嚴志洪

(莆田市秀嶼區(qū)水產技術推廣站，福建 莆田 351146)

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一例引起南日鮑死亡的病原分離與鑒定

嚴志洪

(莆田市秀嶼區(qū)水產技術推廣站，福建 莆田 351146)

觀察了一例南日鮑(Haliotis discusnanri)病鮑的癥狀，從病癥明顯的瀕臨死亡的南日鮑病鮑足部病灶區(qū)、消化腺中分離得到一株優(yōu)勢菌，并對該優(yōu)勢菌進行了浸浴感染和注射感染的回歸感染試驗、生理生化特征測定及藥敏試驗。結果表明：南日鮑發(fā)病初期，沒有明顯的癥狀，發(fā)病持續(xù)一段時間后足部表面有大小不一的潰爛孔；回歸感染試驗結果表明該優(yōu)勢菌為致病菌，經生化指標的測定，確定該致病菌為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)；該菌對氟甲喹和氟苯尼考等21種抗菌藥物敏感。本研究結果為南日鮑病害防治提供一些基礎數(shù)據(jù)。

南日鮑；溶藻弧菌；藥敏試驗

南日鮑( Haliotis discusnanri) 是以皺紋盤鮑(H.discushannai) 為母本、日本盤鮑(H.discusdiscus) 為父本雜交的后代，并在福建莆田南日島海域養(yǎng)殖[1]。由于獨特的自然環(huán)境條件，南日鮑具有體肥殼艷、煮后發(fā)胖的特色，因而深受廣大消費者的喜愛。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大及養(yǎng)殖密度的提高，南日鮑病害發(fā)生日趨嚴重。已有研究結果表明，病毒[2]、立克次體[3]、細菌[4]、真菌[5]、寄生蟲[6]等均能使鮑發(fā)病。在鮑的弧菌病方面，已報道的病原菌有哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)[4]、溶藻弧菌(V.alginolyticus)[7]、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)[7]和河流弧菌(V.fluvialis)[8]等，但對于南日鮑病害研究未見專題報道，本文對南日鮑病鮑進行病癥觀察、病原菌分離、回歸感染試驗、病原菌生化測定及藥敏試驗，其研究結果可為南日鮑病害防治提供一些基礎數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

南日鮑病鮑及用于回歸感染的健康鮑于2014年4月分別采自南日島的兩個鮑魚養(yǎng)殖場，前者為4.0～6.5cm殼長的病癥明顯的瀕臨死亡的南日鮑，后者為5.5～7.0cm殼長的無病癥、健康的南日鮑。

1.2方法

1.2.1病原菌分離培養(yǎng)

取上述病鮑，先用70%酒精消毒鮑的體表，再取鮑的足部病灶區(qū)和消化腺，稍剪碎，放在勻漿器中勻漿，后接種到硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(TCBS)及胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)上，倒置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中進行24h左右細菌培養(yǎng)(以長出菌落為準)，經劃線分離、純化培養(yǎng)后獲得一株優(yōu)勢菌，標記為201404-Ⅰ，擴大培養(yǎng)到一定數(shù)量后，用于以下的試驗。

1.2.2回歸感染試驗

取健康南日鮑，放置于16個盛有25L經沙過濾海水的塑料桶中，每桶10只，水溫保持在26℃，連續(xù)充氣，根據(jù)水質狀況每天適當換水。待鮑正?；顒印z食后，開始進行感染試驗，回歸感染試驗包括浸浴感染試驗和注射感染試驗。

浸浴感染試驗是將上述純化后擴大培養(yǎng)的細菌用無菌海水稀釋計數(shù)(血球計數(shù)板直接計數(shù))后加入桶中，設置細菌濃度為1.5×108、1.5×107和1.5×106cfu/mL三個試驗組和一個對照組，每組設兩個平行組，浸浴24h后移入盛有25L沙濾海水的塑料桶中在自然溫度下飼養(yǎng)觀察10d。

注射感染試驗設置注射的菌液濃度分為1.5×109、1.5×108和1.5×107cfu/mL三個試驗組，每只鮑注射0.1mL，以注射0.1mL生理鹽水作為對照組，每組設兩個平行組，在自然溫度下繼續(xù)飼養(yǎng)觀察10d。

在上述的浸浴感染和注射感染試驗中，取瀕臨死亡鮑的足部病灶及消化腺進行病原菌再分離。

1.2.3細菌鑒定及藥敏試驗

采用法國生物-梅里埃的ID32E試劑條和杭州微生物試劑有限公司生產的革蘭氏染色液、氧化酶試驗試劑進行生理生化特征的測定；藥敏試驗采用ATBVET試劑條、ATBG-5試劑條和杭州微生物試劑有限公生產的弧菌抑制劑0/129及氟苯尼考藥敏紙片，按說明書進行測定。

