陳佳佳　萬　磊　劉建軍　闞和平

原發(fā)性肝癌患者T淋巴細胞亞群變化及其與CTCs、TTV及HBV-DNA的關(guān)系

陳佳佳萬磊劉建軍闞和平

目的探討原發(fā)性肝癌（HCC）患者T細胞免疫功能變化及其與外周血循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）、腫瘤總體積（TTV）及乙肝病毒（HBV-DNA）定量的關(guān)系。方法收集45例HCC患者外周血，45例正常成年人外周血作為對照組。用流式細胞學(xué)技術(shù)測定CD3+T細胞、CD4+T細胞及CD4+/CD8+比值；采用益善生物技術(shù)公司的“免疫去除結(jié)合納米過濾法”CanPatrolTM行CTCs檢測。收集患者腫瘤最大直徑及乙肝病毒定量（HBV-DNA）等臨床病理參數(shù)。將HCC組患者依據(jù)CD4+/CD8+平均值分成高、低兩組，比較兩組之間CTCs、TTV、HBV-DNA定量的差別。結(jié)果HCC組CD3+T細胞、CD4+T細胞及CD4+/ CD8+明顯低于對照組（P＜0.05），CD8+T細胞值明顯高于正常組（P＜0.05）。高CD4+/CD8+組CTCs總數(shù)及間質(zhì)型CTCs明顯低于低CD4+/CD8+組（P＜0.05），而兩組上皮型CTCs及混合型CTCs無明顯差異（P＞0.05）。CD4+/CD8+比值與TTV呈正相關(guān)（P＜0.05），與CD8+T細胞百分比呈負相關(guān)（P＜0.05）。不同HBV-DNA組之間，CD4+/CD8+沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論HCC患者T細胞免疫功能明顯降低。T細胞免疫功能與CTCs、TTV與有著密切關(guān)系：T細胞免疫功能越差，外周血中CTCs越多、TTV越大。

原發(fā)性肝癌；T淋巴細胞；循環(huán)腫瘤細胞；腫瘤總體積；乙型肝炎病毒

【Abstract】Objective To investigate the changes of T cell immune function in patients with hepatocellular carcinoma（HCC）and its relationship with circulating tumor cells(CTCs),total tumor volume(TTV)and hepatitis B virus(HBV-DNA).Methods Peripheral blood of 45 patients with HCC was collected，and peripheral blood of 45 normal adults was taken as control.CD3+T cells,CD4+T cells and CD4+/CD8+ratio were determined by flow cytometry.CTCs in the blood were detected by CanPatrolTM.The maximum diameter of tumor,quantitative hepatitis B virus(HBV-DNA)and other clinical pathological parameters were collected.The HCC patients were divided into high level group and low level group according to the rate of CD4+/CD8+, CTCs,TTV and HBV-DNA level.Results Compared with the healthy control,the percentage of CD3+T cells, CD4+T cells and the rate of CD4+/CD8+in HCC patients were significantly decreased(P<0.05);CD8+T cells were significantly higher than the normal group(P<0.05).The total CTCs and mesenchymal CTCs in high CD4+/CD8+group were significantly less than in the low CD4+/CD8+group,but there was no significant difference between the two groups of epithelial type CTCs and mixed CTCs(P>0.05).The CD4+/CD8+ratio was positively correlated with TTV(P<0.05),and negatively correlated with the percentage of CD8+T cells(P< 0.05).Between different HBV-DNA groups,no statistically significant differences were found between the ratio of CD4+/CD8+(P>0.05).Conclusions The immune function of T cells in patients with HCC was disordered,and the immune function of T cells was significantly decreased.The immune function of T cell had a close relationship with CTCs and TTV in patients with HCC.

【Key words】Primary hepatocellular carcinoma;T lymphatic cell;CTCs;TTV;HBV-DNA

原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）發(fā)病率占全球腫瘤發(fā)病率的第六位，死亡率占全球腫瘤相關(guān)死因的第三位。研究證實機體免疫功能狀態(tài)對HCC的療效及預(yù)后有重大意義[1]，而細胞免疫尤其是T細胞免疫是機體免疫重要的組成部分，腫瘤發(fā)生后主要通過T細胞亞群對腫瘤細胞進行免疫殺滅。本研究測定HCC患者外周血T淋巴細胞亞群改變及外周血中循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells,CTCs），以探討HCC患者T細胞免疫功能狀況及其與CTCs、腫瘤總體積（total tumor volume, TTV）、乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量的關(guān)系。

