王　慶,劉瓊瑜，李益祺，劉雅莉，李　玉，陳嘉興，張海發(fā)，李水生，張　勇，，林浩然，3*

(1.中山大學(xué)水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究所暨廣東省水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510275；2.廣東省海洋漁業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，廣東 惠州 516081；3.海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南 ?？?570228)

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Nesfatin-1調(diào)控斜帶石斑魚(yú)生殖作用的研究

王慶1,劉瓊瑜1，李益祺1，劉雅莉1，李玉1，陳嘉興1，張海發(fā)2，李水生1，張勇1，2，林浩然1，3*

(1.中山大學(xué)水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究所暨廣東省水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510275；2.廣東省海洋漁業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，廣東 惠州 516081；3.海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南 海口 570228)

Nesfatin-1是核連蛋白-2(nucleobindin-2，NUCB2)裂解后產(chǎn)生的一種神經(jīng)肽。本研究克隆得到斜帶石斑魚(yú)兩種編碼NUCB2(NUCB2a和NUCB2b)基因的cDNA序列(nesfatin-1a和nesfatin-1b)，并對(duì)它們的表達(dá)模式進(jìn)行了研究。結(jié)果表明nesfatin-1a和nesfatin-1b在腦組織中廣泛表達(dá)。在下丘腦中，兩種nesfatin-1在卵巢發(fā)育的Ⅰ-Ⅴ時(shí)期表達(dá)量都比較低，在Ⅵ時(shí)期卵巢(退化的卵黃生成階段的卵母細(xì)胞)中的表達(dá)量顯著升高，揭示nesfatin-1可能參與了卵巢成熟的調(diào)控。進(jìn)一步采用腹腔注射實(shí)驗(yàn)研究了兩種nesfatin-1對(duì)生殖軸的影響。注射nesfatin-1a和nesfatin-1b 15 min和60 min后，下丘腦中促性腺激素釋放激素Ⅰ型(GnRH-Ⅰ)和促性腺激素釋放激素Ⅲ型(GnRH-Ⅲ)的表達(dá)量都顯著下降；此外，垂體中FSH-β的表達(dá)在注射nesfatin-1 60 min后顯著下調(diào)。這些結(jié)果表明nesfatin-1a和nesfatin-1b參與了斜帶石斑魚(yú)下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)的調(diào)控。

斜帶石斑魚(yú)； nesfatin-1；組織分布；生殖調(diào)控

Nesfatin-1(NEFA/NUCB2 encoded satiety and fat-influencing protein)是由核連蛋白-2(nucleobindin-2，NUCB2)裂解后產(chǎn)生的一種含82個(gè)氨基酸的厭食肽[1]。在人類(lèi)和小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，前體肽NUCB2由24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和396個(gè)氨基酸的蛋白組成[2-3]。NUCB2經(jīng)激素原轉(zhuǎn)化酶剪切成nesfatin-1(1-82)、nesfatin-2(85-163)、nesfatin-3(166-396)三個(gè)片段，其中nesfatin-1本身又可以分為3個(gè)片段，第23～53氨基酸片段稱(chēng)為M30，是nesfatin-1發(fā)揮作用的關(guān)鍵片段[4]。Nesfatin-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)如弓狀核(arcuate nucleus，ARC)、下丘腦外側(cè)區(qū)(lateral hypothalamic area，LHA)、室旁核(virtual private network，PVN)、視上核(supraoptic nuclei，SON)及外周組織如心肌、胃、胰腺、肝、小腸、睪丸等表達(dá)[5-11]，提示該神經(jīng)肽具有廣泛的生理作用。