2　結果

2.1病鮑癥狀

現(xiàn)場觀察，病鮑發(fā)病初期，沒有明顯的癥狀，發(fā)病持續(xù)一段時間后足部表面有大小不一的潰爛孔。發(fā)病水溫為22℃以上。

2.2細菌分離培養(yǎng)及形態(tài)特征

經劃線分離、純化培養(yǎng)后獲得201404-Ⅰ菌株，該菌經26℃恒溫培養(yǎng)24h后，在TCBS平板上菌落為黃色、圓形、中間略凸、濕潤；在TSB平板上的菌落略顯透明、無色、濕潤。26℃恒溫培養(yǎng)時，TCBS平板上菌落的生長速度比TSA平板上的快。

2.3回歸感染試驗

表1為回歸感染結果，在浸泡感染試驗中，感染1d后各試驗組均沒有死亡，試驗結束時，1.5×108cfu/mL試驗組的死亡率為10%，其余各試驗組均沒有死亡，感染率隨著浸泡濃度的增加而上升，病鮑表現(xiàn)的癥狀為足部肌肉發(fā)白、出現(xiàn)水泡后潰爛。在注射感染試驗中，注射劑量1.5×108cfu/ind試驗組及1.5×107cfu/ind試驗組感染1d后死亡率分別為10%和5%，注射劑量為1.5×106cfu/ind試驗組感染1d后無死亡，感染1～4d后死亡的個體沒有任何癥狀，第5天開始死亡的個體出現(xiàn)水泡潰爛等癥狀，死亡率和感染率隨注射劑量的增加而增加。注射感染引起南日鮑死亡速度快于浸泡感染。

表1　不同濃度的菌株201404-Ⅰ感染南日鮑的結果

在浸浴感染和注射感染試驗后的瀕死的南日鮑足部及消化腺中再次分離得到一種菌，標記為201404-Ⅱ，菌落形態(tài)與201404-Ⅰ相同?；貧w感染結果證實菌株201404-Ⅰ為引起南日鮑死亡的病原菌。

2.4細菌鑒定

經觀察，201404-Ⅰ和201404-Ⅱ為革蘭氏陰性桿菌，極端具有單鞭毛，對弧菌抑制劑0/129表現(xiàn)敏感。

表2為生化測定結果，菌株201404-Ⅰ和201404-Ⅱ生化特征相同，根據(jù)這些生化特征，按照法國生物-梅里埃全自動細菌鑒定儀的鑒定方法，判定這兩株菌為溶藻弧菌，可信度為 99.9%。

表2　菌株201404-Ⅰ和201404-Ⅱ生化特征

注：“+”為陽性；“-”為陰性。

Note：+indicatedpositive，-indicatednegative.

2.5藥敏試驗

本次試驗對菌株201404-Ⅰ進行了43種抗菌藥物抑菌試驗，菌株201404-Ⅰ對阿莫西林、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢吡肟、大觀霉素、依氟沙星、安普霉素、利福平、阿莫西林、克拉維酸、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢西丁、頭孢他啶、奧索利酸、妥布霉素、慶大霉素、阿米卡星、奈替米星、氟甲喹、卡那霉素、呋喃妥因、氟苯尼考等21種藥物敏感，結果如表3所示。

表3　菌株201404-Ⅰ的藥敏試驗結果

注：“S”為敏感；“R”為耐藥。

Note：Sindicatedsensitive，Rindicatednosensitive.

3　討論

南日鮑感染溶藻弧菌后的癥狀，與閩南沿海養(yǎng)鮑場由哈維氏孤菌引起的鮑潰爛病[4]及由河流孤菌引起的皺紋盤鮑膿皰病癥狀[8]相似，三者病鮑足部均出現(xiàn)水泡、潰爛等癥狀，但致病菌不同，可見不同地區(qū)、不同的鮑種類雖然病癥相同，但病因存在明顯的差異，有多種病因可引起鮑魚足部潰爛，在生產上必須進行嚴格區(qū)分，做到對癥下藥。

溶藻弧菌為條件性致病菌，可引起多種養(yǎng)殖種類暴發(fā)弧菌病，其致病性與養(yǎng)殖品種的抗病力及養(yǎng)殖的環(huán)境條件有關[9]，近幾年來南日鮑弧菌病的暴發(fā)可能與養(yǎng)殖海區(qū)水質惡化、養(yǎng)殖密度過高及種質退化有關。

引起東山九孔鮑(H.diversicolor supertexta)發(fā)病的溶藻弧菌對鏈霉素和氯霉素敏感[7]；引起大黃魚(Pseudosciaena crocea)潰瘍病的溶藻弧菌對復方新諾明、慶大霉素敏感[9]；本次試驗進行了43種抗菌藥物對溶藻弧菌的抑菌試驗，得出了溶藻弧菌對慶大霉素敏感而對鏈霉素、氯霉素和復方新諾明不敏感的結論。可見在不同地區(qū)及不同養(yǎng)殖品種，同一種的病原菌對抗菌藥具有不一樣的敏感性，在生產上治療南日鮑弧菌病時，必須每次進行藥敏試驗，篩選出適宜的敏感性藥物。