資料與方法

一、般資料

收集南方醫(yī)院肝膽外科2014年10月至2015年6月經(jīng)術(shù)后病理證實為HCC患者45例作為實驗組。入選標準：①HBsAg陽性；②肝功能Child-Pugh分級為A級或B級；③術(shù)前未行射頻消融、介入、化學(xué)藥物治療和放射治療。其中男性患者30例，女性患者15例，年齡33～67歲，中位年齡50歲；對照組為同時間段南方醫(yī)院健康體檢中心健康成年人45例，其中男性29例，女性16例，年齡24～55歲，中位年齡為42歲。

二、方法

1．樣本采集和處理

對入選的患者，用EDTA抗凝采血管及普通肝素抗凝管抽取靜脈血10 mL進行CTCs及T細胞亞群檢測，血液標本均于抽血當日處理。

2．CTCs檢測

本研究采用廣州益善公司開發(fā)的CanPatrolTM法檢測外周血中CTCs。首先裂解外周血中的紅細胞，通過納米技術(shù)利用CTCs與白細胞大小差異進行CTCs的分離與富集，然后通過多重mRNA原位分析方法對富集的CTCs進行特異性的基因核酸定位確定腫瘤細胞，最后通過多重RAN探針，分別針對多種CTCs的特異性基因，通過不同顏色的熒光信號，將外周血中的CTCs進行分型[2]。

3．T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+檢測

向TrueCount試管內(nèi)分別加入標記抗體10 μL及經(jīng)抗凝后的外周血50 μL，輕微震蕩試管以混勻，室溫避光孵育15 min；向試管內(nèi)加入溶血素250 μL，搖勻，室溫避光孵育15 min，至溶血完全為止；1 000 rpm離心5 min，棄上清，加入1 mL鞘液，充分混勻，離心5 min，棄上清，洗滌至溶液清亮為止，加入鞘液500 μL，混勻，上流式細胞儀檢測。采集白細胞共同抗原（CD45）陽性細胞計5 000個淋巴細胞，雙參數(shù)分析淋巴細胞表面標記計算出CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞表達百分比及CD4+/ CD8+比值。試劑均來自Beckman Coulter公司，流式細胞儀為BD caliber流式細胞儀，實驗步驟及流式細胞儀檢測步驟均嚴格按照說明書進行。

4．計算TTV、CD4+/CD8+比值

根據(jù)影像學(xué)數(shù)據(jù)評估腫瘤負荷，腫瘤體積（cm3）=4/3×3.14×r3（r=可測量腫瘤結(jié)節(jié)的最大半徑）。腫瘤總體積等于各可測量病灶體積總和。CD4+/ CD8+比值為外周血CD4+T細胞數(shù)/CD8+T細胞數(shù)，CD4＋/CD8+平均值為1.36，≥1.36的為高CD4+/CD8+組，≤1.36的為低CD4+/CD8+組。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。結(jié)果均以x±s形式表示，兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman方法分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、T細胞亞群檢測結(jié)果

圖1右上象限分別為CD4+T細胞和CD8+T細胞的檢測情況。本研究結(jié)果顯示HCC組患者T細胞亞群CD3+T細胞、CD4+T細胞百分比及CD4+/ CD8+比值明顯低于正常對照組（P<0.05）；而CD8+T細胞百分比較對照組明顯增高（P<0.05），見表1。

圖1　 HCC患者外周血CD4+和CD8+T細胞檢測圖

表1　兩組T細胞亞群檢測結(jié)果比較（±s）

表1　兩組T細胞亞群檢測結(jié)果比較（±s）

組別nCD3+（%）CD4+（%）CD8+（%）CD4+/CD8+HCC組4563.56±9.0528.05±6.2131.05±7.090.97±0.35對照組4571.82±4.7842.95±9.5825.45±4.171.74±0.42 t值--2.45-4.762.11-5.98 P值-0.015＜0.0010.035＜0.001

二、外周血CTCs檢測結(jié)果

CTCs因表面免疫表型不同，在外周血中存在上皮型、間質(zhì)型、混合型三種不同類型，CanPatrolTM法檢方法根據(jù)不同RNA探針陽性結(jié)果及免疫熒光鏡下顏色對HCC患者外周血循環(huán)腫瘤細胞類型進行鑒別。其中上皮型為CD45探針陰性，EpCAM和CK8、9及19探針陽性，熒光鏡下為紅色熒光信號；間質(zhì)型為CD45探針陰性，vimentin探針及twist探針陽性，熒光鏡下為綠色熒光信號；而混合型則在熒光鏡下顯示紅色及綠光信號（圖2）。

