劉年鋒，郭　睿，江小斌，張善霹，王　偉，鄭晨暉，楊小強(qiáng)

(福州市海洋與漁業(yè)技術(shù)中心，福建 福州 350026)

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福州地區(qū)大黃魚變形假單胞菌的分離與鑒定

劉年鋒，郭睿，江小斌，張善霹*，王偉，鄭晨暉，楊小強(qiáng)

(福州市海洋與漁業(yè)技術(shù)中心，福建 福州 350026)

為研究2013年春夏之際羅源灣海區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚(Pseudosciaenacrocea)內(nèi)臟出現(xiàn)白點(diǎn)癥狀的病原，從具有臨床癥狀的大黃魚內(nèi)臟中分離到優(yōu)勢(shì)菌，經(jīng)回接感染試驗(yàn)證實(shí)該菌為病原菌；分析該病原菌的形態(tài)特征、理化特性、分類地位及藥物敏感性等特性，結(jié)合16SrDNA序列構(gòu)建的進(jìn)化樹與假單胞菌屬惡臭群中的變形假單胞菌同源性最高，在99%以上，并通過看家基因gyrB序列分析進(jìn)一步驗(yàn)證該菌為變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)；該菌對(duì)強(qiáng)力霉素、諾氟沙星、恩諾沙星3種抗生素敏感，對(duì)奧氟沙星、左氟沙星、四環(huán)素3種抗生素中度敏感。

大黃魚；變形假單胞菌；16SrDNA；gyrB

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)是我國(guó)海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)品種之一。福建省是大黃魚的主要養(yǎng)殖區(qū)，養(yǎng)殖大黃魚數(shù)量超過全國(guó)總產(chǎn)量的90%。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，大黃魚不斷發(fā)生各種疾病，如大黃魚刺激隱核蟲[1]，甚至出現(xiàn)大量死亡的現(xiàn)象，給養(yǎng)殖戶造成較大損失。

2013年春夏之交，福建省羅源灣海區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚出現(xiàn)大面積內(nèi)臟白點(diǎn)癥狀，并發(fā)生死亡。病魚主要癥狀為離群、活力下降，體表及鰓無明顯異常，解剖可見脾臟呈暗紅色且有許多白色點(diǎn)狀結(jié)節(jié)，直徑約1 mm，病情嚴(yán)重的大黃魚肝、腎組織內(nèi)也有白色點(diǎn)狀結(jié)節(jié)。本文對(duì)該病大黃魚進(jìn)行了病原分離、鑒定，并就病原菌的藥物敏感性進(jìn)行了試驗(yàn)，旨在為該病的病原研究和有效防治提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)魚樣品

11尾患病大黃魚及9尾健康魚，平均體長(zhǎng)16 cm，于2013年2—5月采自羅源灣海區(qū)養(yǎng)殖網(wǎng)箱。回接感染試驗(yàn)用健康大黃魚，平均體重(50±5)g，于2015年4月取自羅源灣某養(yǎng)殖魚排。

1.2病原菌分離

取典型癥狀的患病大黃魚鰓及體表黏液在顯微鏡下進(jìn)行寄生蟲和真菌排查。同時(shí)，無菌操作分別從11尾患病大黃魚肝臟、腎臟、脾臟組織劃線分離于胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)平板，于24℃恒溫培養(yǎng)24 h，并以9尾健康大黃魚肝臟、腎臟、脾臟組織作細(xì)菌分離對(duì)照。純化菌株于胰蛋白胨大豆肉湯24℃培養(yǎng)16 h后，分裝并加20%甘油在-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3回接感染試驗(yàn)

將已純化菌株接種于TSA平板，25℃培養(yǎng)16 h后，用無菌超純水洗脫制備菌懸液，分別制成濃度1.0×105、1.0×104、1.0×103cfu/mL的菌懸液備用。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)試驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組，每組設(shè)立2個(gè)平行，每平行試驗(yàn)桶盛人工海水300 L和室內(nèi)暫養(yǎng)一周后的健康大黃魚15尾。采用腹腔注射相應(yīng)濃度的菌懸液進(jìn)行感染，對(duì)照組注射無菌超純水，注射劑量均為0.2 mL。水溫控制在(20±1)℃，期間充氧、不投餌、日常清污、補(bǔ)水，自注射后連續(xù)7日觀察、記錄各組的死亡數(shù)量，并對(duì)死魚進(jìn)行解剖和病原菌的再分離鑒定。

