陳杏梅　趙詠梅

乙型肝炎患者HBV-DNA、HBeAg與Pre-S1Ag的相關(guān)性分析

陳杏梅趙詠梅

目的探析乙型肝炎患者HBV-DNA、HBeAg與Pre-S1Ag的相關(guān)性。方法對(duì)700名乙肝患者的靜脈血液樣本采用熒光定量PCR法（FQ-PCR）檢測(cè)HBV-DNA，用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)HBV血清標(biāo)志物和前S1抗原（Pre-S1Ag）。結(jié)果在700例乙型肝炎患者中，HBV-DNA總檢出率為62.6%；HBV-DNA陽性者，Pre-S1Ag顯著高于HBV-DNA陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05）。HBV-DNA陽性者，HBeAg檢出率顯著高于HBV-DNA陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中共有285名HBeAg陽性的患者，有80.7%的患者出現(xiàn)Pre-S1Ag陽性，這一比例比HBeAg陰性組高（P<0.05）。結(jié)論HBV-DNA陽性和Pre-S1Ag具有較大的關(guān)聯(lián)性，在靈敏程度上，Pre-S1Ag更能反映乙肝病毒的復(fù)制狀況，通過該指標(biāo)可以看出HBV傳染性的有無。

乙型肝炎病毒；前S1抗原；HBV-DNA；PCR

【Abstract】Objective To investigate the relationship among HBV-DNA,HBeAg and Pre-S1Ag in patients with hepatitis B.Methods Venous blood samples from 700 patients with hepatitis B were tested by fluorescence quantitative PCR method for detection of HBV-DNA(FQ-PCR).The HBV serum marker and Pre-S1 antigen(Pre-S1Ag)were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results The detection rate of HBV-DNA was 62.6%in 700 patients with hepatitis B;Pre-S1Ag of HBV-DNA positive patients was significantly higher than that of HBV-DNA negative patients(P<0.05).In HBV-DNA positive patients, the detection rate of HBeAg was significantly higher than that of HBV-DNA negative patients(P<0.05). There were 285 HBeAg positive patients,80.7%of patients showed Pre-S1Ag positive,which was significantly higher than that in HBeAg negative group(P<0.05).Conclusion The positive rate of Pre-S1Ag was highly correlated with the positive rate of HBV-DNA.Compared with HBeAg,Pre-S1Ag could more sensitively reflect the replication of hepatitis B virus.

【Key words】Hepatitis B virus;Pre-S1 antigen;HBV-DNA;PCR

我國作為攜帶乙型肝炎病毒高流行區(qū)，感染人數(shù)占全世界50%，其中現(xiàn)癥乙型肝炎患者就有3 000多萬[1]。乙型肝炎的病程遷延，可發(fā)展為肝衰竭或肝硬化，甚至肝癌，對(duì)人類健康造成了嚴(yán)重的威脅，為此加強(qiáng)病毒檢測(cè)意義重大[2-3]。造成人類乙型肝炎的DNA病毒叫做乙型肝炎病毒，也是一種屬于肝病毒科的有外殼的DNA病毒。不完全雙鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)的DNA構(gòu)成了HBV基因組，該基因組中包含的核苷酸3 200個(gè)，病毒的傳染性可以通過HBV-DNA含量進(jìn)行判斷，通過該指標(biāo)可以確診乙肝傳染性[4-5]。乙型肝炎e抗原（HBeAg）的變化也能體現(xiàn)病毒的復(fù)制與傳染性，但是當(dāng)前很多病毒由于前C基因的變異而不出現(xiàn)HBeAg，這類患者體內(nèi)病毒實(shí)際處于復(fù)制狀態(tài)，為此容易出現(xiàn)延誤診斷的情況，使患者失去最佳治療時(shí)期[6-7]。乙肝病毒前S1抗原（Pre-S1Ag）作為HBV的包膜蛋白，與HBV病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、入胞以及分泌有關(guān)，可區(qū)別由于病毒變異和其他原因造成的HBeAg假陰性，可作為HBV-DNA、HBeAg檢測(cè)病毒復(fù)制的重要補(bǔ)充[8-9]。本文選取我院2年間的乙型肝炎患者700例，進(jìn)行HBV-DNA、HBeAg與Pre-S1Ag的檢測(cè)，旨在分析各指標(biāo)之間的相關(guān)性及臨床應(yīng)用價(jià)值。

一、研究對(duì)象

選取2010年2月至2013年2月本院門診和住院的700名乙肝患者為試驗(yàn)組，納入標(biāo)準(zhǔn)：慢性乙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染學(xué)會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)會(huì)共同制定的標(biāo)準(zhǔn)[2]；HBV表面抗原（HBsAg）均為陽性；如果乙肝患者同時(shí)還存在甲、戊、丙以及丁型肝炎病毒或出現(xiàn)酒精性肝炎者、免疫性肝炎的患者均不能作為研究對(duì)象。同期選擇在本院體檢中心進(jìn)行健康體檢者100名作為對(duì)照組，排除各型肝炎病毒感染，排除心肺疾病等，肝功能正常。經(jīng)過對(duì)比，兩組的性別、年齡、體重指數(shù)、居住地區(qū)、受教育年限等基線資料對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。本研究得到了兩組受檢者的知情同意并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

