陳宇薇，趙曉華，黃鵬

[1.廣州醫(yī)科大學附屬腦科醫(yī)院（廣州市惠愛醫(yī)院）精神科，廣東 廣州 510370；2.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣東 廣州 510515]

論著

枸杞多糖對精神分裂癥模型大鼠海馬中G luR1表達及認知功能的影響

陳宇薇1，趙曉華2，黃鵬1

[1.廣州醫(yī)科大學附屬腦科醫(yī)院（廣州市惠愛醫(yī)院）精神科，廣東 廣州 510370；2.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣東 廣州 510515]

目的探討枸杞多糖（LBP）對精神分裂癥模型（Sz）大鼠海馬中G luR 1表達及認知功能影響。 方法選取36只健康SD大鼠，隨機分3組，每組12只，分別為正常對照組、模型組及藥物干預(yù)組（Sz+LBP）。Sz及Sz+LBP腹腔注射地卓西平馬來酸鹽0.6mg/（kg·d），連續(xù)注射14 d制造精神分裂癥模型，Sz+LBP同時灌胃枸杞多糖100mg/（kg·d）。正常對照組在相應(yīng)時段注射等劑量的正常生理鹽水。造模成功后，分別評估各組大鼠的行為學改變，進行M orris水迷宮，比較3組大鼠的定位航行和空間探索時間以及采用免疫熒光染色、W estern blot法測定海馬中GluR 1蛋白的表達。結(jié)果Sz的運動量、共濟失調(diào)、刻板行為評分以及海馬中GluR 1均高于正常對照組（P<0.01），Sz+LBP的運動量、共濟失調(diào)及刻板行為評分均低于Sz，明顯抑制精神分裂癥大鼠海馬中GluR1的表達（P<0.01）。結(jié)論枸杞多糖對精神分裂癥模型大鼠海馬具有保護作用，其機制與海馬中GluR 1表達來改善其認知功能相關(guān)。

枸杞多糖；精神分裂癥；海馬；GluR 1；認知功能。

精神分裂癥是一種嚴重危害人群健康且認知缺陷發(fā)生率非常高的重性精神病之一[1-2]。精神分裂癥給患者和社會帶來了嚴重的困擾，其原因是對其病因和發(fā)病機制的研究尚未明確。對于精神分裂癥的假說眾說紛紜，其中精神分裂癥谷氨酸（Glutamate，Glu）功能紊亂假說最為流行，認為精神分裂癥患者N-甲基 -D-天冬氨酸（N-Methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體缺陷誘導的Glu系統(tǒng)功能紊亂是精神分裂癥的主要病理機制。并且研究發(fā)現(xiàn)給予動物NMDA受體競爭性拮抗劑或非競爭性拮抗劑，均可引起與精神分裂癥（Schizophrenia，Sz）類似的異常行為[3-4]。枸杞多糖（lycium barbarrum polysaccharides，LBP）從枸杞子中提取出來的，是中藥枸杞子的重要活性成分。研究發(fā)現(xiàn)LBP具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化以及延緩衰老等多種功效，尤其是對神經(jīng)系統(tǒng)具有非常重要的保護功能[5]。本研究旨在通過建立地卓西平馬來酸鹽（Dizocilpine，MK-801）誘導的精神分裂癥模型，探討枸杞多糖對海馬的保護作用及可能機制，為臨床預(yù)防和治療精神分裂癥提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物

選取鼠齡為8周（體重220～240 g）的健康雄性SD大鼠36只，由南方醫(yī)科大學動物實驗中心提供。動物飼養(yǎng)室溫為（20±2）℃，濕度為43%～45%，常規(guī)的自由攝食飲水，將動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始進行實驗。

1.2藥品與試劑

枸杞多糖購自廣州廣修堂醫(yī)藥科技有限公司，含量≥30%，MK-801購于美國Sigma公司，兔抗大鼠Anti-谷氨酸受體1（glutamate receptor 1，GluR1）抗體購自英國Abcam公司，山羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司。