圖2　熒光顯微鏡下循環(huán)腫瘤細胞的類型

三、CD4+/CD8+比值與外周血中CTCs的關(guān)系

研究結(jié)果顯示高CD4+/CD8+組，間質(zhì)型CTCs及CTCs總數(shù)較低CD4+/CD8+組明顯減少，兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而外周血中上皮型CTCs數(shù)及混合型CTCs數(shù)在兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

四、CD4+/CD8+與TTV及HBV-DNA水平的關(guān)系

CD4+/CD8+與TTV相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CD4+/CD8+比值與TTV呈正相關(guān)（r=0.704，P=0.001）。根據(jù)HBV-DNA水平分為兩組，HBV-DNA>1 000 copies/mL為高HBV-DNA組，其CD4+/CD8+為1.26±0.28；HBV-DNA<1 000 copies/mL為低HBV-DNA組，其CD4+/CD8+為1.59±0.39，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表2　高CD4+/CD8+組和低CD4+/CD8+組外周血CTCs比較（±s，）

表2　高CD4+/CD8+組和低CD4+/CD8+組外周血CTCs比較（±s，）

組別n上皮型數(shù)（個）間質(zhì)型數(shù)（個）混合型數(shù)（個）CTCs總數(shù)（個）高CD4+／CD8+組201.86±0.69（n=10）1.14±1.16（n=11）4.00±1.41（n=12）7.00±3.06（n=14）低CD4+／CD8+組253.36±1.83（n=13）9.75±3.65（n=12）14.25±4.86（n=15）27.62±9.74（n=18）t值--1.68-2.52-1.77-3.32 P值-0.1440.0190.0820.002

討論

機體的免疫功能狀態(tài)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，正常情況下機體可通過免疫監(jiān)控將體內(nèi)出現(xiàn)的變異細胞及發(fā)生癌變的細胞予以清除，從而防止腫瘤發(fā)生。當機體免疫功能低下時，變異及惡變的細胞可以憑借多種方式逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控而呈無限制生長進而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。在機體抵抗腫瘤的免疫中，細胞免疫尤其是T細胞免疫發(fā)揮著關(guān)鍵作用。目前有研究證實，HCC的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與機體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，HCC細胞壞死可誘導(dǎo)特異的T細胞免疫反應(yīng)[3]。有研究認為，CD3+、CD4+T細胞水平與HCC患者的總生存期呈正相關(guān)[4]。CD3抗原分布于所有成熟T淋巴細胞表面，故CD3+T細胞數(shù)可代表T淋巴細胞總數(shù)。CD4+T細胞為輔助性T細胞，其主要功能是分泌細胞因子調(diào)節(jié)機體抗腫瘤反應(yīng)，CD8+T細胞為抑制性T細胞，亦是體內(nèi)主要的細胞毒性效應(yīng)T細胞[5]。正常情況下機體通過調(diào)節(jié)可使外周血中CD4+/CD8+比值處于相對平衡狀態(tài)，維持機體的正常免疫功能。因此臨床上可通過測定外周血CD3+T細胞、CD4+、CD8+T細胞、CD4+/ CD8+比值來評估患者免疫功能狀態(tài)。有研究證實，HCC患者存在T淋巴細胞亞群比例及CD4+/CD8+比值失衡[6]。本研究結(jié)果顯示：HCC患者外周血CD3+T細胞、CD4+T細胞及CD4+/CD8+比值明顯低于正常人，而CD8+T細胞則明顯高于正常人，顯示HCC患者免疫功能明顯低下，患者細胞免疫處于失衡狀態(tài)，針對腫瘤細胞的細胞免疫功能明顯受到抑制。其機制可能與HCC在發(fā)生、發(fā)展過程中產(chǎn)生大量的免疫抑制因子有關(guān)，免疫抑制因子一方面可能通過干擾效應(yīng)T淋巴細胞發(fā)揮作用，使外周血CD3+、CD4+細胞含量降低，CD8+細胞含量升高，導(dǎo)致T淋巴細胞免疫功能受損[7]；另一方面免疫抑制因子可廣泛抑制殺傷T淋巴細胞的活性，同時在腫瘤抗原的刺激下，T淋巴細胞免疫抑制細胞前體被激活，大量分泌免疫抑制因子，導(dǎo)致惡性循環(huán)，從而嚴重抑制機體的細胞免疫功能[8]。另外本研究顯示CD4+T淋巴細胞較正常人明顯減少，而CD4+T淋巴細胞在免疫系統(tǒng)中起中心調(diào)節(jié)作用，外周血CD4+T淋巴細胞表達減少，其產(chǎn)生的細胞因子亦減少，從而削弱了宿主對腫瘤生長的監(jiān)視、殺傷和清除功能[9]。