1.4病原菌形態(tài)觀察和生理生化鑒定

取純培養(yǎng)菌株接種于TSA平板上，24℃培養(yǎng)16～24 h，觀察菌落大小和形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色和鞭毛染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)特征。采用API 20NE細(xì)菌鑒定試劑條和傳統(tǒng)方法測(cè)定病原菌的理化特征[2]，參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行分類[3]。

1.516SrDNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

用百泰克細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)制備得模板DNA。應(yīng)用16SrDNA通用引物，正向27F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×PCR mix 24 μL，10 μmol/L的引物各1 μL，模板DNA 1 μL，超純水23 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃、2 min；95℃、35 s，50℃、35 s，72℃、90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃、5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)ABI 3730 DNA 測(cè)序儀雙向測(cè)序后，用DNAMAN 5.1對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行人工校正。

將分離菌的16SrDNA序列與GenBank中的已報(bào)道核酸序列進(jìn)行在線Blast分析，下載與該序列同源性較高的核酸序列，并參照LPSN(http：//www.bacterio.cict.fr/)獲得相關(guān)模式菌株的16SrDNA基因序列。

將上述序列使用Mega 4.0完成序列比對(duì)后，采用臨接法(NJ)(設(shè)定bootstrap replications=1 000)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6gyrB基因測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以上述菌株DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，運(yùn)用Yamamoto等報(bào)道的引物[4]，正向?yàn)镕：5’-CAGGAAACAGCTATGACCAYGSNGGNGGNA ARTTYR A-3’，反向R：5’-TGTAAAACGACGGC CAGTGCNGGRTCYTTYTCYTGRCA-3’。除退火溫度為60℃外，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹方法同1.5。

1.7藥敏試驗(yàn)

用杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)的藥敏紙片，按常規(guī)紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[5]。

2　結(jié)果與分析

2.1病魚檢查結(jié)果

病魚養(yǎng)殖海區(qū)水溫為16～24℃，病魚主要癥狀為離群、活力下降，體表及鰓無異常，解剖可見11尾大黃魚脾臟呈暗紅色且均有許多白色點(diǎn)狀結(jié)節(jié)內(nèi)生，直徑約小于1 mm，病情嚴(yán)重的大黃魚的肝、腎組織內(nèi)也有白色點(diǎn)狀結(jié)節(jié)。而9尾健康大黃魚無前述癥狀。將20尾魚通過水浸片觀察，均未檢出寄生蟲和真菌。

2.2分離菌株形態(tài)特征

從病魚的的肝臟、腎臟、脾臟分離得到形態(tài)、大小、顏色在TSA平板上均一致的優(yōu)勢(shì)菌24株，編碼為：dhy201301，dhy201302，……，dhy2013024，菌落特征為：圓形、邊緣齊整、表面光滑、濕潤(rùn)、呈米黃色，直徑1～2 mm。而9尾健康大黃魚相應(yīng)組織未分離得到細(xì)菌。

2.3回接感染試驗(yàn)結(jié)果

dhy201308菌對(duì)健康大黃魚均有致病性，從注射第五日起出現(xiàn)死亡，且死亡個(gè)體的脾臟、腎臟出現(xiàn)明顯的白色結(jié)節(jié)癥狀，少數(shù)個(gè)體肝臟也有出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)癥狀，這與自然發(fā)病情況完全相同。此外，從感染發(fā)病個(gè)體重新分離得到的菌株，其形態(tài)與生理生化特征和dhy201308菌株完全一致。由此可見，分離菌株是該病的直接病原?；亟痈腥窘Y(jié)果見表1，觀察期為7 d，分離菌經(jīng)腹腔注射感染的毒力很強(qiáng)，1.0×105組7 d內(nèi)100%死亡。

表1　分離菌株dhy201308的回接感染試驗(yàn)

2.4分離菌株的生理生化特征

dhy201301～24革蘭氏染色呈陰性，桿狀，端生鞭毛。采用API 20NE系統(tǒng)鑒定編碼為1150567(6株)、1050567(18株)，前者與變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)模式種FPC 951的對(duì)應(yīng)指標(biāo)[6-7]完全一致，后者與前者僅差精氨酸雙水解酶一個(gè)指標(biāo)。分離細(xì)菌的常規(guī)生理生化特性主要為氧化酶陽性，硝酸鹽還原陽性，利用葡萄糖、癸酸、蘋果酸、檸檬酸、苯乙酸，不產(chǎn)硫化氫，不產(chǎn)吲哚，明膠液化陰性，如表2。

表2　分離菌株的生理生化特性

注：“+”為陽性；“-”為陰性；“D”為菌株間差異。

Notes：+ indicated positive，-indicated negative，D indicated difference among strains.

