程曉云，鄭芊芷，宋婷婷，鄭善堅(jiān)*，鄭榮泉（.浙江師范大學(xué)特種水產(chǎn)研究所，浙江金華 2004；2.遂昌縣森林資源管理總站，浙江麗水 200；.浙江師范大學(xué)附屬中學(xué)浙江金華 2004）

棘胸蛙白內(nèi)障病原鑒定及藥敏試驗(yàn)

程曉云1，2，鄭芊芷3，宋婷婷1，鄭善堅(jiān)1*，鄭榮泉1
（1.浙江師范大學(xué)特種水產(chǎn)研究所，浙江金華 321004；2.遂昌縣森林資源管理總站，浙江麗水 323300；3.浙江師范大學(xué)附屬中學(xué)浙江金華 321004）

從患病棘胸蛙（Quasipaa spinosa）中分離到BN1306菌株，經(jīng)肌肉注射回健康棘胸蛙，復(fù)制出棘胸蛙白內(nèi)障病的基本癥狀，并顯示對棘胸蛙有較強(qiáng)的致病性。通過形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)、16S rDNA測序等方法鑒定該致病菌為布氏檸檬酸桿菌（Citrobacter braakii）。藥敏試驗(yàn)顯示該菌對諾氟沙星、鏈霉素、四環(huán)素、吡哌酸高度敏感，對氟哌酸、頭孢哌酮、慶大霉素、青霉素、新霉素、林可霉素、先鋒霉素和紅霉素不敏感。

棘胸蛙；布氏檸檬酸桿菌；白內(nèi)障

文獻(xiàn)著錄格式：程曉云，鄭芊芷，宋婷婷，等.棘胸蛙白內(nèi)障病原鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（7）：1141-1143，1151.

棘胸蛙（Quasipaa spinosa）主要分布于我國長江以南地區(qū)，是一種兼具食用和藥用價(jià)值的蛙類［1］。近年來，由于養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大、養(yǎng)殖密度提高、不合理的飼養(yǎng)管理以及種質(zhì)衰退等原因，棘胸蛙病害時(shí)有發(fā)生。蘇雪紅等［2］調(diào)查發(fā)現(xiàn)棘胸蛙的病害包括白內(nèi)障、爛皮病、紅腿病、脹肚病、出血病等10余種主要疾病，但相關(guān)病原的研究報(bào)道較少。王瑞君等［3］報(bào)道了棘胸蛙爛皮病病原奇異變形桿菌（Proteusmirabilis），宋婷婷等［4］報(bào)道了棘胸蛙體表發(fā)白、肝臟發(fā)黑囊腫的一種新型疾病的病原為嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）。棘胸蛙白內(nèi)障病癥近年來呈現(xiàn)多發(fā)性態(tài)勢，發(fā)病率高，危害大，亟需開展相關(guān)的病原研究。為了達(dá)到控制該病的目的，我們于2014—2015年進(jìn)行了棘胸蛙白內(nèi)障病的病原診斷鑒定及敏感藥物篩選，以期為該病的防治和診斷提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1致病菌分離

患白內(nèi)障棘胸蛙和健康棘胸蛙均取自浙江省麗水市遂昌縣棘胸蛙養(yǎng)殖場，患白內(nèi)障棘胸蛙體重為150～200 g每只，健康棘胸蛙平均體質(zhì)量為（100± 20）g。發(fā)病棘胸蛙無菌操作分別取病蛙的眼睛、肝臟等病變部位，劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，于28℃下培養(yǎng)24 h，挑取占優(yōu)勢的菌落重復(fù)劃線分離，直至得到純種，然后將純化菌轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2人工感染試驗(yàn)

1.2.1菌液制備

將純培養(yǎng)細(xì)菌分別接種在普通營養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，置于振蕩頻率為200 r·s-1的搖床中振蕩培養(yǎng)18 h，用滅菌生理鹽水采用比濁管法稀釋，配置成5×108m L-1濃度的菌液，置4℃環(huán)境中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2人工感染

采用肌肉注射的方式感染健康棘胸蛙。將制備的菌液按每只0.2 mL劑量分別注射健康棘胸蛙，每組10只；設(shè)等量的生理鹽水為對照，注射劑量為每只0.2 m L。放養(yǎng)在經(jīng)消毒的水族箱中飼養(yǎng)觀察，觀察期為15 d。