隨著對(duì)nesfatin-1研究的深入，發(fā)現(xiàn)nesfatin-1在攝食調(diào)控、能量代謝[12]、胰島素調(diào)節(jié)[13]、血壓調(diào)節(jié)[14]、脂肪細(xì)胞調(diào)控[8]等多方面發(fā)揮作用。而且，nesfatin-1在鼠的睪丸及卵巢中有表達(dá)[7]，提示nesfatin-1可能參與生殖調(diào)控。Nesfatin-1編碼基因已經(jīng)在金魚(yú)[3]、斑馬魚(yú)[15]、齊口裂腹魚(yú)[16]等魚(yú)中克隆得到。在金魚(yú)中的研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射nesfatin-1抑制GnRH和GtH的mRNA表達(dá)，揭示其參與了生殖調(diào)控[17]。斜帶石斑魚(yú)(Epinepheluscoioides)是我國(guó)南方重要的海水魚(yú)類(lèi)，是一種雌雄同體先雌后雄的魚(yú)，生殖發(fā)育具有其明顯的調(diào)控特點(diǎn)。

在本研究中，我們?cè)谛睅唪~(yú)中克隆得到兩種NUCB2基因并獲得了兩種nesfatin-1的氨基酸序列。組織表達(dá)模式研究表明兩種nesfatin-1均在腦和性腺中表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)nesfatin-1在卵巢退化期表達(dá)量最高，腹腔注射nesfatin-1顯著下調(diào)GnRH-Ⅰ、GnRH-Ⅲ和FSH-β的表達(dá)，表明nesfatin-1對(duì)斜帶石斑魚(yú)下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)具有調(diào)控作用。

1　材料與方法

1.1樣品采集

1.1.1克隆和組織分布的樣品采集

本實(shí)驗(yàn)所用斜帶石斑魚(yú)來(lái)自廣東省海洋漁業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，體重在700～750 g之間的魚(yú)，采用循環(huán)過(guò)濾海水在25～30℃條件下養(yǎng)殖。取樣前，對(duì)魚(yú)進(jìn)行麻醉處理，取不同分區(qū)的腦組織和外周組織，放入液氮中進(jìn)行速凍處理，然后保存在-80℃超低溫冰箱備用。取樣時(shí)所用的剪刀、鑷子等均經(jīng)過(guò)180℃烘烤4 h以上，存放樣品的1.5 mL離心管采用不含有RNA酶的進(jìn)口離心管。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照中山大學(xué)動(dòng)物研究倫理委員會(huì)對(duì)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)所做的規(guī)章制度進(jìn)行操作。

1.1.2卵巢不同發(fā)育時(shí)期樣品采集

不同時(shí)期斜帶石斑魚(yú)樣本均取自廣東省海洋漁業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，采用車(chē)間循環(huán)水養(yǎng)殖。卵巢發(fā)育根據(jù)成熟程度劃分為6期，每個(gè)發(fā)育時(shí)期的魚(yú)都選取5條，取下丘腦于凍存管(無(wú)RNA酶)中，放入液氮中速凍再轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱備用。性腺樣本用石蠟包埋后切片，在光學(xué)顯微鏡下判斷性腺發(fā)育時(shí)期。

1.1.3腹腔注射實(shí)驗(yàn)的樣品采集

腹腔注射實(shí)驗(yàn)所用斜帶石斑魚(yú)來(lái)自廣東省海洋漁業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，60條體重600～700 g、體長(zhǎng)30～35 cm的魚(yú)。飼養(yǎng)在室內(nèi)海水池中并馴化兩周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)用魚(yú)分成三組，每組20條，分別注射生理鹽水、nesfatin-1a、nesfatin-1b，注射劑量為50 ng/g體重，注射15 min后，各組隨機(jī)取10條魚(yú)，取樣下丘腦和垂體，其余10條個(gè)體60 min后取樣下丘腦和垂體。

1.2方法和處理

1.2.1引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上的NUCB2序列和已有斜帶石斑魚(yú)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)分析，找出兩種斜帶石斑魚(yú)NUCB2的序列并命名為NUCB2a和NUCB2b。利用軟件primer premier 5.0設(shè)計(jì)斜帶石斑魚(yú)NUCB2克隆和RT-PCR的特異性引物。具體引物序列如表1所示。