2.516SrDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

獲得24株菌的16SrDNA序列24條，長(zhǎng)度約1 500 bp。將24條序列分別輸入GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果均顯示與假單胞菌屬中的變形假單胞菌(P.plecoglossicida)、惡臭假單胞菌(P.putida)、蒙氏假單胞菌(P.monteilii)同源率達(dá)99%。從比對(duì)結(jié)果列表中提取假單胞菌屬模式種及其他相關(guān)菌株的16SrDNA序列，以鮰愛德華菌(Edwardsiellaictaluri)為外群，構(gòu)建菌株dhy201308的系統(tǒng)發(fā)育樹。在16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株dhy201308(GenBank登錄號(hào)為KF934316)與假單胞菌屬惡臭群聚為一簇，而與變形假單胞菌(P.plecoglossicida)模式種(FPC 951=ATCC 700383=CCUG 49623=CIP 106493=DSM 15088=JCM 21584=NBRC 103162，GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)為AB009457.1)自然聚為一枝，表明它們親緣關(guān)系最近，將其初步鑒定為變形假單胞菌，如圖1。

圖1基于16S rDNA 序列構(gòu)建的菌株dhy201308 的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.1Phylogenetic tree of strain dhy201308 based on 16S rDNA sequences

2.6gyrB基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

獲得24株菌的gyrB基因序列24條，長(zhǎng)度約900 bp。將24條序列分別在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示24株菌的gyrB基因序列僅與變形假單胞菌同源率達(dá)99%。由此將24株菌鑒定為變形假單胞菌。在構(gòu)建的gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株dhy201308(GenBank登錄號(hào)為KF934317)與變形假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株自然聚為一枝，如圖2。

圖2基于gyrB 基因序列構(gòu)建的菌株dhy201308 的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.2Phylogenetic tree of strain dhy201308 based on gyrB sequences

2.7分離菌株的藥敏

體外抑菌試驗(yàn)的結(jié)果顯示，全部24菌株對(duì)強(qiáng)力霉素、諾氟沙星、恩諾沙星3種抗生素敏感；對(duì)奧氟沙星、左氟沙星、四環(huán)素3種抗生素中度敏感；對(duì)氟苯尼考等12種抗生素不敏感，如表3。

表3　分離菌株dhy201308的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表3

注：1.抑菌圈直徑包括藥敏紙片直徑7 mm；2.R(耐藥)：7 mm≤抑菌圈直徑≤14 mm；S(敏感)：抑菌圈直徑≥20 mm；I(中介)：15 mm≤抑菌圈≤19 mm。

Note：1.The inhibition zone include 7 mm of slips diameter，2.R(resistance)was 7 mm≤inhibition zone≤14 mm，S(sensitive)was inhibition zone≥20 mm，I(intermediate)was 15 mm≤inhibition zone≤19 mm.

3　討論

3.1大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)癥病原

大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)癥一直是水產(chǎn)業(yè)界關(guān)注的問題之一，許多學(xué)者對(duì)其病原進(jìn)行了分離研究。劉家富等認(rèn)為寧德地區(qū)大黃魚的內(nèi)臟白點(diǎn)癥是由門多薩假單胞菌(P.mendocina)和銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)引起的[8]，沈錦玉等從浙江省寧波、臺(tái)州的發(fā)病大黃魚中分離得病原，研究認(rèn)為惡臭假單胞菌(P.putida)是該病的病原[9]，邱楊玉等研究認(rèn)為浙江省寧波市象山港患病大黃魚的病原為惡臭假單胞菌(P.putida)[10]，但毛芝娟等對(duì)該菌的進(jìn)一步研究，將其鑒定為變形假單胞菌(P.plecoglossicida)，并通報(bào)了該菌的基因組草圖[11]。本文從患內(nèi)臟白點(diǎn)癥的大黃魚內(nèi)臟分離到24株菌，均為變形假單胞菌(P.plecoglossicida)，從同濃度細(xì)菌腹腔注射的試驗(yàn)結(jié)果比較，其致病性強(qiáng)于邱楊玉等研究的菌株。