1.3生理生化特性鑒定

對分離的致病菌進(jìn)行革蘭氏染色和生理生化試驗(yàn)，鑒定方法參照有關(guān)文獻(xiàn)［5］所述方法進(jìn)行。

1.416S rDNA鑒定

采用TaKaRa公司的16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit試劑盒提取菌株的基因組DNA，設(shè)計(jì)通用引物（正向引物5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，反向引物5＇-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3＇）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將PCR擴(kuò)增的細(xì)菌16S rDNA產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。

1.5藥物敏感試驗(yàn)

藥物敏感試驗(yàn)采用藥敏紙片法。將分離致病菌株于28℃培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水稀釋菌液至1×106m L-1，取200μL菌液涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，稍干后取藥敏紙片均勻貼片于培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)18 h后測量抑菌圈大小。根據(jù)藥敏紙片標(biāo)準(zhǔn)確定敏感性。

2　結(jié)果與分析

2.1病原菌的分離

從發(fā)病的棘胸蛙眼睛和肝臟部位分離到BN1306、BN1307細(xì)菌。

2.2致病菌感染

將分離的2株細(xì)菌經(jīng)肌肉注射健康棘胸蛙。結(jié)果顯示，BN1306菌株注射棘胸蛙體內(nèi)，棘胸蛙一周內(nèi)死亡率為80%，癥狀表現(xiàn)為蛙眼球晶體皮質(zhì)渾濁，眼球凸出，眼瞼灰白，與自然發(fā)病基本相同（圖1）；BN1307菌株和對照組無感染發(fā)病現(xiàn)象，表明BN1306菌株為棘胸蛙白內(nèi)障的致病病原，且對棘胸蛙有較強(qiáng)的致病性。其感染結(jié)果如表1所示。

圖1　病變棘胸蛙眼球特征

表1　分離菌對棘胸蛙的人工感染結(jié)果

2.3病原鑒定

2.3.1致病菌形態(tài)及生理生化鑒定

BN1306菌為革蘭氏陰性短桿菌，無鞭毛，無莢膜和芽孢，在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中觀察，菌落光滑半透明，邊緣整齊，中間略隆起，菌落可隨時(shí)間的延長而增大。生理生化鑒定結(jié)果如表2所示。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》鑒定，BN1306菌為布氏檸檬酸桿菌（Citrobacter braakii）。

表2　細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

2.3.216S rDNA測序鑒定

對BN1306細(xì)菌利用16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。測得16S rDNA序列為1 401 bp（圖2）。

通過NCBI網(wǎng)站，對BN1306菌的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中各種菌的16S rDNA序列進(jìn)行比對，與其相似性最高的前9個(gè)菌株見表3。通過16S rDNA序列同源性比較，發(fā)現(xiàn)BN1306菌株所得結(jié)果與GenBank上收錄的布氏檸檬酸桿菌（Citrobacter braakii）同源性達(dá)到99%，因此可進(jìn)一步確認(rèn)引起該病的病原菌為布氏檸檬酸桿菌。

表3　菌株16S rDNA序列同GeneBank中細(xì)菌菌株同源性比較

2.4藥敏情況

藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。布氏檸檬酸桿菌對諾氟沙星、鏈霉素、四環(huán)素、吡哌酸高度敏感，對氟哌酸、頭孢哌酮、慶大霉素、青霉素、新霉素、林可霉素、先鋒霉素和紅霉素不敏感。

圖2　細(xì)菌16S rDNA測序結(jié)果

表4　分離菌對抗菌藥敏感性

3　討論

布氏檸檬酸桿菌，也稱布氏枸櫞酸桿菌，是腸桿菌科檸檬酸桿菌屬成員。作為條件致病菌，主要在人和動(dòng)物體內(nèi)分離到，可以引起動(dòng)物黏膜發(fā)生炎癥、潰瘍［6］。布氏檸檬酸桿菌在水生動(dòng)物方面也有引起中華鱉口咽腔潰爛綜合癥的報(bào)道［7］，但該菌引起棘胸蛙白內(nèi)障則首次報(bào)道。

