潘存?zhèn)ァ×脂幑?/p>

胃癌發(fā)生過程中Survivin促血管生成作用的研究

潘存?zhèn)チ脂幑?/p>

目的探討胃癌發(fā)生過程中Survivin促進(jìn)血管生成的作用。方法用免疫組化方法檢測慢性非萎縮性胃炎、胃癌癌前病變、胃癌組織中Survivin的表達(dá)及MVD情況，分析Survivin的表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，分析Survivin的表達(dá)與MVD的關(guān)系。結(jié)果Survivin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)率為71.67%，顯著高于慢性非萎縮性胃炎的3.33%及胃癌前病變組織的30.00%，三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；Survivin蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度、胃癌局部浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)（P< 0.05）。Survivin表達(dá)陽性的胃癌組織及癌旁組織中MVD表達(dá)高于Survivin表達(dá)陰性的胃癌組織及癌旁組織（P<0.05）。結(jié)論Survivin的過度表達(dá)是胃癌發(fā)生過程中的早期事件，可能可以促進(jìn)胃癌血管形成。

胃癌；Survivin；微血管密度；癌前病變

【Abstract】Objective To explore the expression of Survivin and its relationship with tumor angiogenesis in gastric cancer.Method The expression level of Survivin and microvessel density(MVD)in chronic non-atrophic gastritis,precancerous and cancer tissues were detected by immunohistochemistry.The relationship between Survivin and clinicopathological parameters of gastric cancer and the relationship between Survivin and MVD were also analyzed.Results The expression level of Survivin in gastric cancer tissue was 71.67%which was significantly higher than that in chronic non-atrophic gastritis(3.33%)and precancerou tissue(30.00%)(P <0.05).The expression levels of survivin were correlated with degree of tumor differentiation,regional lymph node metastasis,TNM staging and serosal invasion(P<0.05).The MVD in Survivin-positive carcinoma and carcinoma-adjacent tissues were higher than those in Survivin-negative tissues(P<0.05).Conclusion The overexpression of Survivin is an early event in the development of gastric cancer and likely involved in the aniogenesis of gastric cancer.

【Key words】Gastric cancer;Survivin;Microvessel density;Precancerous lesions

腫瘤的生長、浸潤是腫瘤轉(zhuǎn)移的前提，腫瘤新生血管的形成是其中的重要原因，如果沒有血管生成，原發(fā)腫瘤的生長不會超過2 mm3。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員之一，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，在細(xì)胞周期的G2/M期特異性表達(dá)[1]，可以與細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3和caspase-7結(jié)合，抑制其激活從而抑制細(xì)胞凋亡[2]。近年來發(fā)現(xiàn)Survivin與血管形成有關(guān)[3]，隨著其表達(dá)量的增加，微血管密度（Microvessel density，MVD）可能呈上升的情況，但在胃癌中的相關(guān)研究較少。本研究通過檢測慢性非萎縮性胃炎、癌前病變、胃癌組織中Survivin的表達(dá)量及與微血管密度的關(guān)系，探討Survivin促血管生成在胃癌發(fā)生過程中的作用，為胃癌的治療尋找新的方向。

資料與方法

一、臨床資料

本研究選取我院2003年8月至2006年8月胃鏡活檢標(biāo)本和胃癌外科手術(shù)標(biāo)本存檔蠟塊，標(biāo)本均經(jīng)病理確診，所有患者均未接受放療、化療或其他腫瘤相關(guān)治療。胃癌60例，其中男34例，女26例；年齡31～85歲，平均（54±2.5）歲；根據(jù)病理組織學(xué)表現(xiàn)將胃癌分化程度分為兩組：①高、中分化組29例；②低、未分化組31例；TNM分期：Ⅰ-Ⅱ期36例，Ⅲ-Ⅳ期24例。胃癌癌前病變30例，男16例，女14例；平均為（58.8±3.4）歲；中-重度腸化生19例和異型增生11例。慢性非萎縮性胃炎30例，男15例，女15例；平均為（53.5±2.2）歲。

二、方法

1.試劑

Survivin兔抗人多克隆抗體購自美國Zymed公司。鼠抗人CD34單克隆抗體及SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

2.免疫組化SP染色法

用磷酸鹽緩沖洗液（PBS）代替一抗作陰性對照，用已知陽性胃癌切片作為陽性對照，采用兩步法進(jìn)行：蠟塊常規(guī)切片，脫蠟至水，將組織切片放置入高壓鍋內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，再將切片放入3%H2O210～15 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗后，加一抗放入適量水以免干燥，套上薄膜25℃室溫1～2 h。PBS洗3次后，加二抗，蓋上蓋子孵化30 min，孵化后揭開蓋子，PBS洗3～4次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，進(jìn)行相應(yīng)處理后封片，光鏡下進(jìn)行觀察。