1.2.2RNA提取及cDNA模版的制備

總RNA的提取采用Trizol reagent說(shuō)明書(shū)及操作步驟來(lái)進(jìn)行，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，用于基因克隆(polymerase chain reaction，PCR)和實(shí)時(shí)定量PCR(real time-polymerase chain reaction，RT-PCR)。

1.2.3NUCB2基因的克隆與分析

用反轉(zhuǎn)錄出來(lái)的cDNA為模板，以NUCB2a和NUCB2b的簡(jiǎn)并引物(NUCB2-F和NUCB2-R)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)克隆NUCB2a和NUCB2b的全長(zhǎng)序列。瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后將目的條帶回收，用E.Z.N.A Plasmid Extraction Kit(Omega Bio-Tek公司，USA)對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化和菌液驗(yàn)證，將驗(yàn)證后的菌液送至廣州英駿公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果出來(lái)后，NUCB2的氨基酸序列利用BioEdit軟件翻譯，NUCB2蛋白序列的多重比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析使用Clustal W1.83和MEGA 5.0軟件進(jìn)行，并通過(guò)網(wǎng)站SignalP 4.1 server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)NUCB2的信號(hào)肽。

1.2.4實(shí)時(shí)定量PCR及數(shù)據(jù)分析

采用上述方法提取樣品總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為RT-PCR模板，同時(shí)提取標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)用于RT-PCR，選取β-actin 作為內(nèi)參基因。選用SYBR Green Realtime PCR Master Mix plus kit(TOYOBO公司，Japan)試劑盒進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)。反應(yīng)程序?yàn)椋合?5℃預(yù)變性4 min；接著95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán);最后在84℃收集熒光。分析溶解曲線(xiàn)，確定RT-PCR的質(zhì)量，用Excel表格初步處理數(shù)據(jù)，再利用Graphpad Prism5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

表1　PCR及qt-PCR引物的設(shè)計(jì)

2　結(jié)果與分析

2.1斜帶石斑魚(yú)nesfatin-1氨基酸比對(duì)及與其它脊椎動(dòng)物相似性分析

本研究中，我們克隆得到兩種NUCB2基因(分別命名為NUCB2a和NUBC2b)，編碼兩種nesfatin-1肽段(nesfatin-1a和nesfatin-1b)，分別為115個(gè)氨基酸(aa)和106個(gè)氨基酸(aa)(圖1a)。在NUCB2a和NUCB2b的nesfatin-1區(qū)域氨基酸序列的N-末端是31aa和23aa的信號(hào)肽，30aa(M30)的核心肽序列以及兩個(gè)由賴(lài)氨酸和精氨酸殘基構(gòu)成的蛋白水解酶切割位點(diǎn)(Lys114-Arg115和Lys105-Arg106)(圖1a)。

不同物種nesfatin-1的氨基酸序列對(duì)比顯示，斜帶石斑魚(yú)nesfatin-1a氨基酸序列與三刺魚(yú)nesfatin-1a的相似性最高(92%)，與其它魚(yú)類(lèi)如紅鰭東方鲀、斑馬魚(yú)、金魚(yú)等相似性在80%以上，而與哺乳類(lèi)的相似性較低(57%～64%)。nesfatin-1b氨基酸序列同樣與三刺魚(yú)nesfatin-1b的相似性最高(90%)，與斑馬魚(yú)、金魚(yú)相似性在70%以上，而與哺乳類(lèi)如牛、鼠、人的相似性只有50%左右如圖1b所示。