表1　兩組基線資料對(duì)比

二、標(biāo)本采集

選擇德國Roche公司的LightCycler熒光PCR檢測(cè)儀，試劑盒為深圳匹基生物工程股份有限公司生產(chǎn)；Dade Behring公司的BEP-Ⅲ型全自動(dòng)酶免分析儀；美國貝克曼（SPiNCHRONR）的低溫離心機(jī)；北京萬泰公司進(jìn)行ELiSA-HBeAg檢測(cè)，上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司進(jìn)行Pre-S1Ag檢測(cè)。

所有入選者均在空腹條件下抽取靜脈血5 mL，4 000 rpm，離心10 min，分離血清1～2 mL，在-70℃冰箱保存，3個(gè)月內(nèi)檢測(cè)。

三、檢測(cè)方法

檢測(cè)HBV-DNA的方式是RT-PCR，按說明書上的主要內(nèi)容進(jìn)行操作，以多區(qū)段巢式PCR作為HBV-DNA金標(biāo)準(zhǔn)。以HBV-DNA陽性（HBVDNA≥103copy/mL）作為病毒復(fù)制的標(biāo)志，以HBV-DNA＜103copy/mL為HBV-DNA陰性。

HBV血清標(biāo)志物檢測(cè)：采用ELISA法對(duì)HBV-HBV血清標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，判定為樣品OD值>陰性對(duì)照均值的2.1倍為陽性，所有具體操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，并同步做質(zhì)控。

Pre-S1Ag檢測(cè)：采用雙抗體夾心ELISA法進(jìn)行，酶標(biāo)板預(yù)包被抗PreS1單抗，陽性表示血清中PreS1陽性。

四、統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理選擇SPSS 14.00軟件，通過χ2檢驗(yàn)比較率，通過Kappa檢驗(yàn)一致性，通過t檢驗(yàn)對(duì)比計(jì)量數(shù)據(jù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、不同HBV血清標(biāo)志物模式下Pre-S1Ag檢出率比較

在試驗(yàn)組血清標(biāo)本中，HBV血清標(biāo)志物判定為Ⅰ組[HBsAg（+），HBeAg（+），抗-HBc（+），其余（-）] 318例，Ⅱ組[HBsAg（+），抗-HBe（+），抗-HBc（+），其余（-）]270例，Ⅲ組[HBsAg（+），抗-HBc（+），其余（-）]112例。通過分析，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組的Pre-S1Ag檢出率分別為94.0%、31.1和35.7%，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2　不同HBV血清標(biāo)志物模式下Pre-S1Ag檢出率比較[n（%）]

二、HBV-DNA定量結(jié)果判定

在試驗(yàn)組中，RT-PCR判定為HBV-DNA陽性438例，占比62.6%。HBV-DNA陽性的438例標(biāo)本中Pre-S1Ag陽性332例，占比75.8%；HBeAg陽性285例，占比65.1%；而對(duì)照組血清均未檢測(cè)到HBV-DNA和Pre-S1Ag，見表3。

三、HBV-DNA與Pre-S1Ag、HBeAg的關(guān)系

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中的HBV-DNA陽性患者中有438名，332名Pre-S1Ag陽性，75.8%的患者出現(xiàn)陽性，這一比例比HBV-DNA陰性組16.0%的概率高（P <0.05）。HBeAg陽性285例（65.1%），顯著高于HBV-DNA陰性組的HBeAg陽性率（31.7%）（P< 0.05）。

表3　試驗(yàn)組HBV-DNA與Pre-S1Ag、HBeAg的陽性例數(shù)（n）

四、HBeAg與Pre-S1Ag的關(guān)系

總共實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中有285名HBeAg陽性的患者，有80.7%的患者出現(xiàn)Pre-S1Ag的陽性，這一比例顯著高于HBeAg陰性組（P<0.05），見表4。

表4　 HBeAg陽性患者HBeAg與Pre-S1Ag檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

討論

乙型肝炎是一種嚴(yán)重的世界范圍的傳染病，世界大約有20億人曾經(jīng)感染過HBV，我國是慢性乙肝的高發(fā)區(qū)[10]。無論確診或是治療乙型肝炎都要對(duì)病毒復(fù)制情況大體掌握，現(xiàn)在HBV-DNA，Pre-S1Ag以及HBeAg都能將病毒復(fù)制情況表現(xiàn)出來，臨床上需要不斷檢測(cè)上述標(biāo)準(zhǔn)，能夠?qū)Φ挚共《镜男ЧM(jìn)行預(yù)估，在最短時(shí)間內(nèi)找到抗藥基因突變的狀況等[11]。

