蔣永洪　陳科全　陳學清

·短篇論著·

乳酸菌重組人堿性成纖維生長因子表達載體的構建及鑒定

蔣永洪陳科全陳學清

目的構建乳酸菌重組人堿性成纖維蛋白表達載體，為口服治療炎癥性腸病探索新途徑。方法利用融合PCR技術，將Ptuf啟動子及pePN終止子與USP45-bFGF融合，構建全長片段后克隆于pbluescript載體中，經驗證后亞克隆于pTRKH2載體中。結果雙酶切及DNA測序結果證實成功構建乳酸菌表達載體pTR-bFGF。結論乳酸菌表達載體pTR-bFGF為實現(xiàn)bFGF在乳酸菌表達及口服治療炎癥性腸病奠定了基礎。

乳酸菌；重組人堿性成纖維生長因子；炎癥性腸病

【Abstract】Objective To explore a new way for the oral treatment of inflammatory bowel disease by constructing the recombinant human basic fibroblast protein expression vector.Methods The Ptuf promoter, pePN terminator,USP45 and bFGF were spliced by fusion PCR technology.The full-length constructed cDNA fragment was cloned into pBlueScript vector,as well as the pTRKH2 vector after identification.Results DNA sequencing and double enzyme digestion results showed that the expression vector pTR-bFGF was successfully constructed.Conclusion The pTR-bFGF plasmid laid a foundation for expression of bFGF in lactobacillus and oral treatment of inflammatory bowel disease.

【Key words】Lactic bacteria;bFGF;Inflammatory bowel disease

炎癥性腸病的病因尚未明確，其機制之一是受損黏膜屏障功能缺陷，從而引起局部的炎癥反應，因此通過修復腸道黏膜屏障可有效減輕炎癥反應。堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）是分子量約18 kD的單鏈多肽，由146個氨基酸組成，是成纖維生長因子家族成員[1]。bFGF可以促進細胞增殖、遷移，提高趨化活性[2]。乳酸菌作為食品級安全細菌，被廣泛用于多肽表達和疫苗研究。本研究通過構建乳酸菌bFGF表達載體，旨在為口服治療炎癥性腸病提供一種新途徑奠定基礎。

材料和方法

一、材料

1.菌株、質粒

大腸桿菌DH5α（購自Takara公司），乳酸球菌IL1403、pbluescript、pMD-bFGF質粒由本實驗室自存，pTRKH2質粒（美國Klaenhammer TR教授惠贈）。

2.主要試劑

2×Taq mix及Super mix（Genestar）、DL5000和2000 Maker（Takara公司）；限制性內切酶（Thermo Fisher），T4 DNA ligse（NEB），質粒提取試劑盒及PCR凝膠回收試驗盒（Axygen）?；蚪M提取試劑盒（天根），氨芐抗生素及紅霉素（Biosharp），在大腸桿菌濃度為100 μg/mL及250 μg/mL。

二、方法

1.乳酸菌IL1403基因組DNA提取

根據天根基因組提取試劑盒說明的方法提取乳酸菌IL1403基因組，具體操作如下：收集2 mL OD600=0.5的乳酸菌沉淀，加入250 μL（20 mg/ mL）溶菌酶37℃30 min，然后按試劑盒加入相應試劑并轉移至吸附柱中，過濾后加入適量純水洗脫，-20℃保存。

2.引物及目的基因的PCR擴增

根據PubMed發(fā)表的IL1403基因組中tuf啟動子序列[3]，利用Primer 5.0軟件設計引物。引物委托廣州生工公司合成，相關引物見表1。由于信號肽USP45及終止子pEPN較短，通過長鏈引物PCR連接至bFGF上，再用bFGF-F/bFGF-R引物擴增。PCR反應體系如下：2×super mix 25 μL，模板1 μL，引物各2.5 μL，補水至50 μL。反應條件如下：98℃預變性30 s，98℃變性10 s，55℃30 s，72℃30s，共33個循環(huán)；72℃延伸5 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。膠回收純化目的片段。

3.融合PCR構建ptuf-bFGF-pepn全長

根據參考文獻[4]，進行融合PCR反應。具體操作如下：測定擴增片段濃度，在PCR反應體系中加入等摩爾融合片段，兩目的片段總量大于800 ng/μL，進行各片段互補延伸。反應體系：98℃變性10 s，60℃30 s，72℃1 min，共12個循環(huán)。然后取上述反應液5 μL，引物tuf-F/tuf-R各2.5 μL，2×premix HS 25 μL，用水補足至50 μL。反應體系：98℃5 min，98℃10 s，55℃30 s，72℃1 min，72℃5 min，共35個循環(huán)。凝膠電泳，膠回收片段后克隆至pbluescript載體上。