由于蛙類的白內(nèi)障是以病癥特征來命名，因此，關(guān)于蛙類的白內(nèi)障是否是一個(gè)單獨(dú)的疾病種類，還是其他疾病所表現(xiàn)出的癥狀，仍有一些爭議，如牛蛙的腦膜炎膿毒性黃桿菌引起的歪頭腦膜炎病也有白內(nèi)障的癥狀［8］。目前在報(bào)道牛蛙白內(nèi)障病的病原和癥狀上有些不同，陳曉鳳等［9］認(rèn)為是由醋酸鈣不動(dòng)桿菌（Acinetohacter calcoaceticus）引起的牛蛙白內(nèi)障病，肝臟紫黑色有腫大或紫紅色稍腫大，雙腿肌肉呈黃綠色；紀(jì)榮興等［10］報(bào)道認(rèn)為，引起牛蛙白內(nèi)障病原為嗜水氣單胞菌，患病牛蛙肝臟顏色變淡、微腫大，雙腿肌肉紅色，伴有紅腿癥狀等。因此，棘胸蛙的白內(nèi)障疾病是否還有其他病原，以及布氏檸檬酸桿菌引起的病理過程仍需進(jìn)一步研究。

藥敏實(shí)驗(yàn)表明，諾氟沙星、鏈霉素、四環(huán)素、吡哌酸等抗菌藥物對布氏檸檬酸桿菌有較好的抗菌作用，在實(shí)際防治過程中，在飼料中添加敏感藥物20 mg·kg-1劑量的諾氟沙星和40 mg·kg-1保肝藥物肝腎康拌食投喂，連用5 d，同時(shí)用0.5 mg· L-1二氧化氯對水體進(jìn)行消毒，起到良好的治療效果。由于棘胸蛙白內(nèi)障的病因和病理復(fù)雜，發(fā)病嚴(yán)

重的病蛙已幾乎不攝食，關(guān)鍵還是防重于治。養(yǎng)殖場應(yīng)加強(qiáng)棘胸蛙飼養(yǎng)管理，加強(qiáng)疾病預(yù)防，嚴(yán)格保證水體的流動(dòng)更新，加強(qiáng)水質(zhì)的消毒工作，降溫保潔，放養(yǎng)密度要適當(dāng)，切勿放養(yǎng)過密。這對于預(yù)防該病的發(fā)生或者大面積蔓延具有切實(shí)有效的作用。

［1］ YE S，HUANG H，ZHENG R，et al.Phy1ogeographic analyses strong1y suggest cryptic speciation in the giant spiny frog（Dicrog1ossidae：Paa spinosa）and interspecies hybridization in Paa［J］.Plos One，2013，8（7）：e70403.

［2］ 蘇雪紅，張正江，紀(jì)任宗，等.棘胸蛙病害調(diào)查及藥敏試驗(yàn)初報(bào)［J］.福建水產(chǎn)，2001，3（1）：32-37.

［3］ 王瑞君，熊筱娟.棘胸蛙爛皮病奇異變形桿菌的分離、鑒定及對藥物敏感性研究［J］.淡水漁業(yè)，2012，42（4）：36-37.

［4］ 宋婷婷，鄭榮泉，張俊美，等.一種棘胸蛙新類型疾病病原分析［J］.福建水產(chǎn)，2014，36（5）：344-350.

［5］ 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，2001.

［6］ 周昱，陳瓊，孔繁德，等.PCR快速檢測布氏枸櫞酸桿菌方法的建立與初步應(yīng)用［J］.中國畜牧獸醫(yī)文摘，2013，29（3）：42-48.

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［8］ 葉雪平，楊廣智，羅毅志.牛蛙腦膜炎（歪脖子?。┎≡蛛x及防治技術(shù)研究［J］.浙江水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1996，15（4）：301-304.

［9］ 陳曉鳳，陳祈輝，夏梅珠.牛蛙“白內(nèi)障”病病原及防治的研究［J］.福建水產(chǎn)，1995（2）：13-18.

［10］ 紀(jì)榮興，鄒文政，莫英軍.牛蛙“白內(nèi)障”病病原的初步研究［J］.集美大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，8（1）：8-11.

（責(zé)任編輯：萬 晶）

S 947.2

B

0528-9017（2016）07-1141-03

10.16178/j.issn.0528-9017.20160758

2015-12-12

國家農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2014GB2C200199）；國家自然基金項(xiàng)目（31472015；31172116）；浙江省水產(chǎn)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2012R10026-07）

程曉云（1975—），女，浙江遂昌人，工程師，從事森林資源管理與研究工作，E-mai1：chengxiaoyun@163.com。

鄭善堅(jiān)（1971—），男，副教授，從事水生動(dòng)物疾病學(xué)研究工作，E-mai1：zhengsj@zjnu.cn。