圖2所示，斜帶石斑魚(yú)與某些典型的哺乳類(lèi)、爬行類(lèi)、兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)NUCB2的nesfatin-1區(qū)域氨基酸序列所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，斜帶石斑魚(yú)的nesfatin-1a聚集在硬骨魚(yú)類(lèi)的分支上。斜帶石斑魚(yú)nesfatin-1a與三刺魚(yú)的nesfatin-1a的關(guān)系最近，與斑馬魚(yú)的的關(guān)系次之，而與哺乳類(lèi)的關(guān)系較遠(yuǎn)。魚(yú)類(lèi)nesfatin-1b聚集成一個(gè)分支，與魚(yú)類(lèi)nesfatin-1a及哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)、兩棲類(lèi)的nesfatin-1分開(kāi)。斜帶石斑魚(yú)的nesfatin-1b與三刺魚(yú)的nesfatin-1b的關(guān)系最近而與哺乳類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 a.斜帶石斑魚(yú)NUCB2a 和NUCB2b 的nesfatin-1 區(qū)域氨基酸序列比對(duì)，b.典型脊椎動(dòng)物NUCB2 蛋白質(zhì)nesfatin-1 區(qū)域氨基酸序列比對(duì)

Fig.1 Alignment of the nesfatin-1 region amino acid sequence of NUCB2 protein sequences a：NUCB2a andNUCB2b of E.coioides，b：Alignment of E.coioides nesfatin-1 region amino acid sequence of NUCB2 proteinsequences with other species

注：實(shí)線(xiàn)方框表示M30序列； 虛線(xiàn)方框表示蛋白質(zhì)水解酶切割位點(diǎn)；底下畫(huà)虛線(xiàn)表示信號(hào)肽；有顏色的表示物種之間的保守區(qū)域；物種名字和這些物種的GenBank(www.ncbi.nim.nih.gov) 登記號(hào)碼或者 Ensembl(www.ensembl.org)身份號(hào)碼如下：斜帶石斑魚(yú)(Epinepheluscoioides) NUCB2a和NUCB2b；金魚(yú)Carassiusauratus(NUCB2：GenBank：ADK94363.1)，斑馬魚(yú)Daniorerio(NUCB2A：NCBI No. NP_958901.1 and NUCB2B：NCBI No. NP_958887.1)，青鳉Oryziaslatipes(NUCB2A：NCBI No. XP_004067067.1 and NUCB2B GenBank No. ENSORLP00000001612)，紅鰭東方鲀Takifugurubripes(NUCB2A：GenBank No.ENSTRUP00000044315)，青斑河豚Tetraodonnigroviridis(NUCB2A，ENSTNIP00000012254)，三刺魚(yú)Gasterosteusaculeatus( ENSGACP00000016912；NUCB2A，ENSGACP00000020611 and NUCB2B，ENSGACP00000008999)，非洲蟾蜍Xenopustropicalis(NUCB2：NCBI No. NP_001015824.1)，雞Gallusgallus(NUCB2：NCBI No. NP_001006468.1)，牛Bostaurus(NUCB2：NCBI No. NP_001068849.1)，鼠Musmusculus(NUCB2：NCBI No. NP_001123951.1)，人Homosapiens(NUCB2：NCBI No. NP_005004.1).

圖2斜帶石斑魚(yú)NUCB2a 和NUCB2b nesfatin-1 區(qū)域與其它物種的進(jìn)化樹(shù)分析

Fig.2Phylogenetic tree illustrating the relationship between E.coioides NUCB2a and NUCB2b with those ofother species NUCB2

注：用于進(jìn)化樹(shù)分析的物種名稱(chēng)和基因庫(kù)的登記號(hào)碼如下：斜帶石斑魚(yú)(Epinepheluscoioides) NUCB2a和NUCB2b；金魚(yú)Carassiusauratus(NUCB2：GenBank：ADK94363.1)，斑馬魚(yú)Daniorerio(NUCB2A：NCBI No.NP_958901.1 and NUCB2B：NCBI No. NP_958887.1)，青鳉Oryziaslatipes(NUCB2A：NCBI No. XP_004067067.1 and NUCB2B GenBank No. ENSORLP00000001612)，紅鰭東方鲀Takifugurubripes(NUCB2A：GenBank No.ENSTRUP00000044315)，青斑河豚Tetraodonnigroviridis(NUCB2A，ENSTNIP00000012254)，三刺魚(yú)Gasterosteusaculeatus( ENSGACP00000016912 and NUCB2A，ENSGACP00000020611；NUCB2B，ENSGACP00000008999)，非洲蟾蜍Xenopustropicalis(NUCB2：NCBI No. NP_001015824.1)，雞Gallusgallus(NUCB2：NCBI No. NP_001006468.1)，牛Bostaurus(NUCB2：NCBI No. NP_001068849.1)，鼠Musmusculus(NUCB2：NCBI No. NP_001123951.1)，人Homosapiens(NUCB2：NCBI No. NP_005004.1).