1.3實驗動物分組及模型的建立

健康雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組（Sz）和藥物干預(yù)組（Sz+LBP），每組各12只。模型組（Sz）和藥物干預(yù)組（Sz+LBP）腹腔注射MK-801 0.6mg/（kg·d）[6]連續(xù)注射14 d；同時藥物干預(yù)組灌胃給予枸杞多糖100mg/（kg·d）正常組以等容量生理鹽水同時注射。

1.4運動量的評價

飼養(yǎng)14 d后，監(jiān)測給藥以后各組大鼠60min內(nèi)的運動量的差異。具體方法：將各組大鼠放入監(jiān)測室里透明的塑料盒內(nèi)（規(guī)則35 cm×35 cm×25 cm），適應(yīng)環(huán)境30min后注射給藥（MK-801）。每只大鼠每5min的運動情況將自動記錄保存在計算機上。

1.5評估刻板行為和共濟失調(diào)程度

參考SAMS-DODD[7]的刻板行為評分標準，采用的是5級評分，進行盲法評分，取其平均分，然后進行統(tǒng)計。評分越高，說明精神分裂癥癥狀越重。參考HOFFMAN[8]的共濟失調(diào)評分標準，共濟失調(diào)本研究用4級評分，每10min評分1次。進行盲法評分，取其平均分，然后進行統(tǒng)計。進行盲法評分，取其平均分，然后進行統(tǒng)計。評分越高，說明精神分裂癥癥狀越重。

1.6Morris水迷宮實驗

在（30±2）℃水池內(nèi)各組大鼠自停藥后第l天實施水迷宮實驗，由計算機監(jiān)視系統(tǒng)同步記錄各組大鼠的運動軌跡。①定位航行實驗：造模后一共測試3 d，每天測試6次大鼠尋找平臺的學習能力的檢測。每天上午8︰00～12︰00對各組大鼠進行訓練和測試，具體方法：將平的站臺放在水池的中央，隨機從4個象限標記好的入水點將大鼠面向池壁慢慢地放入水中，電腦軟件將記錄大鼠搜索站臺軌跡，從大鼠入水游泳直到找到并爬上平臺所游過的距離。記錄在平臺象限內(nèi)的游泳時間，共4次，取平均值。②空間探索實驗：撤走池內(nèi)平臺，將大鼠從原入水點面向池壁放入池中。計算機將記錄大鼠在60 s內(nèi)穿越平臺區(qū)域的次數(shù)和在平臺象限內(nèi)的游泳時間用于測試大鼠的空間記憶能力，共4次，取平均值。

1.7蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測

實驗通過Western blot實驗方法對海馬不同區(qū)域組織的GluR1表達量進行比較。大鼠在末次游泳實驗后30min迅速斷頭處死，取出腦組織。游離右側(cè)海馬，放置-80℃冰箱保存，具體方法：①4℃將海馬區(qū)切片，裂解分離CA1區(qū)組織，然后經(jīng)勻漿液離心，提取CA1區(qū)總蛋白，接著離心總蛋白，最后超聲波裂解，從裂解液中分離提取生物化蛋白；②組織勻漿后提取蛋白成分變性，蛋白樣品通過聚丙烯酰胺凝膠（積層膠濃度6%，分離膠濃度10%）電泳2 h，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上（濕轉(zhuǎn)300ma，1.5 h或110 V，1 h）；③轉(zhuǎn)膜后，將膜置于3%牛血清白蛋白溶液中孵育；④加一抗Anti-GluR1抗體（1∶1 000），孵育（4℃，過夜），TBST洗一抗；⑤加二抗HRP抗體（1∶1 000）孵育（室溫，40min），TBST洗二抗，發(fā)光。采用NIH ImageJ軟件進行圖像分析。采用軟件Imagine分析圖像灰度，檢測各組樣品中海馬CA1區(qū)突觸膜上GluR1的表達量，后續(xù)統(tǒng)計。