本次試驗共篩選出阿莫西林-哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢吡肟、大觀霉素、依氟沙星、安普霉素、利福平、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林、他唑巴坦、頭孢西丁、頭孢他啶、奧索利酸、妥布霉素、慶大霉素、阿米卡星、奈替米星、氟甲喹、卡那霉素、呋喃妥因、氟苯尼考等21種敏感藥物，但根據(jù)目前我國漁藥使用的相關標準及法規(guī)[10]，在這21種敏感藥物中生產上允許使用的藥物僅有氟甲喹和氟苯尼考兩種。

[1]石賢愛，張利，劉震.南日鮑β-葡萄糖苷酶分離純化及表征[J].福州大學學報：自然科學版，2014，42(3)：480-485.

[2]王軍，蘇永全，張蕉南，等.春季東山九孔鮑暴發(fā)性病害研究[J].廈門大學學報：自然科學版，1999，38(5)：1-4.

[3]OtsuR，SasakiK.Virus-likeparticlesdetectedfromjuvenileabalones(Nordotis discus discus)rearedwithanepizooticfatalwastingdisease[J].JournalofInvertebratePathology，1997，70(2)：167-168.

[4]陳月忠，黃萬紅，蔡清海.閩南地區(qū)鮑潰爛病的研究[J].福建水產，2008，12(4)：31-37.

[5]畑井喜司雄.蓄養(yǎng)フヮヒかケ分離きゎた Haliphthoros milfordensis につぃて[J].魚病研究，1982，17(3)：199-204.

[6]Lester，RJG，Davis，GHG.AnewPerkinsusSpecies(Apicomplexa，Perkinsea)fromtheabaloneHaliotis rubber [J].JournalofInvertebratePathology，1981，37(2)：181-187.

[7]張朝霞，王軍，張蕉南，等.東山九孔鮑細菌性疾病研究[J].臺灣海峽，2001，20(2)：193-198.

[8]聶麗平，劉金屏，李太武，等.皺紋盤鮑膿皰病的防治方法初探[J].海洋科學，1995，(5)：4-5.

[9]鄭天倫，王國良，金珊，等.養(yǎng)殖大黃魚潰瘍病的病原菌及其防治藥物研究[J].南方水產，2006，2(1)：5-10.

[10]孟思妤，孟長明，陳昌福.抗生素類漁藥的問題與對策(一) [J].科學養(yǎng)魚，2010，(6)：77.

Isolation and identification of a pathogen from Haliotis discus nanri

YAN Zhihong

(PutianXiuyuAquacultureTechnicalPromotionStation，Putian351146，China)

TheoccurrenceofdiseaseisbecomingmoreandmoreseriouswiththeexpansionofHaliotis discusnanribreedingscale，butsofarnospecialreportsfocusontheresearchofthesediseases.InordertoprovidesomebasicinformationfordiseasepreventionandcontrolofH. discusnanri，adominantbacteriastrainwasisolatedfromthefootlesionsanddigestiveglandofobviouslydyingindividualswhichwereshowingovertsymptomsandprovedtobethepathogenbyrecurrentinfectionexperiment.Thediseasesymptomofthepathogenicbacteriawasobservedcarefullywhilebiochemicalcharacteristicsanddrugsusceptibilitytestofthepathogenicbacteriawerealsodetectedseparately.Itturnedoutthatthediseasesymptomwasnotsignificantlyattheinitialstage，andfesteringholesofdifferentsizescouldbejustfoundonthefootofH.discusnanriafteraperiodoftime.TheresultsofphysiologicalandbiochemicalanalysesshowedthepathogenwasVibrio alginolyticuswhichwassensitiveto21kindsofantibioticssuchasflumequineandflorfenicolandsoon.IthighlyrecommendthatdrugsensitiveexperimentshouldbenecessarytocarryouteverytimewiththepurposeofscreeningouttheappropriateeffectivedrugstopreventandcontroltheV. alginolyticusinH. discusnanriproductionprocess.

Haliotis discusnanri；Vibrio alginolyticus；drugsusceptibilitytests

2015-06-15

莆田市科技局項目(2014N07).

嚴志洪(1967-)，男，大學本科，高級工程師，主要從事水產養(yǎng)殖技術推廣與海水增養(yǎng)殖研究.Tel：0594-5860865.E-mail：13850289126@126.com

S944.4

A

1006-5601(2016)01-0021-06

嚴志洪.一例引起南日鮑死亡的病原分離與鑒定[J].漁業(yè)研究，2016，38(1)：21-26.