表1　融合PCR引物

4.構建pTR-bFGF乳酸菌表達載體

將已驗證的pblue-tuf-bFGF-pePN載體及TRKH2載體分別加入XbaⅠ和BamHⅠ37℃雙酶切1 h，切膠回收，加入T4連接酶，16℃反應4 h。轉化DH5a感受態(tài)細胞，加入10 μL連接產物，冰上放置30 min，42℃熱休克45 s，冰上2 min，加入1 mL SOC，37℃搖床220 r/min 50 min，吸取100 μL菌液用均勻涂于250 μg/mL紅霉素LB平板上，37℃倒置過夜培養(yǎng)。挑取陽性單菌落，進行搖菌、提質粒，雙酶切鑒定，并由廣州艾基生物公司測序。

結果

一、全長片段融合及鑒定

通過融合PCR反應，將Ptuf啟動子、USP45信號肽、bFGF基因及pePN終止子片段拼接，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，產物約826 bp，與預期一致（圖1）。將融合片段克隆至pbluescript載體上，XbaⅠ/ BamHⅠ雙酶切鑒定，目的片段與預期相符（圖2）。其載體經廣州艾基生物公司測序與原序列一致。

二、乳酸菌表達載體pTR-bFGF酶切鑒定

將TRKH2和pblue-bFGF載體進行XbaⅠ/ BamHⅠ雙酶切，回收目的片段后，連接，轉化，挑取陽性克隆進行PCR驗證（圖3）和雙酶切鑒定驗證（圖4）。

圖1　全長融合片段電泳圖（M：DL5000marker，2、3為目的條帶）

圖2　 pblue-bFGF酶切鑒定圖（M：DL5000marker，1：pblue-bFGF酶切圖）

圖3　 pTR-bFGF菌落PCR驗證圖（M：DL2000marker，1、2、4為目的條帶）

圖4　 pTR-bFGF酶切鑒定圖（M：DL5000marker，1、3為酶切正確載體）

討論

炎癥性腸?。↖BD）藥物的研制一直是研究的熱點，常用的藥物有美沙拉嗪、糖皮質激素、免疫抑制劑等，生物制劑如英夫利昔單抗在臨床應用中也取得一定療效。上述藥物主要通過抑制免疫、炎癥因子如前列腺素、白三烯、TNF-α等，減輕炎癥反應，使疾病得到緩解。但潰瘍性結腸炎的發(fā)病機制之一是受損黏膜屏障功能缺陷，毒素和免疫原性物質的滲透可引起局部炎癥反應，使黏膜屏障受破壞，從而又加重有害物質的滲透，形成惡性循環(huán)。通過修復腸道黏膜屏障，減少有害抗原和細菌的吸收，可有效減輕炎癥反應。

人堿性成纖維生長因子作為FGF家族成員之一，其基因序列具有高度同源性，具有促進新生血管形成、趨化和促細胞遷移的作用，通過刺激細胞外基質及成纖維細胞合成，參與創(chuàng)傷修復過程中的細胞增殖[5-6]。近年來有研究表明，在DSS誘導的小鼠炎癥性腸病的模型中，重組人堿性成纖維細胞能有效促進腸黏膜上皮的愈合[7]。Paunovic等[8]在進一步研究中探索了bFGF治療潰瘍性結腸炎的分子機制，bFGF能有效下調TNF-α因子，促進潰瘍愈合。但bFGF在人體內含量極少，在體外容易降解。因此，采用大腸桿菌及病毒載體[9]高效表達bFGF，其大腸桿菌表達的重組牛bFGF蛋白被廣泛用于皮膚創(chuàng)傷、燒傷的修復治療[10-11]，但大腸桿菌蛋白純化工藝復雜，步驟多，成本較高，而病毒載體的應用面臨潛在的安全問題，其使用受到一定限制。

乳酸菌作為腸道益生菌，具有不產生內毒素，表達的蛋白可與菌體一起服用，無需純化，作為理想的基因工程治療載體被廣泛應用于表達多種蛋白和多肽[12]。Steidler等[13]采用同源替換的方法在乳酸菌表達IL-10能有效減輕炎癥性腸病的癥狀。pTRKH2載體為乳酸菌高拷貝載體，能在菌體內大量拷貝，通過Ptuf強啟動子能進一步提高bFGF的表達量。利用乳酸菌分泌bFGF蛋白，通過口服形式給藥，修復受損腸黏膜上皮，為后續(xù)的細胞實驗和動物實驗奠定了基礎，同時為炎癥性腸病的治療提供一種新的途徑。

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（本文編輯：王新穎）

Construction and identification of recombinant human basic fibroblast growth factor expression vector for lactic acid bacteria

JIANG Yong-hong,CHEN Ke-quan,CHEN Xue-qing.

Department of Gastroenterology,First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510120,Guangdong,China

10.3969/j.issn.1672-2159.2016.02.011

510120廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院消化內科

陳學清，E-mail：chenxq@vip.163.com

2016-01-27）