2.2nesfatin-1在斜帶石斑魚(yú)中的組織分布表達(dá)模式

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了nesfatin-1a和nesfatin-1b在斜帶石斑魚(yú)不同組織中mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示。 Nesfatin-1a和nesfatin-1b都在腦組織中有廣泛的表達(dá)。同時(shí)在外周組織也有一定的表達(dá)，如nesfatin-1a在外周組織脾臟中的表達(dá)量高而在腸、鰓、心中的表達(dá)量較低，nesfatin-1b則是在肝臟中表達(dá)量較高，但是在脾臟、腸、鰓等組織表達(dá)量極低。

圖3斜帶石斑魚(yú)nesfatin-1a 和nesfatin-1b 在不同組織中的表達(dá)模式

Fig.3Tissue distribution of nesfatin-1a and nesfatin-1b of E. coioides

注：所有數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SEM)來(lái)表示。

2.3Nesfatin-1在卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

在下丘腦中，nesfatin-1a在卵巢發(fā)育的Ⅰ-Ⅴ 時(shí)期表達(dá)量都比較低，在下丘腦中，nesfatin-1a在卵巢發(fā)育的Ⅰ- Ⅴ 時(shí)期表達(dá)量都比較低，且Ⅰ、Ⅲ 時(shí)期的表達(dá)量要高于Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ 時(shí)期，但在Ⅵ 時(shí)期顯著升高。 同樣，nesfatin-1b的表達(dá)量在Ⅰ-Ⅴ 時(shí)期比較低且呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，到第Ⅵ 時(shí)期表達(dá)量顯著升高(圖4)。

圖4斜帶石斑魚(yú)nesfatin-1a 和nesfatin-1b 在卵巢發(fā)育不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)水平

Fig.4Levels of mRNA expression for nesfatin-1a and nesfatin-1b during ovary development in E.coioides

注：所有數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SEM)來(lái)表示。

2.4腹腔注射試驗(yàn)中nesfatin-1對(duì)GnRH和GtH表達(dá)模式

如圖5所示，注射nesfatin-1a 15 min和60 min后下丘腦GnRH-Ⅰ和GnRH-Ⅲ的表達(dá)顯著性下降；同樣注射nesfatin-1b在15 min和60 min后顯著抑制下丘腦GnRH-Ⅰ和GnRH-Ⅲ的表達(dá)。注射nesfatin-1a 15 min后對(duì)垂體LH-β及FSH-β的表達(dá)沒(méi)有影響，60 min后顯著地抑制了FSH-β的表達(dá)；注射nesfatin-1b 15 min后對(duì)垂體LH-β及FSH-β的表達(dá)沒(méi)有影響，注射60 min后顯著抑制了FSH-β的表達(dá)。

圖5腹腔注射試驗(yàn)中斜帶石斑魚(yú)GnRH 和GtH 的表達(dá)模式

Fig.5Expression pattern of the E. coioides GnRH and GtH in intraperitoneal injection test

注：Control：對(duì)照組；nesfatin-1a：注射nesfatin-1a多肽組；nesfatin-1b：注射nesfatin-1b多肽組。GnRH和GtH mRNA相對(duì)表達(dá)水平用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SEM)表示(n=10)；*表示與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。

