李　鋒，羅朝鵬，鄭　凱，魏春陽，王　燃，鄭慶霞，楊　軍，魏　攀*（.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南鄭州 45000；.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司許昌卷煙廠，河南許昌 46000；.黃淮煙葉樣品中心，河南鄭州 450008）

DNA條形碼技術(shù)在煙草制品害蟲檢測中的應(yīng)用

李鋒1，羅朝鵬1，鄭凱2，魏春陽3，王燃1，鄭慶霞1，楊軍1，魏攀1*
（1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南鄭州 450001；2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司許昌卷煙廠，河南許昌 461000；3.黃淮煙葉樣品中心，河南鄭州 450008）

煙草制品在貯存和加工過程中都可能受到害蟲的“污染”。害蟲/蟲尸混入煙葉和卷煙產(chǎn)品中，不僅會降低煙葉的品質(zhì)，劣化卷煙的吸味，而且嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者利益和煙草行業(yè)的形象。目前煙草行業(yè)對煙草制品蟲害的檢測主要分為肉眼檢查和信息素誘集檢測。前者受人為因素影響太大；后者只能誘集到活的成蟲，對死蟲、蟲卵、幼蟲或蟲蛹等根本無效。利用DNA條形碼技術(shù)，提取可能混有害蟲的煙葉樣品DNA，以昆蟲的特異性條形碼引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而在分子水平上檢測煙草樣品中是否存在害蟲、蟲尸、蟲卵、幼蟲或蟲蛹等“污染”。該方法將極大提高檢測范圍和靈敏度，為煙草制品蟲害檢測提供新途徑。

煙草制品；害蟲檢測；DNA條形碼技術(shù)；分子檢測

文獻(xiàn)著錄格式：李鋒，羅朝鵬，鄭凱，等.DNA條形碼技術(shù)在煙草制品害蟲檢測中的應(yīng)用［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（7）：1021-1024.

煙草制品在加工、儲藏、銷售等過程中均易遭受害蟲破壞。據(jù)調(diào)查，全國貯煙害蟲每年導(dǎo)致的煙葉重量損失率大約為1.64%，煙葉損失總量大約為3.12萬t［1］。目前煙草行業(yè)對倉儲煙葉害蟲主要采取防治手段［2］，例如物理機(jī)械防治（高溫/低溫殺蟲、輻射殺蟲等）、化學(xué)防治（化學(xué)試劑熏蒸）、微生物防治和昆蟲激素防治等。目前煙草制品蟲害的檢測主要依賴肉眼檢查和昆蟲信息素誘集檢測，和大多數(shù)儲糧蟲害檢測方法一樣［3］，都無法檢測到死蟲、蟲卵、幼蟲和蟲蛹，但是這些蟲源“污染”同樣會給煙葉貯存和卷煙生產(chǎn)帶來嚴(yán)重危害。因此，目前亟須一種既能檢測活蟲，又能檢測死蟲、蟲卵、幼蟲和蟲蛹的全方位蟲源檢測手段來填補(bǔ)煙草行業(yè)空白。

2003年，加拿大Gue1ph大學(xué)的分類專家Hebert提出了“DNA條形碼”理論［4］，即每個物種利用自身較短的一段DNA序列作為身份標(biāo)識，根據(jù)序列差異給物種貼上各自的“標(biāo)簽”，并建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫以供查詢。2004年，Herbert等利用動物DNA條形碼對北美260多種鳥類［5］和熱帶鱗翅目昆蟲［6］進(jìn)行了鑒定，取得了理想的效果。人們還可以利用DNA條形碼從蝙蝠和蛇蜥的糞便中鑒定出未完全消化的被捕食的節(jié)肢動物［7］。A1caide等［8］通過DNA條形碼鑒定吸血節(jié)肢動物（例如蚊子、虻、蜱等）體內(nèi)的宿主DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了高達(dá)40種脊椎動物宿主，其中包括23種鳥類、16種哺乳類和1種爬行類。

因此，利用DNA條形碼技術(shù)檢測煙草制品中的害蟲正如從蝙蝠糞便中檢測被捕食的節(jié)肢動物、從吸血節(jié)肢動物體內(nèi)檢測宿主，如果煙草制品中混有害蟲的話，提取的基因組DNA中就會混有害蟲的DNA，利用動物的DNA條形碼（CO1基因）引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，能夠擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶。該技術(shù)在理論上存在可行性，具有很好的應(yīng)用前景。

1　材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)所需的煙葉樣品由河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司許昌卷煙廠無償提供。

Trans5α感受態(tài)細(xì)胞、High Fidelity（H iFi）PCR SuperMix、pEASY-T1 C1oning Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。DL2000 DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司。動物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自鄭州安賽生物科技有限公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。引物合成與測序均由華大基因完成。

1.2方法

1.2.1煙葉樣品的收集與分組

收集有害蟲和無害蟲的煙葉樣品，將樣品分為陽性對照組、陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組，每份待測樣品在不同位置取樣3次，即3個生物學(xué)重復(fù)。陽性對照組：煙草甲成蟲、蟲蛹、幼蟲或蟲卵。陰性對照組：無任何蟲源的煙葉。實(shí)驗(yàn)組：有害蟲的煙葉。

