趙秀梅　王　娟

5-氟尿嘧啶聯(lián)合蒽貝素對(duì)結(jié)腸癌小鼠Caspase-3及NF-κB活性表達(dá)的影響

趙秀梅王娟

目的探討5-氟尿嘧啶聯(lián)合蒽貝素對(duì)結(jié)腸癌小鼠Caspase-3及NF-KB活性表達(dá)的影響。方法入選小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480培養(yǎng)，并建立動(dòng)物模型，對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物分為四組，每組10只，實(shí)驗(yàn)組分別予以5-氟尿嘧啶、蒽貝素、5-氟尿嘧啶聯(lián)合蒽貝素，對(duì)照組予以生理鹽水，對(duì)四組培養(yǎng)細(xì)胞分別進(jìn)行細(xì)胞活性、腫瘤球體積大小、NF-kB活性及caspase-3活性、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行腫瘤球變化率及小鼠生存時(shí)間檢測(cè)，比較四組間差異。結(jié)果聯(lián)合應(yīng)用5-FU及蒽貝素組細(xì)胞caspase-3活性顯著高于對(duì)照組及單純使用5-FU、蒽貝素組（P<0.05）；而NF-κB活性低于其他各組（P<0.05）；5-FU、蒽貝素組caspase-3活性顯著高于對(duì)照組（P<0.05），NF-κB活性低于對(duì)照組（P<0.05）；聯(lián)合應(yīng)用5-FU及蒽貝素組細(xì)胞的腫瘤體積變化率及生存時(shí)間顯著優(yōu)于對(duì)照組及單純使用5-FU、蒽貝素組（P<0.05）；聯(lián)合應(yīng)用5-FU及蒽貝素組細(xì)胞的細(xì)胞處理24 h后細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組及單純使用5-FU、蒽貝素組（P<0.05）；單純使用5-FU、蒽貝素組24h后細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組（P< 0.05）。結(jié)論蒽貝素同5-FU對(duì)C26結(jié)腸癌細(xì)胞抑制增殖促進(jìn)凋亡有協(xié)同作用，經(jīng)抑制NF-κB通路進(jìn)而影響腫瘤生長(zhǎng)，經(jīng)與XIAP蛋白BIR-3功能域的結(jié)合，提高Caspase-3活性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為臨床治療結(jié)腸癌開辟新的化療途徑提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

NF-κB；Caspase-3；5-氟尿嘧啶；結(jié)腸癌；蒽貝素

結(jié)腸癌是臨床較為常見惡性腫瘤之一，早期癥狀不明顯，病情發(fā)展緩慢，待發(fā)現(xiàn)后多為中晚期或已轉(zhuǎn)移，因此臨床多采用化療治療，放療對(duì)結(jié)腸癌敏感性較差及小腸毒副作用明顯[1]。相關(guān)研究顯示，化療藥物同蒽貝素結(jié)合，可逆轉(zhuǎn)腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥性，增強(qiáng)藥物對(duì)腫瘤的抑制作用[2]。本研究中旨在探究蒽貝素聯(lián)合5-氟尿嘧啶對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞抑制增殖促進(jìn)凋亡是否有協(xié)同作用及其機(jī)理，效果滿意，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料和方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480在含有鏈霉素100 μg/mL、青霉素100 μg/mL、小牛血清100 mL/L的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

二、實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理

將優(yōu)選后的40只荷瘤小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，建立動(dòng)物模型，對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物處理，實(shí)驗(yàn)組分三組，分別給予5-氟尿嘧啶20 mg/kg、蒽貝素20 mg/kg、5-氟尿嘧啶（20 mg/kg）聯(lián)合蒽貝素（10 mg/kg），對(duì)照組給予生理鹽水。MTT檢測(cè)細(xì)胞活性；Tunel檢測(cè)凋亡；EMSA法檢測(cè)細(xì)胞NF-kB活性；Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3活性。C26細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，接種于低熔點(diǎn)瓊脂糖96孔板中，每孔100 μL，待測(cè)細(xì)胞密度為1×104/孔，5%CO2，37℃，孵育12 h后加藥，兩組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，孵育24～96 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，即0.5%MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，將孔內(nèi)培養(yǎng)液小心吸去，每孔加入二甲基亞砜150 μL，放置于搖床上低速震蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物，孵育7 d，每天統(tǒng)計(jì)四組腫瘤體積大??；C26細(xì)胞培養(yǎng)，接種于小鼠右大腿皮下，建立結(jié)腸癌移植瘤模型40只；每?jī)商鞙y(cè)量一次腫瘤大??；計(jì)算小鼠生存時(shí)間；腫瘤組織取材行HE染色。比較四組細(xì)胞NF-κB活性及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3活性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