3.結(jié)果判定

免疫組化染色陽性反應(yīng)為黃-棕色顆粒，且明顯高于背景染色。采用兩人雙盲法觀察切片，由兩位高年資病理科醫(yī)師分別對免疫組化結(jié)果進(jìn)行判斷。在10×40倍光鏡下觀察10個陽性細(xì)胞較多的視野，計算其平均數(shù)，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，共計1 000個細(xì)胞。根據(jù)參考文獻(xiàn)[4-5]，Survivin陽性標(biāo)準(zhǔn)為著色位于細(xì)胞質(zhì)（多見于胞漿），細(xì)胞質(zhì)染成淡黃色至黃棕色為陽性細(xì)胞。計算染色陽性細(xì)胞占觀察細(xì)胞的百分比，陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞數(shù)<30%為（＋），31%～51%為（＋＋），>50%為（＋＋＋）。

4．CD34檢測及MVD計數(shù)

參照Weidner等[6]報道的方法進(jìn)行，CD34陽性以血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕色或棕黃色。首先是在低倍鏡下全面觀察切片，確定腫瘤內(nèi)血管密度最高部位，然后再于高倍鏡下觀察，與周圍組織成分明顯區(qū)別的內(nèi)皮細(xì)胞或者細(xì)胞叢作為1個血管計數(shù)，記錄5個視野內(nèi)的微血管數(shù)，取平均值為該例的MVD值，鏡下呈棕黃色或棕褐色的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞叢為1個微血管，只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)也作為1個血管計數(shù)，而厚壁血管或管徑大于50 μm的血管不計數(shù)。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，各組間Survivin表達(dá)的差異，胃癌組織中Survivin的表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗分析，各組MVD比較使用方差檢驗或t檢驗分析，P< 0.05為差異有顯著性。

結(jié)果

一、Survivin在各組胃黏膜病變中的表達(dá)

Survivin在30例慢性非萎縮性胃炎中1例表達(dá)，陽性率為3.33%；30例胃癌前病變中9例表達(dá)，陽性率為30.00%；60例胃癌組織中43例表達(dá)，陽性率為71.67%。Survivin在慢性非萎縮性胃炎、胃癌前病變、胃癌組織中的陽性率均逐漸上升，三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=41.126，P=0.000），兩兩對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

圖1　 Survivin在各組胃黏膜病變中的表達(dá)

二、Survivin在胃癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Survivin蛋白在胃癌低、未分化組的表達(dá)率為87.1%（27/31），顯著高于高中分化組的55.17%（16/ 29）（P<0.05）；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率為92.59%（25/27），顯著高于無轉(zhuǎn)移組的54.55%（18/33）（P<0.05）；在TNM分期Ⅲ+Ⅳ期陽性表達(dá)率95.83%（23/24），顯著高于Ⅰ+Ⅱ期55.55%（20/36）（P<0.05）；浸潤累及漿膜層組陽性表達(dá)率為85%（34/40），顯著高于未累及組的45%（9/20）（P< 0.05）；Survivin蛋白表達(dá)陽性率與腫瘤大小無關(guān)。見表1。

表1　 Survivin在胃癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

三、MVD及與Survivin關(guān)系

癌組織中MVD為31.10±12.27，癌旁組織中為15.97±5.44，正常組織中為9.91±1.92，三者兩兩比較有統(tǒng)計學(xué)差異（F=62.04，P=0.000）；Survivin表達(dá)陽性的胃癌組織MVD為43.42±11.30，顯著高于Survivin表達(dá)陰性胃癌組織的13.42± 1.14（t=10.87，P=0.000）；Survivin表達(dá)陽性的胃癌癌前病變組織MVD為18.61±7.40，顯著高于Survivin表達(dá)陰性胃癌癌前病變組織的8.7±2.23（t= 5.677，P=0.000）。

討論

Survivn是凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis protein,IAP）家族的成員之一，主要表達(dá)于胚胎和發(fā)育的胎兒組織，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡，是目前已知分子量最小的凋亡抑制因子，但也是抑制凋亡作用最強(qiáng)的因子[7]。研究表明，Survivin在大多數(shù)腫瘤中都可見表達(dá)[8-9]。鄭超球等[10]發(fā)現(xiàn)Survivin在大腸腺瘤和腺癌中過度表達(dá)，提示Survivin過度表達(dá)是大腸上皮癌變過程的早期事件，可作為大腸癌發(fā)生早期階段的分子標(biāo)記物。胃癌同樣也是一個多步驟的癌變過程：正常胃黏膜-慢性淺表性胃炎-萎縮性胃炎-中到重度腸化生或異型增生－胃癌，我們的研究結(jié)果表明Survivin在慢性非萎縮性胃炎中幾乎無表達(dá)，而在胃癌及胃癌癌前病變中均為高表達(dá)，且胃癌中的表達(dá)顯著高于胃癌癌前病變組織（P< 0.05）。這一結(jié)果也揭示了Survivin過度表達(dá)是胃黏膜上皮細(xì)胞惡性變的一個早期事件，當(dāng)Survivin的表達(dá)升高時提示胃癌的發(fā)生。這與Da等[11]的結(jié)果一致。我們進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，Survivin與胃癌的臨床病理參數(shù)也有關(guān)，與胃癌的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TMN分期均有關(guān)，提示Survivin與胃癌的預(yù)后有關(guān)，監(jiān)測組織中Survivin的變化有助于幫助判斷預(yù)后。