3　討論

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)和實(shí)驗(yàn)室研究組已有的斜帶石斑魚(yú)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的比對(duì)分析結(jié)果可知，在斜帶石斑魚(yú)中克隆得到兩種NUCB2基因序列NUCB2a和NUCB2b。它們產(chǎn)生的nesfatin-1(nesfatin-1a和nesfatin-1b)的氨基酸序列與魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)、哺乳類(lèi)的成熟肽結(jié)構(gòu)相似。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明斜帶石斑魚(yú)的NUCB2a與魚(yú)類(lèi)的NUCB2a聚集在一起，而NUCB2b聚集在一支，其他的脊椎動(dòng)物聚集在一支。相似性分析表明，斜帶石斑魚(yú)nesfatin-1a和nesfatin-1b均與其它魚(yú)類(lèi)nesfatin-1的相似性較高，與哺乳類(lèi)的相似性則比較低。前人對(duì)nesfatin-1三個(gè)潛在的片段(N-末端的N23區(qū)，C-末端的C29區(qū)和中心的M30區(qū))分析發(fā)現(xiàn)中間的M30區(qū)域是nesfatin-1的主要功能區(qū)域[18]。通過(guò)比較斜帶石斑魚(yú)nesfatin-1a和nesfatin-1b的M30區(qū)域發(fā)現(xiàn)這個(gè)區(qū)域的氨基酸高度保守。此外，斜帶石斑魚(yú)nesfatin-1a和nesfatin-1b都有由兩個(gè)潛在的賴(lài)氨酸和精氨酸殘基構(gòu)成的蛋白水解酶切割位點(diǎn)(Lys114-Arg115和Lys105-Arg106)，表明在斜帶石斑魚(yú)中M30肽段是主要的活性功能區(qū)域。

通過(guò)組織分布結(jié)果發(fā)現(xiàn)nesfatin-1a在腦、脾臟、胃、肌肉中表達(dá)比較豐富，而nesfatin-1b在腦、肝臟、肌肉中表達(dá)量比較多，且nesfatin-1a和nesfatin-1b在斜帶石斑魚(yú)腦組織和性腺中都有表達(dá)，這與金魚(yú)和齊口裂腹魚(yú)的組織分布相似[2][16]。Nesfatin-1a和nesfatin-1b在不同組織中的廣泛分布表明它們可能存在多方面的功能。在腦組織和性腺中的大量表達(dá)說(shuō)明nesfatin-1可能參與生殖調(diào)控。此外，nesfatin-1a在脾臟中表達(dá)量高，這可能與斜帶石斑魚(yú)的血壓調(diào)節(jié)和免疫有關(guān)，哺乳動(dòng)物中也有過(guò)相關(guān)的研究報(bào)道[14][19]。而nesfatin-1b在垂體和肝臟中的表達(dá)量很高，垂體是魚(yú)類(lèi)生殖軸的重要組成部分[20]，而肝臟是調(diào)節(jié)攝食和能量代謝的重要器官，這說(shuō)明nesfatin-1b可能對(duì)卵巢發(fā)育和能量代謝起到了調(diào)控作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種nesfatin-1在腦組織中的表達(dá)量均豐富，這說(shuō)明nesfatin-1是個(gè)重要的神經(jīng)內(nèi)分泌因子。

在小鼠中的研究表明在雌鼠的青春期下丘腦中NUCB2/nesfatin-1的mRNA和蛋白水平顯著升高，腦腔注射nesfatin-1 15 min后會(huì)導(dǎo)致垂體LH-β水平下降[7]；在金魚(yú)中，nesfatin-1參與了金魚(yú)下丘腦-垂體-卵巢生殖軸的調(diào)控[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚(yú)腹腔注射nesfatin-1a和nesfatin-1b顯著下調(diào)GnRH-Ⅰ、GnRH-Ⅲ和FSH的表達(dá)。通過(guò)在卵巢不同發(fā)育時(shí)期對(duì)下丘腦中兩種nesfatin-1的表達(dá)量分析表明，兩種nesfatin-1都是在卵母細(xì)胞退化時(shí)期表達(dá)量很高，而斜帶石斑魚(yú)在卵母細(xì)胞退化階段FSH和LH的表達(dá)量顯著下降[22]。因此，nesfatin-1的大量表達(dá)可能對(duì)生殖軸產(chǎn)生抑制作用，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞退化。