經(jīng)SPSS 17.0軟件行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以x±s表示，采用F檢驗(yàn)，P<0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、四組細(xì)胞NF-KB活性及caspase-3活性的評(píng)估比較

聯(lián)合應(yīng)用5-FU及蒽貝素組細(xì)胞caspase-3活性顯著優(yōu)于對(duì)照組及單純使用5-FU、蒽貝素組（P<0.05）；而NF-κB活性低于其他各組（P<0.05）；5-FU、蒽貝素組caspase-3活性顯著優(yōu)于對(duì)照組（P<0.05），NF-κB活性低于對(duì)照組（P< 0.05），見表1。

表1　四組細(xì)胞24 h NF-κB活性及caspase-3活性的評(píng)估比較（x ±s，μg/mL）

表1　四組細(xì)胞24 h NF-κB活性及caspase-3活性的評(píng)估比較（x ±s，μg/mL）

注：*與5-FU聯(lián)合蒽貝素組比較，P<0.05；#與對(duì)照組比較，P<0.05。

組別nCaspase-3活性NF-κB活性5-FU聯(lián)合蒽貝素組10273.2±3.51.4±0.2 5-FU組10175.3±2.3*#1.8±0.4*#蒽貝素組10174.2±2.5*#1.7±0.5*#對(duì)照組1065.3±1.2*3.5±1.4* F值-9.12511.306 P值-0.0010.000

二、四組的小鼠生存時(shí)間及腫瘤體積下降率的評(píng)估比較

聯(lián)合應(yīng)用5-FU及蒽貝素組細(xì)胞的腫瘤體積變化率及生存時(shí)間顯著優(yōu)于對(duì)照組及單純使用5-FU、蒽貝素組（P< 0.05），見表2。

表2　四組的小鼠生存時(shí)間及腫瘤體積下降率的評(píng)估比較（±s）

表2　四組的小鼠生存時(shí)間及腫瘤體積下降率的評(píng)估比較（±s）

注：*與5-FU聯(lián)合蒽貝素組比較，P<0.05；#與對(duì)照組比較，P<0.05。

組別n生存時(shí)間（d）腫瘤體積下降率（%）5-FU聯(lián)合蒽貝素組103.5±1.419.8±1.2 5-FU組102.5±0.5*#12.3±0.5*#蒽貝素組102.6±0.4*#10.4±0.6*#對(duì)照組101.1±0.2*2.2±0.2* F值-13.33718.195 P值-0.0000.000

三、四組細(xì)胞處理24 h后細(xì)胞凋亡率的評(píng)估比較

聯(lián)合應(yīng)用5-FU及蒽貝素組細(xì)胞的細(xì)胞處理24 h后細(xì)胞凋亡率顯著優(yōu)于對(duì)照組及單純使用5-FU、蒽貝素組（P< 0.05）；單純使用5-FU、蒽貝素組24 h后細(xì)胞凋亡率顯著優(yōu)于對(duì)照組（P<0.05），見表3。

四、Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的變化

XIAP小分子抑制劑Embelin以不同濃度作用于小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480 24 h后，Western blot檢測(cè)凋亡信號(hào)途徑中相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，Embelin可促使caspase-3的活化，產(chǎn)生caspase-3的剪切體，且呈劑量依賴性，隨著Embelin濃度的增大，caspase-3活化增強(qiáng)，同時(shí)，caspase-3的活化繼而剪切凋亡底物PARP，并與Embelin的濃度呈正相關(guān)，見圖1。

表3　四組細(xì)胞處理24 h后癌細(xì)胞凋亡率的評(píng)估比較（±s，%）

表3　四組細(xì)胞處理24 h后癌細(xì)胞凋亡率的評(píng)估比較（±s，%）

注：四組間比較，F(xiàn)＝4.626，P＝0.003。*與5-FU聯(lián)合蒽貝素組比較，P<0.05；#與對(duì)照組比較，P<0.05。

組別n癌細(xì)胞凋亡率5-FU聯(lián)合蒽貝素組1013.4±1.5 5-FU組104.5±0.7*#蒽貝素組104.7±0.9*#對(duì)照組102.1±0.2*