1.8免疫熒光染色

心臟灌流法采集腦組織標本。切片的厚度為18μm，貼于掛膠的載玻片，置于-80℃冰箱備用。實驗前，將切片置于室溫放置1 h，具體方法：①0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）溶液沖洗3次，每次3min；②0.2%Triton-X100 37℃孵育30min，PBS沖洗；③加一抗（1∶100），4℃冰箱過夜；④PBS沖洗，加入熒光標記的二抗（1∶100），放入37℃恒溫箱溫育1 h，PBS沖洗。滴加熒光封片劑，封片。熒光顯微鏡進行觀察拍攝，利用圖像分析系統(tǒng)進行分析。

1.9統(tǒng)計學方法

用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，3組間差異比較首先采用方差分析，在有意義的基礎(chǔ)之上，兩組間差異比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1運動量的評價

將正常對照組，模型組，藥物干預(yù)組大鼠60min內(nèi)運動量進行分析。結(jié)果顯示：3個比較組行方差分析，可見差異有統(tǒng)計學意義；行兩兩比較發(fā)現(xiàn)模型組均高于對照組，LBP組大鼠低于模型組。見表1。

2.2刻板行為和共濟失調(diào)評估

結(jié)果顯示：刻板行為和共濟失調(diào)評分差異均有統(tǒng)計學意義，模型組高于正常對照組。共濟失調(diào)程度呈現(xiàn)同樣的趨勢。見表2、表3。

2.3海馬G luR1的表達

如圖1所示，正常對照組海馬GluR1的表達量為0.453，模型組為0.782，藥物干預(yù)組為0.569。

表1　各組大鼠運動量的評價 （）

表1　各組大鼠運動量的評價 （）

注：1）與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=-57.204，P=0.032）；2）給藥之后，與模型組比較癥狀有所改善，差異有統(tǒng)計學意義（t=30.454，P=0.025）

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表2　大鼠刻板行為的變化（n=36，分，）

表2　大鼠刻板行為的變化（n=36，分，）

注：1）與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=-11.361，P=0.047）；2）給藥之后，與模型組比較癥狀有所改善，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.055，P=0.032）

結(jié)果正常對照組　0.73±1.12模型組　4.78±2.341）藥物干預(yù)組　2.53±0.562）F值　25.86 P值　0.039組別

表3　大鼠共濟失調(diào)的變化（n=18，分，）

表3　大鼠共濟失調(diào)的變化（n=18，分，）

注：1）與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=-10.129，P=0.021）；2）給藥之后，與模型組比較癥狀有所改善，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.201，P=0.008）

結(jié)果正常對照組　0.43±0.13模型組　2.03±0.781）藥物干預(yù)組　1.23±0.522）F值　36.79 P值　0.028組別

圖1　海馬GluR1的表達

2.4海馬G luR1陽性神經(jīng)元的表達

正常對照組海馬GluR陽性神經(jīng)元的表達量為19.000，模型組為43.000，藥物干預(yù)組為35.000。見圖2。

圖2　海馬G luR陽性神經(jīng)元的表達

3　討論

精神分裂癥是一種較常見的精神疾病，涉及思維、情感和行為等多方面的障礙，以精神活動與環(huán)境不脅凋為特征[9-10]。臨床研究發(fā)現(xiàn)在精神分裂癥患者中認知缺陷的發(fā)生率高，約85%患者出現(xiàn)認知功能方面的障礙[11]。臨床上使用的藥物在治療過程中易出現(xiàn)不良反應(yīng)和鎮(zhèn)靜、體位性低血壓與植物神經(jīng)紊亂的不良反應(yīng)。因此，探索尋找療效好、副作用小的抗精神分裂癥的中草藥非常迫切，目前我國國內(nèi)尚未有人具體探討中藥治療精神分裂癥的基礎(chǔ)實驗研究。因此，對于建立合理的動物模型，選取合理的藥物干預(yù)并對其發(fā)病機制進行系統(tǒng)深入的研究非常有意義。本文利用dizocilpine（MK-801）是高親和力的NMDA受體非競爭性拮抗劑，制備精神分裂癥模型，探討精神分裂癥對認知功能的影響。