CTCs是自發(fā)或因診療操作由實體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞[10]。正常情況下腫瘤細胞進入外周血后被機體的免疫系統(tǒng)識別并予以清除，但當機體免疫功能低下時，將導(dǎo)致進入循環(huán)系統(tǒng)的一部分腫瘤細胞得以存活，因而成為腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞庫。隨著CTCs檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和改進，通過檢測腫瘤患者循環(huán)系統(tǒng)CTCs以評估患者預(yù)后的策略越來越受到關(guān)注。有研究表明，CTCs與某些實性腫瘤（如乳腺癌、胃癌等）的術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)聯(lián)[11]。CTCs存在不同形態(tài)和型別，其中間質(zhì)型CTCs比上皮型、混合型CTCs具有更強的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，外周血中檢測出間質(zhì)型CTCs的患者，腫瘤發(fā)生惡化、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險較其他兩型明顯增高[12]。但是，CTCs的類型和數(shù)目是否與機體的免疫功能有關(guān)，目前無文獻報道。本研究顯示：高CD4+/CD8+比值組間質(zhì)型CTCs及CTCs總數(shù)明顯低于低CD4+/CD8+比值組。這一方面可能與CD4+T淋巴細胞減少導(dǎo)致IL-2、IFN-γ減少，血清中TNF-α和SIL-2R水平異常增高，從而導(dǎo)致NK細胞及部分抗原提呈細胞活性較低；而抑制性CD8+T淋巴細胞增多，則削弱機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)及殺傷效應(yīng)，從而對進入外周血的CTC細胞識別能力及殺傷清除能力明顯下降有關(guān)。

TTV是近幾年新提出來的描述腫瘤負荷的指標，TTV的大小與HCC的預(yù)后有關(guān)。比起單純用腫瘤數(shù)目及單個腫瘤大小來描述肝移植患者腫瘤負荷的Milan標準，TTV對于腫瘤負荷的衡量更準確[13]。本研究表明TTV與T細胞免疫功能呈負相關(guān)，TTV大的患者T細胞免疫功能也低。

有文獻報道，不同臨床類型的慢性HBV感染者均存在不同程度的細胞免疫功能低下及免疫調(diào)節(jié)紊亂，紊亂的程度與病情的進展有關(guān)，T細胞亞群的細胞數(shù)量與功能同HBV復(fù)制關(guān)系密切[14]。但本研究檢測HBV-DNA水平與CD4+/CD8+比值無明顯相關(guān)性，可能與本研究入選病例較少有關(guān)，其內(nèi)在聯(lián)系需進一步探討。

總之，HCC患者T細胞免疫功能出現(xiàn)紊亂，T細胞免疫能力明顯降低，HCC患者外周血中CTCs數(shù)量及類型與機體免疫功能狀態(tài)有密切關(guān)聯(lián)，機體免疫功能差的患者其外周血中CTCs總數(shù)及惡性程度高的間質(zhì)型CTCs數(shù)量明顯高于免疫功能較好的患者，腫瘤總體積大小與T細胞免疫密切相關(guān)。改善、提高HCC患者免疫功能，有利于消滅、減少外周血中CTCs，從而改善HCC患者預(yù)后。

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（本文編輯：李明松）

Changes of T lymphocyte subsets and its relationship with CTCs,TTV and HBV-DNA in patients with primary hepatocellular carcinoma

CHEN Jia-jia,WAN Lei,LIU Jian-jun,KAN He-ping．
Department of Hepatobiliary Surgery,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China.Corresponding author:KAN He-ping,E-mail:khp5513@126.com

10.3969/j.issn.1672-2159.2016.02.005

510515南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院肝膽外科

闞和平，E-mail：khp5513@126.com

廣東省自然科學(xué)基金（S2012020010942）

2016-03-07）