現(xiàn)在乙肝病毒的血清學(xué)標(biāo)志物成為對(duì)乙型肝炎進(jìn)行確認(rèn)的重要標(biāo)志，然而人體反映出的HBV的免疫狀態(tài)是對(duì)乙肝病毒檢測(cè)時(shí)唯一能夠得到的信息，患者身體中HBV復(fù)制狀況卻不能如實(shí)反映，患者的傳染性不能通過乙肝病毒的血清學(xué)標(biāo)志物直接判斷[12]。雖然傳統(tǒng)乙型肝炎五項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)為診治乙型肝炎起到了非常重要的作用，但隨著抗病毒藥物的廣泛應(yīng)用，病毒的變異株越來越多，加上當(dāng)前臨床對(duì)乙型肝炎診斷的要求越來越高，這種傳統(tǒng)的乙型肝炎血清學(xué)檢測(cè)手段逐漸暴露出一些缺陷，對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制、傳染性、預(yù)后及療效判斷等諸方面的準(zhǔn)確性、敏感性、可重復(fù)性都存在不足[13]。

乙型肝炎病毒HBV外殼大蛋白的組成包括三種，分別是前S2抗原、乙型肝炎病毒前S1抗原以及HBsAg，其中前S1抗原第21-47位氨基酸為肝細(xì)胞膜的受體，HBV可以通過此受體黏附在肝細(xì)胞膜上，進(jìn)入肝細(xì)胞，在病毒感染、裝配、復(fù)制等多方面起到重要作用[14]。而HBV-DNA定量可用于觀察HBV抗病毒治療的效果、傳染性的強(qiáng)弱，已成為乙型肝炎病毒復(fù)制的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究選取HBsAg陽性的血清進(jìn)行檢測(cè)，分析常用HBV血清標(biāo)志物與Pre-S1Ag之間的關(guān)系，在700例乙型肝炎患者中，HBV-DNA陽性占62.6%。HBV-DNA陽性標(biāo)本中Pre-S1Ag陽性率為75.8%，HBeAg陽性率65.1%，可見Pre-S1Ag較HBeAg能更靈敏的反映乙肝病毒的復(fù)制情況。在正常對(duì)照組的100名人群中，沒有將HBV Pre-S1Ag檢測(cè)出來，也就能夠證明HB-sAg陽性血清是HBV Pre-S1Ag唯一所在之處。

臨床對(duì)病毒是否進(jìn)行復(fù)制的判斷是根據(jù)例如HBsAg和HBeAg的乙型肝炎血清標(biāo)志物[15]。最近幾年，因?yàn)樵谂R床上通常使用核苷類似物以及疫苗進(jìn)行治療，而長(zhǎng)期的使用改變了某些病毒基因組C區(qū)啟動(dòng)子以及前C區(qū)，所以很難形成HBeAg以及出現(xiàn)分泌。119個(gè)氨基酸殘基共同構(gòu)成Pre-S1Ag，Dane顆粒以及乙肝病毒外殼外部是氨基酸殘基的主要分布區(qū)域。Pre-S1Ag作為新的乙肝血清標(biāo)志物已顯現(xiàn)出較高的臨床價(jià)值，但Pre-S1Ag陰性并不能排除HBV感染[16]。本文對(duì)700份HBsAg陽性的血清檢測(cè)其Pre-S1Ag存在情況，結(jié)果表明Pre-S1Ag在HBeAg陽性標(biāo)本中的檢出率為80.7%，顯著高于HBeAg陰性標(biāo)本的檢出率（66.7%）（P< 0.05），提示Pre-S1Ag與HBeAg存在高度相關(guān)性；HBeAg是H BV核心的內(nèi)部組成成分，是判斷病毒是否復(fù)制并是否具有傳染性的血清學(xué)指標(biāo)，因此血清中檢出Pre-S1Ag同樣可以作為HBV復(fù)制的一個(gè)重要依據(jù)。同時(shí)本研究中發(fā)現(xiàn)在HBeAg陰性血清中檢測(cè)出了Pre-S1Ag，提示HBeAg陰性的病例，仍存在病毒的復(fù)制可能，提示在臨床上對(duì)于HBeAg陰性的乙型肝炎患者同時(shí)檢測(cè)Pre-S1Ag，可有助于判斷病毒復(fù)制狀況。同時(shí)表明病毒基因的變異，使HBeAg已不能夠完全反映HBV的復(fù)制[9,11]。

總之，在乙型肝炎患者中，Pre-S1Ag與HBVDNA陽性高度相關(guān)，Pre-S1Ag能夠較HBeAg能更靈敏的將復(fù)制乙肝病毒的狀況都表現(xiàn)出來，通過該指標(biāo)可以對(duì)HBV的傳染狀況進(jìn)行檢測(cè)。

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（本文編輯：姚永莉）

Correlation analysis of HBV-DNA,HBeAg and Pre-S1Ag in patients with hepatitis B

CHEN Xing-mei, ZHAO Yong-mei.
Department of internal medicine,Huanggang Central Hospital,Hubei Province 438000

10.3969/j.issn.1672-2159.2016.02.009

438000湖北省黃岡市中心醫(yī)院消化內(nèi)科

資料與方法

2015-10-19）