3.2變形假單胞菌的鑒定

變形假單胞菌(P.plecoglossicida)是由Nishimori等從香魚出血性腹水病中分離并定種[7]，并被原核生物系統(tǒng)命名名錄(LPSN)收入?；诩賳伟鷮俚?6SrDNA序列進(jìn)化樹，其在伯杰氏手冊(cè)中被歸為惡臭假單胞菌群[3]。郭亞輝等認(rèn)為目前假單胞菌屬分類比較混亂，其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系有進(jìn)一步修正的可能[12]。由于同一種屬細(xì)菌內(nèi)的不同菌株之間的生理生化試驗(yàn)結(jié)果往往存在一定的差異，特別是模式種，因而從表型鑒定菌種易產(chǎn)生錯(cuò)誤。16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析從序列同源性的角度實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的分類學(xué)鑒定，但方法受細(xì)菌16SrDNA序列庫數(shù)據(jù)不完備的制約。故對(duì)細(xì)菌種類鑒定時(shí)宜用多元方法，如表型測(cè)定、16SrDNA分子鑒定、看家基因鑒定等，才能保證鑒定結(jié)果的可靠性。

本文所述24株菌，在16SrDNA序列比對(duì)過程中，剔除非模式菌株的干擾，初步鑒定為變形假單胞菌(P.plecoglossicida)，并通過生理生化、細(xì)菌形態(tài)等表型研究加以驗(yàn)證。為進(jìn)一步確定鑒定結(jié)果的可靠性，選擇對(duì)其看家基因gyrB進(jìn)行分子鑒定，通過序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定分離菌株為變形假單胞菌(P.plecoglossicida)。在該菌分子鑒定中，使用gyrB看家基因進(jìn)行鑒定比16SrDNA分子鑒定更加準(zhǔn)確。

3.3大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)癥的防治

假單胞菌廣泛存在于自然水體中，易存活在天然冰鮮餌料中。由于冰鮮餌料的加工過程是一個(gè)制備魚糜的過程，這就給假單胞菌提供了擴(kuò)散、活化、增殖的條件。這些混入餌料的假單胞菌，經(jīng)口攝入大黃魚體內(nèi)有可能造成大黃魚感染發(fā)病。針對(duì)該病的流行特點(diǎn)，在養(yǎng)殖過程，建議盡可能減少冰鮮餌料的投喂，改用人工配合飼料，并在實(shí)際生產(chǎn)中，及時(shí)檢查魚病發(fā)生情況，一旦發(fā)現(xiàn)該病，可參考使用強(qiáng)力霉素、諾氟沙星、恩諾沙星3種抗生素對(duì)大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)癥的防治，同時(shí)對(duì)病死魚及時(shí)處理，避免交叉感染。

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Isolation and identification of Pseudomonas plecoglossicida in large yellow croaker(Pseudosciaena crocea)of Fuzhou area

LIU Nianfeng，GUO Rui，JIANG Xiaobin，ZHANG Shanpi*，WANG Wei，ZHENG Chenhui，YANG Xiaoqiang

(Fuzhou Ocean and Fisheries Technology Center，F(xiàn)uzhou 350026，China)

The cultured large yellow croakers(Pseudosciaenacrocea)of Luoyuan Bay got white nodules disease at the end of spring and the beginning of summer in 2013.The pathogen was isolated from spleen，liver and kidney with significant pathological signs of fishes，then its morphological，physiological and biochemical characteristics，taxonomic status，and drug sensitivity were analyzed.The 16SrDNA sequences of the pathogen was more than 99% homology withPseudomonasplecoglossicidainP.putidagroup，the analysis of housekeeping genegyrBconfirmed its phylogenetic affiliation and showed identities more than 99% homology，which was also demonstrated by biochemical tests.The test result of the sensitivity to antibiotics showed that doxycycline，norfloxacin and enrofloxacin had the most inhibitive effects on the strains，while ofloxacins，levofloxacin and tetracycline had intermediate sensitive.

large yellow croaker(Pseudosciaenacrocea)；Pseudomonasplecoglossicida；16SrDNA；gyrB

2015-12-21

農(nóng)業(yè)部2013年國(guó)家水生動(dòng)物疫情監(jiān)測(cè)計(jì)劃——福建省刺激隱核蟲病監(jiān)測(cè)；福州市海洋與漁業(yè)局2013年水產(chǎn)養(yǎng)殖病害監(jiān)測(cè)專項(xiàng).

劉年鋒(1979-)，男，高級(jí)工程師，主要從事水生生物病害研究與技術(shù)推廣.E-mail：36099272@qq.com

張善霹(1969-)，男，高級(jí)工程師，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)研究.E-mail：309468990@qq.com

S941

A

1006-5601(2016)01-0014-07

劉年鋒，郭睿，江小斌，等.福州地區(qū)大黃魚變形假單胞菌的分離與鑒定[J].漁業(yè)研究，2016，38(1)：14-20.