圖1　 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白相應(yīng)電泳圖

討論

通?？鼓[瘤藥物都是經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡殺死腫瘤細(xì)胞的。最近幾年凋亡抑制蛋白（IAPs）成為臨床較為關(guān)注的蛋白質(zhì)家族，其屬于獨(dú)立于Bcl-2的抗凋亡蛋白，某些IAPs成員高表達(dá)會(huì)控制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤發(fā)展，其中X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）可有效抑制腫瘤細(xì)胞凋亡?，F(xiàn)研究稱XIAP可選擇性抑制腫瘤細(xì)胞凋亡上游啟動(dòng)分子Caspase-9和下游效應(yīng)分子Caspase-3、Caspase-7，是目前發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)的[3]。在機(jī)體中X正常組織中XIAP是低水平表達(dá)，但在惡性腫瘤內(nèi)則處于高表達(dá)狀態(tài)。

本研究探析5-氟尿嘧啶聯(lián)合蒽貝素對(duì)結(jié)腸癌小鼠的caspase-3及NF-κB活性的表達(dá)影響，5-FU為抗嘧啶類代謝藥物，可對(duì)DNA合成及RNA合成產(chǎn)生影響[4-5]。相關(guān)研究顯示[6]，5-FU的抗腫瘤機(jī)制和藥物濃度相關(guān)，藥物濃度較低時(shí)則會(huì)一直呈抗腫瘤機(jī)制作用，但藥物濃度過高時(shí)5-FU則會(huì)大幅度增加其毒副作用，因此5-FU聯(lián)合抗腫瘤藥物，可在較低濃度下達(dá)到抗腫瘤作用。蒽貝素是從植物Embiliaribe中提取的多酚類化合物，為XIAP的小分子抑制劑，可抗腫瘤，抗炎癥。經(jīng)結(jié)構(gòu)分析蒽貝素可阻止XIAP抑制Caspase的活性，進(jìn)而控制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7-8]。在前列腺腫瘤細(xì)胞體外試驗(yàn)中顯示，微克蒽貝素可有效阻礙高表達(dá)XIAP癌細(xì)胞生長(zhǎng)，可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，且對(duì)正常細(xì)胞無影響。且蒽貝素還可在具有FLIP條件下，阻礙NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路，控制腫瘤生長(zhǎng)，此外還可將TRAIL抵抗細(xì)胞轉(zhuǎn)化為敏感細(xì)胞，進(jìn)而增強(qiáng)TRAIL導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的敏感性[9]。本研究結(jié)果顯示：聯(lián)合應(yīng)用5-FU及蒽貝素組細(xì)胞caspase-3活性顯著高于對(duì)照組及單純使用5-FU、蒽貝素組（P<0.05）；而NF-κB活性低于其他各組（P<0.05）；5-FU、蒽貝素組caspase-3活性顯著高于對(duì)照組（P<0.05），NF-κB活性低于對(duì)照組（P< 0.05）；聯(lián)合應(yīng)用5-FU及蒽貝素組細(xì)胞的腫瘤體積變化率及生存時(shí)間顯著優(yōu)于對(duì)照組及單純使用5-FU、蒽貝素組（P< 0.05）；聯(lián)合應(yīng)用5-FU及蒽貝素組細(xì)胞的細(xì)胞處理24 h后細(xì)胞凋亡率顯著優(yōu)于對(duì)照組及單純使用5-FU、蒽貝素組（P< 0.05）；單純使用5-FU、蒽貝素組24 h后細(xì)胞凋亡率顯著優(yōu)于對(duì)照組（P<0.05），與杜伯雨等[10]的研究結(jié)果大體一致，說明5-FU聯(lián)合蒽貝素可顯著提高結(jié)腸癌小鼠的Caspase活性的表達(dá)，而對(duì)NF-κB通路產(chǎn)生抑制作用，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，提高其生存時(shí)間及腫瘤體積下降率。綜上所述，蒽貝素同5-FU對(duì)C26結(jié)腸癌細(xì)胞抑制增殖促進(jìn)凋亡有協(xié)同作用，主要通過抑制NF-κB通路抑制腫瘤生長(zhǎng)并通過與XIAP蛋白BIR-3功能域的結(jié)合阻止XIAP抑制Caspase-3的活性，從而抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為臨床治療結(jié)腸癌開辟新的化療途徑提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯：任玥欣）

10.3969/j.issn.1672-2159.2016.02.059

442000湖北醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部

2016-02-29）