近年來研究表明，Survivin的表達(dá)與腫瘤血管形成有關(guān)。Chen等[12]在研究小細(xì)胞肺癌組織中Survivin與VEGF表達(dá)情況時發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)呈正相關(guān)。李曙霞等[13]發(fā)現(xiàn)Survivin在口腔鱗癌形成過程中參與了腫瘤的血管形成。MVD是反映腫瘤微血管生成程度的一個常用指標(biāo)，是惡性腫瘤預(yù)后的獨(dú)立判斷指標(biāo)[14]。我們的研究發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中MVD的表達(dá)水平高于胃癌癌前病變組織及良性病變組織，Survivin表達(dá)陽性胃癌組織中MVD的表達(dá)水平高于其表達(dá)陰性胃癌組織，提示Survivin與胃癌組織的血管形成有關(guān)，這也可能是Survivin與胃癌預(yù)后有關(guān)的關(guān)鍵原因。新生血管的生成是一個復(fù)雜的過程，受到多種因素的影響，有研究表明胃癌組織中Survivin與VEGF的表達(dá)均升高[15]，也有研究表明Survivin可以作用于血管生成素-2發(fā)揮其促進(jìn)血管形成的作用[16]。然而，Survivin在胃癌影響血管形成的具體機(jī)制尚未闡明，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示Survivin與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，Survivin與胃癌腫瘤血管形成也有關(guān)，因而Survivin可能成為胃癌的一個有效治療靶點。

[1]Altieri DC.Targeted therapy by disabling crossroad signaling networks:the survivin paradigm[J].Mol Cancer Ther,2006,5(3):478-482.

[2]Shin S,Sung BJ,Cho YS,et al.An anti-apoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspase-3 and-7[J].Biochemistry,2001,40(4):1117-1123.

[3]Ma ACh,Lin R,Chan PK,et al.The role of survivin in angiogenesis during zebrafish embryonic development[J].BMC Dev Biol, 2007,7:50.

[4]Townsend PA,Dublin E,Hart IR,et al.BAG-i expression in human breast cancer:interrelationship between BAG-1 RNA,protein, HSC70 expression and clinico-pathological data[J].J Pathol,2002, 197(1`):51-59.

[5]Tanaka K,Iwamoto S,Gon G,et al.Expression of survivin and its relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas[J].Clin Cancer Res,2000,6(1):127-134.

[6]Weidner N,Carroll PR,Flax J,et al.Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma[J].Am J Pathol, 1993,143(2):401-409.

[7]Ryan BM,O′Donovan N,Duffy MJ.Survivin:a new target for anti-cancer therapy[J].Cancer Treat Rev,2009,35(7):553-562.

[8]Ye CP,Qiu CZ,Huang ZX,et al.Relationship between survivin expression and recurrence,and prognosis in hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2007,13(46):6264-6268.

[9]Rosato A,Pivetta M,Parenti A,et al.Survivin in esophageal cancer:An accurate prognostic marker for squamous cell carcinoma but not adenocarcinoma[J].Int J Cancer,2006,119(7):1717-1722.

[10]鄭超球,張陽德,彭健.大腸腺瘤-癌序列中抗凋亡基因Survivin的表達(dá)[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2003,13(4):12-14.

[11]Da CL,Xin Y,Zhao J,et al.Significance and relationship between Yes-associated protein and survivin expression in gastric carcinoma and precancerous lesions[J].World J Gastroenterol,2009,15 (32):4055-4061.

[12]Chen P,Zhu J,Liu DY,et al.Over-expression of survivin and VEGF in small-cell lung cancer may predict the poorer prognosis [J].Med Oncol,2014,31(1):775.

[13]李曙霞,丁艷平,張辛燕,等.口腔鱗癌發(fā)生過程中Survivin促血管生成作用的研究[J].北京口腔醫(yī)學(xué),2009,17(2):61-64.

[14]Rykala J,Przybylowska K,Majsterek I,et al.Angiogenesis markers quantification in breast cancer and their correlation with clinicopathological prognostic variables[J].Pathol Oncol Res,2011,17 (4):809-817.

[15]Bury J,Szumi覥o J,D諭browski A,et al.Vascular endothelial growth factor and survivin immunostaining in gastric adenocarcinoma[J]. Pol Przegl Chir,2012,84(7):341-347.

[16]Li F,Ackermann EJ,Bennett CF,et al.Pleiotropic cell-division defects and apoptosis induced by interference with survivin function[J].Nat Cell Biol,1999,1(8):461-466.

（本文編輯：姚永莉）

The expression of Survivin and its relationship with tumor angiogenesis in gastric cancer

PANG Cunwei,LIN Yao-gaung.
Department of Gerontological Gastroenterology,First Affiliated Hospital Guangxi Medical University,Nanning,Guangxi 530021

10.3969/j.issn.1672-2159.2016.02.002

530021廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年消化內(nèi)科

2016-01-11）