間接估算多層介質(zhì)膜的膜厚。用一組膜厚值進(jìn)行仿真，當(dāng)膜厚值的理論損耗譜曲線和實(shí)測損耗譜曲線吻合時(shí)，我們便認(rèn)為該組膜厚值為空芯光纖多層介質(zhì)膜的厚度。單獨(dú)測量M-HF CL傳感器的損耗譜時(shí)，由于酶基敏感膜厚度較薄，無法測到干涉峰，所以鍍制一層OC300能很好的計(jì)算出敏感膜厚度。

圖9 介質(zhì)膜空芯光纖化學(xué)發(fā)光傳感器損耗譜

根據(jù)以上參數(shù)設(shè)計(jì)的傳感器的損耗譜如圖9所示，根據(jù)單層膜膜厚的計(jì)算公式和干涉峰位置可以算得D-HF CL傳感器制作所采用的空芯光纖OC300介質(zhì)膜厚度為350 nm，將酶基敏感膜厚度取為150 nm時(shí)帶入多層膜損耗譜計(jì)算模型，理論計(jì)算和實(shí)驗(yàn)測量結(jié)果在可見光區(qū)域的低損耗窗口位置一致。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

4.1 系統(tǒng)其它參數(shù)

在仿真分析優(yōu)化傳感器設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步提高HF CL傳感系統(tǒng)的性能，還實(shí)測了待測液進(jìn)液速度、PH值以及Luminol濃度值等三項(xiàng)影響輸出光功率的參數(shù)。首先固定待測反應(yīng)劑濃度和進(jìn)液速度(2.5 cm/min)。由于本系統(tǒng)中未添加任何化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑，所以PH的選擇極為重要，甚至影響整個(gè)系統(tǒng)的靈敏度。辣根過氧化物酶(HRP)的活性最佳PH值在6.5~7之間，而Luminol在堿性條件下(PH值10~11)的量子產(chǎn)率最大，因此取少量NaOH和PBS緩沖液調(diào)節(jié)PH，進(jìn)行固定反應(yīng)劑濃度的化學(xué)發(fā)光實(shí)測，確定了PH值取8.5時(shí)，化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度最大。并在該P(yáng)H值下以同樣的單一變量法確定了Luminol濃度為2.5 mmol/L。

4.2 實(shí)測結(jié)果

為了驗(yàn)證仿真模型的可靠性，實(shí)際制作了兩組OC300介質(zhì)膜厚度均為350 nm的D-HF CL傳感器，對(duì)固定濃度的反應(yīng)劑進(jìn)行了化學(xué)發(fā)光的檢測——采用內(nèi)徑均為700 μm，長度分別為2 cm、5 cm、6 cm、7 cm和8 cm的D-HF CL傳感器，得到的實(shí)測結(jié)果如圖10(a)。采用長度均為8 cm，內(nèi)徑分別為200 μm、320 μm、540 μm、700 μm的D-HF CL傳感器得到的實(shí)測結(jié)果如圖10(b)。實(shí)測值與理論曲線的趨勢吻合，說明利用該模型可以比較準(zhǔn)確地反映相關(guān)參數(shù)的影響。

圖10 (a) 不同長度介質(zhì)膜HF-CL傳感器化學(xué)發(fā)光理論曲線與實(shí)測值；(b) 不同孔徑介質(zhì)膜HF-CL傳感器化學(xué)發(fā)光理論曲線與實(shí)測值

為了比較介質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和金屬結(jié)構(gòu)這兩種HF CL傳感器的性能，分別實(shí)測了兩種傳感器在相同過氧化氫濃度(0.05 mmol/L)下的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，結(jié)果如圖11所示——本文設(shè)計(jì)的D-HF CL傳感器(Ag/OC300/sol-gel with HRP)實(shí)測到的發(fā)光強(qiáng)度最大，較弱的光譜曲線是傳統(tǒng)的M-HF CL傳感器(Ag/sol-gel with HRP)的實(shí)測結(jié)果。其中D-HF CL傳感器的OC300介質(zhì)膜厚度為350 nm，兩種傳感器的酶基敏感膜厚度均為150 nm。由圖可見，在相同濃度H2O2下，D-HF CL傳感器測得的化學(xué)發(fā)光更強(qiáng)。最下面的光譜曲線則是用OC300包埋HRP形成酶基敏感膜的實(shí)測結(jié)果，可見由于結(jié)構(gòu)致密，無法讓生物酶分子與待測反應(yīng)劑接觸，基本沒有產(chǎn)生發(fā)光。

由于OC300介質(zhì)膜對(duì)酶基敏感膜具有更好的黏附性，使得D-HF CL傳感器的穩(wěn)定性更好，化學(xué)發(fā)光更強(qiáng)——在相同濃度反應(yīng)劑下經(jīng)過多次測量后繼續(xù)使用，得到的光信號(hào)強(qiáng)度依然能達(dá)到最高測量值的95%以上。而經(jīng)過多次測量使用的M-HF CL傳感器對(duì)相同濃度反應(yīng)劑的檢測強(qiáng)度則降為測量最高值的42.6%。這主要是因?yàn)殂y膜對(duì)酶基敏感膜的粘附力不強(qiáng)，導(dǎo)致銀膜由于多次測量產(chǎn)生了皺縮，從而降低了傳感器的使用壽命。如圖12所示，(a)、(b)分別為700 μm內(nèi)徑的M-HF CL傳感器和D-HF CL傳感器，(c)、(d)分別是內(nèi)徑為1 mm的M-HF CL傳感器和D-HF CL傳感器?？梢悦黠@觀察到M-HF CL傳感器的銀膜脫落現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，老化時(shí)間在三天以內(nèi)的傳感器性能穩(wěn)定，老化時(shí)間超過10天傳感器性能明顯下降。