本研究連續(xù)14 d給大鼠腹腔注射MK-801，監(jiān)測各組大鼠的運動量的變化和精神狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組大鼠行為活動均正常，而模型組大鼠均出現(xiàn)持續(xù)、無目的、迅速的追尾運動。枸杞多糖干預(yù)組大鼠活動明顯有所改善（表1、表2）。此結(jié)果與ANDINE等[12]給藥誘發(fā)大鼠精神分裂癥發(fā)生后的行為學改變一致。此外，模型組大鼠還出現(xiàn)擬精神分裂癥癥狀如：向一邊傾斜、走路不穩(wěn)、反復跌倒、重復抬頭、搖頭或旋轉(zhuǎn)、尖叫等。筆者對各組大鼠的異常行進行評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的共濟失調(diào)與刻板行為評分均高于正常對照組，此結(jié)果與YAMAGUCHI[13]相關(guān)研究結(jié)果一致。證明MK-801誘導產(chǎn)生類似精神分裂癥的模型非常成功。枸杞多糖干預(yù)后，上述癥狀均有所改善。說明枸杞多糖對精神分裂癥有一定的治療作用。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的谷氨酸受體包括α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA）受體和NMDA受體。其中AMPA受體的數(shù)量決定了突出后神經(jīng)元興奮的程度，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響突觸傳遞的主要決定因素.它在突觸后膜區(qū)和突觸后膜外區(qū)存在的數(shù)量比的穩(wěn)定性，并在學習與記憶功能中發(fā)揮重要作用，對于大腦信息的儲存是具有非常重要的意義[14-15]。GluR1是AMPA受體最主要的受體，因此研究其在精神分裂癥模型中的機制尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥模型大鼠海馬區(qū)GluR1的表達量較正常組明顯增加，枸杞多糖干預(yù)后，精神分裂癥大鼠海馬區(qū)及CA1區(qū)突觸膜蛋白中GluR1的表達量降低。因此認為LBP對認知的保護作用可能與CA1區(qū)突觸膜上GluR1表達量的較少有關(guān)。

綜上所述，本次實驗主要通過選取枸杞多糖為干預(yù)藥物，建立合理的精神分裂癥大鼠模型，探討枸杞多糖對精神分裂癥認知功能的影響及其作用機制，為精神分裂癥的臨床藥物治療提供了實驗數(shù)據(jù)，并對精神分裂癥治療提供了新靶點。即枸杞多糖能夠保護精神分裂癥大鼠的認知功能，其具體機制可能與GluR1在海馬區(qū)總蛋白及海馬CA1區(qū)突觸膜蛋白中的表達量有關(guān)。

[1]AL U STIZA I,RADUA J,ALBAJES-EIZAGIRRE A,et al. Meta-analysis of functional neuroimaging and cognitive control studies in schizophrenia:preliminary elucidation of a core dysfunctional timing network[J].Front Psychol,2016,17(7):192.

[2]ROSSLER W,SALIZE H J,OS J V,et al.Size of burden of schizophrenia and psychiatric disorders[J].Eur.Neuropsychopharmacol,2005,(15):399-409.

[3]WOO T U,CROWELL A L.Targeting synapses and myelin in the prevention of schizophrenia[J].Schizophr Res,2005,73(2/3): 193-207.

[4]WU H,WANG X,GAO Y,et al.NMDA receptor antagonism by repetitive MK801 administration induces schizophrenia-like structural changes in the rat brain as revealed by voxel-based morphometry and diffusion tensor imaging[J].Neuroscience,2016, 322:221-233.

[5]LAM C S,TIPOE G L,SO K F,et al.Neuroprotective mechanism of Lycium barbarum polysaccharides against hippocampal-dependent spatial memory deficits in a rat model of obstructive sleep apnea[J].PLoS One,2015,10(2):DOI:10.1371/journal.pone.0117990.

[6]LINS B R,PHILLIPS A G,HOWLAND J G.Effects of D-and L-govadine on the disruption of touchscreen object-location paired associates learning in rats by acute MK-801 treatment[J]. Psychopharmacology(Berl),2015,232(23):4371-4382.