1.2.2煙葉樣品基因組DNA的提取和質(zhì)量檢測

按照動物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒說明書提取煙葉樣品的基因組DNA?；蚪MDNA質(zhì)量檢測主要包括：基因組DNA片段大小的確定，基因組DNA濃度的測定，基因組DNA純度的測定。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA片段大??；Thermo NanoDrop 2000測定基因組DNA的濃度和純度，D260/D280為1.8～2.0表示DNA純度較高。

1.2.3PCR擴(kuò)增條形碼基因

以煙葉樣品的基因組DNA為模板，使用昆蟲特異性的DNA條形碼引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物5＇-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3＇，下游引物5＇-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3＇。PCR反應(yīng)體系為DNA模板1μL，10×H iFi Taq Buffer（含Mg2+）2μL，10 mmol·L-1dNTP 2 μL，High Fidelity Taq（5 U·μL-1）0.2μL，上下游引物（10μmol·L-1）各1μL，ddH2O 12.8 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共運(yùn)行35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min；4℃保存。

1.2.4PCR產(chǎn)物的克隆測序和序列比對分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收特異性目的片段，與T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)組中隨機(jī)挑取10個單克隆進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行B1ast比對，如果與數(shù)據(jù)庫中某個蟲子的CO1條形碼基因序列的相似度在95%以上，則表明待測的煙草樣品中含有蟲子，同時還可以確定蟲子是哪個物種。

2　結(jié)果與分析

2.1煙葉樣品的基因組DNA質(zhì)量檢測

電泳檢測時遠(yuǎn)離點(diǎn)樣孔的地方如果沒有雜帶，說明沒有RNA污染；蛋白質(zhì)一般集中在點(diǎn)樣孔周圍，如果點(diǎn)樣孔周圍不是特別亮，說明蛋白污染較少［9］。如圖1所示，煙葉樣品的基因組DNA沒有明顯的彌散和拖帶現(xiàn)象，表明基因組DNA的完整性較好。NanoDrop 2000檢測D260/D280均在1.8～2.0，濃度大約為380 ng·μL-1，這表明基因組DNA的純度較高，濃度也滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。

圖1　煙草樣品基因組DNA電泳結(jié)果

2.2DNA條形碼PCR擴(kuò)增結(jié)果

如圖2所示，陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組都擴(kuò)增出特異性的DNA條形碼基因，陰性對照組則相反，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合理論預(yù)期，表明DNA條形碼技術(shù)檢測煙草制品中蟲害具有可行性。

圖2　煙草樣品中DNA條形碼擴(kuò)增結(jié)果

2.3PCR產(chǎn)物克隆測序和序列分析結(jié)果

如圖3所示，將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行B1ast比對，結(jié)果顯示隨機(jī)挑取的10個單克隆中目標(biāo)序列的長度均為660 bp，與煙草甲（Lasioderma serricorne）線粒體CO1基因的相似度達(dá)99%。這表明PCR擴(kuò)增出來的目標(biāo)條帶為煙草甲的CO1條形碼基因，該實(shí)驗(yàn)組煙葉樣品中含有害蟲煙草甲。

圖3　實(shí)驗(yàn)組煙葉樣品PCR產(chǎn)物克隆測序后的B1ast比對結(jié)果

3　小結(jié)與討論

本研究利用DNA條形碼技術(shù)從分子水平上對煙草制品蟲害進(jìn)行檢測，在現(xiàn)有的煙草制品蟲害檢測方法上實(shí)現(xiàn)了新的突破，以害蟲DNA為檢測依據(jù)，只要煙草樣品中存在少量的蟲源DNA，都能夠通過PCR擴(kuò)增后檢測到，靈敏度和準(zhǔn)確度大幅提高。

現(xiàn)有的絕大部分煙草制品蟲害檢測技術(shù)只能檢測出活體害蟲，而且受人為和環(huán)境因素影響較大，檢測靈敏度低。DNA條形碼技術(shù)很好地彌補(bǔ)了這些缺陷，對活蟲、死蟲、蟲卵、幼蟲和蟲蛹等只要含有DNA的蟲源都能夠檢測出來。DNA條形碼技術(shù)檢測煙草制品蟲害具有其自身的優(yōu)勢：（1）僅需小塊生物體組織即可進(jìn)行鑒定［10］，因此只要從零散的組織碎片中能夠提取出較完整的DNA，就能夠通過DNA條形碼進(jìn)行鑒定；（2）盡管一些動物在生長發(fā)育過程中其形態(tài)會發(fā)生很大改變，但是DNA條形碼技術(shù)是從基因水平對物種進(jìn)行鑒定，因此不受生物的生長階段限制［11］。該技術(shù)補(bǔ)充并完善了現(xiàn)有的煙草制品蟲害檢測方法，擴(kuò)大了蟲源檢測范圍，提高了檢測靈敏度，并且可以實(shí)現(xiàn)對煙草制品貯存和加工等多個環(huán)節(jié)的全程監(jiān)控，最大限度地保障了煙草制品的質(zhì)量安全。

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（責(zé)任編輯：張 韻）

S572

A

0528-9017（2016）07-1021-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20160718

2016-03-16

鄭州煙草研究院院長科技發(fā)展基金項(xiàng)目（902014CA0420）。

李 鋒（1979—），工程師，博士，從事煙草分子生物學(xué)研究工作，E-mai1：likite2002@163.com。

魏 攀，E-mai1：weipan83@126.com。