4　結(jié)論

綜上所述，斜帶石斑魚(yú)nesfatin-1a和nesfatin-1b都參與了生殖軸的調(diào)控。nesfatin-1a和nesfatin-1b均抑制了下丘腦GnRH-Ⅰ、GnRH-Ⅲ和垂體FSH的表達(dá)，并且這種抑制作用是按照下丘腦-垂體-性腺軸從上往下進(jìn)行。同時(shí)，在卵巢發(fā)育過(guò)程中，兩種nesfatin-1都與卵母細(xì)胞的退化有關(guān)。

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The study of nesfatin-1 in Epinephelus coioides reproductive regulation

WANG Qing1，LIU Qiongyu1，LI Yiqi1，LIU Yali1，LI Yu1，CHEN Jiaxing1，ZHANG Haifa2，LI Shuisheng1，ZHANG Yong1，2，LIN Haoran1，3*

(1.Institute of Aquatic Economic Animals and Guangdong Provincial Key Laboratory for Aquatic Economic Animals，Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510275，China；2. Marine Fisheries Development Center of Guangdong Province，Huizhou 516081， China；3. College of Ocean，Hainan University， Haikou 570228，China)

Nesfatin-1 is the hypothalamus gene encoding nuclear protein-2(nucleobindin-2，NUCB2) produces a neuropeptide after cracking. Studies have shown that nesfatin-1 play an important role in reproductive regulation，in order to study the nesfatin-1 relation withEpinepheluscoioidesreproductive regulation，in this paper，we have cloned two NUCB2(NUCB2a and NUCB2b) gene，analyzes NUCB2 coding protein get sequence of amino acids about two nesfatin-1(nesfatin - 1a and nesfatin-1b)，at the same time，we analysis of the two kinds of nesfatin-1’s signal peptide and mature peptide，found it is consistent with that of vertebrates. Through real-time quantitative PCR technology，we determined the mRNA expression level ofEpinepheluscoioidesnesfatin-1 in different tissues. The expression patterns revealed that，nesfatin-1a and nesfatin-1b widely expressed in the brain tissue，especially nesfatin-1b abundantly expressed in the pituitary，also has the corresponding expression in the gonads. We determined thenesfatin-1 mRNA expression level of hypothalamus during ovary development，the result reveal that，nesfatin-1a and nesfatin-1b in the ovaries Ⅵ period(degradation of yolk formation stage oocytes) significantly increased，showed that two kinds of nesfatin-1 are likely to participate in the regulation of ovarian mature. The intraperitoneal injection experiment results show that，injecting nesfatin - 1a and nesfatin-1b 15 min，both GnRH1 and GnRH3 mRNA expression level of the hypothalamus are reduce，but in the pituitary LH-βand FSH -βmRNA expression level has not changed. Injection of nesfatin-1a and nesfatin-1b 60 min，the mRNA expression level of the hypothalamus GnRH1 and GnRH3 still suppressed. Injected nesfatin-1a and nesfatin-1b after 60 min，there have no effect change on the expression level of LH-β，but significantly reduced the expression of FSH -β. Through the above study shows nesfatin - 1a and nesfatin-1b involved inEpinepheluscoioidesreproductive regulation.

Epinepheluscoioides； nesfatin-1； tissue distribution； reproductive regulation

2016-01-15

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目，31572596；廣州市科技計(jì)劃珠江科技新星專(zhuān)項(xiàng),2013J2200093號(hào);廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專(zhuān)項(xiàng),A201400A01號(hào), A201501A03號(hào), A201501A09號(hào).

王慶(1988-), 博士研究生, E-mail:heicaonan@163.com

林浩然, 中國(guó)工程院院士, 教授, E-mail:lsslhr@mail.sysu.edu.cn

Q74，S917

A

1006-5601(2016)01-0005-09

王慶，劉瓊瑜,李益祺，等.Nesfatin-1調(diào)控斜帶石斑魚(yú)生殖作用的研究[J].漁業(yè)研究，2016，38(1)：5-13.