[7]SAMS-DODD F.MK-801 and phencyclidine induced neurotoxicity do not cause enduring behaviours resembling the positive and negative symptoms of schizophrenia in the rat[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol,2004,95(5):241-246.

[8]HOFFMAN D C.Typical and atypical neumleptics antagonize. MK-801-induced locomotion and stereotypy in rats[J].J Neural Transm Gen Sect,1992,89(1/2):1-10.

[9]NGUYEN A,FROBERT L,MCCLUSKEY I,et al.Development of the positive emotions program for schizophrenia:An intervention to improve pleasure and motivation in schizophrenia[J].Front Psychiatry,2016,7(4):911-913.

[10]POPOLO R,DIMAGGIO G,LUTHER L,et al.Theory of mind in schizophrenia:associations with clinical and cognitive insight controlling for levels of psychopathology[J].J Nerv Ment Dis, 2016,204(3):240-243.

[11]DAMILOU A,APOSTOLAKIS S,THRAPSANIOTI E,et al. Shared and distinct oculomotor function deficits in schizophrenia and obsessive compulsive disorder[J].Psychophysiology,2016,53 (6):796-805.

[12]ANDINéP,WIDERMARK N,AXELSSON R,et al.Characterization of MK-801-induced behavior as a putative rat model of psychosis[J].J Pharmacol Exp Ther,1999,290(3):1393-1408.

[13]YAMAGUEHI M,SUZUKI T,SEKI T,et al.Decreased cell proliferation in the dentate gyms of rats after repeated administration of cocaine[J].Synapse,2005,58(2):63-71.

[14]MAHER B J,MACKINNON R L,BAI J,et al.Activation of postsynaptic Ca(2+)stores modulates glutamate receptor cycling in hippocampal neurons[J].J Neurophysiol,2005,93(1):178-188.

[15]MEYER G,VAROQUEAUX F,NEEB A,et al.The complexity of PDZ domain-mediated interactions at glutamatergic synapses: a case study on neuroligin[J].Neuropharmacology,2004,47(5): 724-733.

（張西倩編輯）

Effect of Lycium barbarrum polysaccharides on hippocam pal GluR1 and cognitive function of schizophrenia rats

Yu-wei Chen1,Xiao-hua Zhao2,Peng Huang1
［1.Department of Psychiatry，the Affiliated Brain Hospital of Guangzhou Medical University，（Guangzhou Huiai Hospital），Guangzhou，Guangdong 510370，China；2.Traditional Chinese Medical College of Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong 510515，China］

Objective To exp lore the effect of Lycium barbarrum polysaccharides（LBP）on receptor 1 of glutamic acid（GluR1）in hippocampus and cognitive function of schizophrenia rats.Methods Thirty-six SD rats were randomly divided into 3 groups with 12 in each group：normal group，model group and LBP group.Model group and LBP group were given MK801（0.6mg/kg·d）with sinistro-intraperitoneal injection to set the schizophrenia model.At the same time，LBP group was administered intragatrically with 100 mg/kg·d LBP.The control group was injected with 0.9%saline（NS）in the corresponding period.The behavioral changes of each ratwere separately assessed with Morris experiment，and the navigation and time space exploration were compared between the three groups.Using immunofluorescence and Western blot，the GluR1 protein expression in hippocampus was determined.Results The model group had higher amount of exercise，ataxia，stereotyped behavior score and GluR1 expression in hippocampus than the control group（P＜0.01）.LBP group had significantly lower amount of exercise，ataxia，stereotyped behavior score and GluR1 expression in hippocampus than the model group（P＜0.01）.ConclusionsLBP plays a protective role for schizophrenia，its mechanism may be due to down-regulation of GluR1 expression in the hippocampus of schizophrenia rats.

Lycium barbarrum polysaccharide；schizophrenia；hippocampus；glutamate receptor 1；cognitive function

R 749

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.14.004

1005-8982（2016）14-0017-05

2016-03-27