4.3 過氧化氫濃度標(biāo)定

4.3 過氧化氫濃度標(biāo)定采用D-HF CL傳感器對(duì)范圍在1 mmol/L~7 mmol/L的過氧化氫濃度進(jìn)行了標(biāo)定，其化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果與擬合曲線如圖13。對(duì)過氧化氫濃度范圍在1 mmol/L~7 mmol/L的實(shí)測發(fā)光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到方程為=22.81-18.206，相關(guān)系數(shù)為0.991。說明D-HF CL傳感器對(duì)H2O2濃度的響應(yīng)較好，發(fā)光信號(hào)可以作為其濃度的表征量，且檢測過程中未添加任何增強(qiáng)劑，靈敏度為22.8 nW/mmol。對(duì)摩爾濃度為5 mmol/L的的過氧化氫樣品重復(fù)測量5次，RSD為±2.06%，重復(fù)性較好。

由式(7)可以看出，相較于M-HF CL傳感器，D-HF CL傳感器的最優(yōu)長度較大有效地提高了H2O2定量檢測系統(tǒng)的靈敏度。而對(duì)于相同長度的D-HF CL傳感器，介質(zhì)膜厚度不同則傳感器的衰減系數(shù)不同，進(jìn)而表現(xiàn)為靈敏度的不同。圖14給出了兩種不同介質(zhì)膜厚度的空芯光纖CL傳感器的檢測結(jié)果，兩根曲線分別為介質(zhì)膜膜厚為350 nm和487 nm空芯光纖傳感器的定量擬合結(jié)果?？梢钥闯?50 nm空芯光纖CL傳感器的靈敏度更高。通過計(jì)算也可以得到350 nm D-HF CL傳感器在纖芯充滿待測液的條件下衰減系數(shù)較低。由此可見在長度、敏感膜厚度、酶含量均相同的條件下，350 nm介質(zhì)膜厚靈敏度更高。

5 結(jié) 論

設(shè)計(jì)了基于介質(zhì)膜空芯光纖的化學(xué)發(fā)光傳感器，并改進(jìn)了溶膠凝膠法對(duì)酶基敏感膜的制作工藝，提出了分離鍍膜法，從而解決了多次測量引起空芯光纖金屬膜皺縮的問題，大幅提高了傳感器使用壽命，使其性能在200 h內(nèi)保持良好。同時(shí)建立了多層膜空芯光纖非子午線幾何光學(xué)傳輸模型，并對(duì)不同長度和內(nèi)徑的傳感器進(jìn)行了實(shí)測，驗(yàn)證了該模型的可靠性。通過理論仿真進(jìn)一步探討了相關(guān)參數(shù)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響，為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了重要參考。根據(jù)理論指導(dǎo)給出的最優(yōu)化參數(shù)，制作了不同介質(zhì)膜厚度的傳感器，并進(jìn)行了系統(tǒng)響應(yīng)研究，得到不同濃度范圍內(nèi)關(guān)于過氧化氫濃度的標(biāo)定曲線。同時(shí)也分析和實(shí)測了介質(zhì)膜厚度對(duì)化學(xué)發(fā)光傳輸特性的影響，結(jié)果表明通過對(duì)介質(zhì)膜厚度的優(yōu)化設(shè)計(jì)，可以進(jìn)一步提高傳感器的靈敏度以及檢測極限。

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Fabrication and Optimization of Enzyme Biosensors Based on Hollow Fiber with Dielectric Film

HE Yujing，CHEN Pan，ZHU Xiaosong，TANG Xiaoli，SHI Yiwei

( School of Information Science and Engineering, Fudan University, Shanghai 200433, China )

A chemiluminescence sensor is proposed based on the dielectric coated silver hollow fiber. A ray optics model is established for the multi-layer hollow fiber to analyze the loss spectrum and chemiluminescent characteristics. And parameters such as film surface roughness and thickness are taken into consideration. The fabrication techniques for coating sol-gel sensing film inside the hollow fiber are developed. A sensing system is designed and established for detecting hydrogen peroxide concentration and a high sensitivity (22.8 nW/(mmol·L-1)) and good detection limit (3 μmol/L) are achieved. This sensor has a good performance in 200 hours. It has potential applications in environmental monitoring and biological analysis fields for its simple operation, fast response, and miniaturization.

biosensors; multi-layer hollow fiber; chemiluminescence; enzyme; sol-gel

1003-501X(2016)08-0018-09

TP212.3

A

10.3969/j.issn.1003-501X.2016.08.004

2015-07-17；

2015-12-11

國家自然科學(xué)基金(61201062)；上海市自然科學(xué)基金(15ZR1404100)資助項(xiàng)目

何宇婧(1988-)，女(蒙古族)，上海人。碩士研究生，主要從事空芯波導(dǎo)生物傳感器的應(yīng)用研究。E-mail: 11110720014@fudan.edu.cn。