黃時(shí)海，盤慧群，黃廣上，吳建飛， 張溢峰， 白先放

(廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004)

?

響應(yīng)面法優(yōu)化促植物生長枯草芽孢桿菌CK15產(chǎn)芽孢條件

黃時(shí)海，盤慧群，黃廣上，吳建飛， 張溢峰， 白先放*

(廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004)

[目的]優(yōu)化枯草芽孢桿菌CK15的發(fā)酵條件，提高其芽孢產(chǎn)量。[方法]通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化碳源種類及濃度、氮源種類及濃度、無機(jī)鹽種類、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速、初始pH、溫度、接種量，采用Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出培養(yǎng)基中的顯著因素，再利用Box-Behnken試驗(yàn)確定3個(gè)因素的最佳濃度。[結(jié)果]在玉米粉10.7 g/L、豆粕粉24.4 g/L、CaCO37.4 g/L、NaCl 5.0 g/L、MnSO40.4 g/L、KH2PO41.0 g/L、裝液量50 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速為200 r/min、初始pH 7.2、溫度30 ℃、接種量2.0%條件下，芽孢產(chǎn)量達(dá)到7.4×109cfu/mL，比優(yōu)化前提高了80.49%。[結(jié)論]響應(yīng)面法有效提高了枯草芽孢桿菌CK15的芽孢產(chǎn)量。

枯草芽孢桿菌；芽孢；響應(yīng)面法

微生物肥料能夠增加土地肥力，凈化修復(fù)土壤，抑制植物對(duì)有害物質(zhì)的吸收，減少農(nóng)作物病蟲害發(fā)生，改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)[1]?？莶菅挎邨U菌是一類普遍存在于植物表面的革蘭氏陽性好氧型細(xì)菌，可產(chǎn)生耐熱抗逆性強(qiáng)的芽孢，對(duì)人畜無毒無害，不污染環(huán)境[2]。目前，世界上主要選用玉米粉、豆粕粉作為枯草芽孢桿菌發(fā)酵的碳源[3]和氮源[4]。Greene曾報(bào)道大量CaCO3能夠通過調(diào)節(jié)pH來強(qiáng)烈啟動(dòng)芽孢的生成[5]?？莶菅挎邨U菌的微生態(tài)制劑可以作為飼料或肥料的添加劑來防治動(dòng)物疾病和植物病害，制劑中活菌數(shù)是衡量其質(zhì)量的重要指標(biāo)[6]?？莶菅挎邨U菌在生物防治上的應(yīng)用報(bào)道很多[7-8]。微生態(tài)制劑中的活菌數(shù)會(huì)隨著其存放時(shí)間的延長而減少，最終影響其使用效果，而制成干粉劑型有利于微生物制劑的儲(chǔ)藏[9]。

響應(yīng)面法具有試驗(yàn)周期短、回歸方程精度高、可以研究多種因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)[10-13]。筆者以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，通過Plackett-Burman試驗(yàn)研究了影響枯草芽孢桿菌CK15的芽孢產(chǎn)量的顯著因子，然后通過最陡爬坡試驗(yàn)靠近最優(yōu)區(qū)域，最后根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)研究了最佳發(fā)酵條件，旨在為提高枯草芽孢桿菌的芽孢產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌種?？莶菅挎邨U菌BacillussubtilisCK15，由廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院保存。

1.1.2試驗(yàn)材料與試劑。糖蜜、木薯淀粉、麩皮、玉米粉、豆粕粉、玉米漿干粉、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、蛋白胨、尿素、硫酸銨、CaCO3、MgSO4、MnSO4、NaCl、KH2PO4、CaCl2、CuCl2均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L。碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L。氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖 5 g/L，NaCl 5 g/L。無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L。

1.2方法

1.2.1菌種活化。取斜面保藏菌種劃線至平板上，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)1 d。

1.2.2種子培養(yǎng)。用接種環(huán)從活化好的平板上刮取菌株，接種至裝有100 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在搖床上28 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h至對(duì)數(shù)期。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)。按2%的量接種至裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在搖床上28 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。

1.2.4芽孢檢測。取1 mL發(fā)酵液至EP管中，置于80 ℃恒溫水浴鍋中20 min，取出EP管冷卻至室溫，取0.1 mL發(fā)酵液至裝有0.9 mL無菌水的EP管中，用移液槍吹打混合均勻，然后再取0.1 mL稀釋好的發(fā)酵液0.1 mL至另一管裝有0.9 mL無菌水的EP管中，用移液槍吹打混合均勻，依次稀釋至合適濃度，取0.1 mL稀釋好的發(fā)酵液涂平板。將平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)[14]。

1.2.5單因素試驗(yàn)。研究碳源種類(蔗糖、糖蜜、可溶性淀粉、木薯淀粉、麩皮、葡萄糖、玉米粉)及篩選出的最佳碳源濃度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、氮源種類(豆粕粉、玉米漿干粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨)及篩選出的最佳氮源濃度(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%)、無機(jī)鹽種類(CaCO3、MgSO4、MnSO4、NaCl、KH2PO4、CaCl2、CuCl2)、裝液量(50、75、100、125、150 mL)、搖床轉(zhuǎn)速(140、160、180、200、220 r/min)、初始pH(6.8、7.0、7.2、7.4、7.6)、發(fā)酵溫度(26、28、30、32、34 ℃)、接種量(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%)對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響。

1.2.6Plackett-Burman試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以芽孢量(cfu/mL)為響應(yīng)值，選擇A(玉米粉)、B(豆粕粉)、D(KH2PO4)、E(CaCO3)、G(NaCl)、H(MnSO4)6個(gè)因素進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)，另設(shè)3個(gè)虛擬項(xiàng)作為誤差分析，每個(gè)因素取高(+1)、低(-1)2個(gè)水平。用minitab.V17.1.0軟件考察各個(gè)因素對(duì)芽孢產(chǎn)量的重要性，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1.2.7最陡爬坡試驗(yàn)。以Plackett-Burman 試驗(yàn)篩選出的顯著因素，用單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)步長，因素為正效應(yīng)步長遞增，負(fù)效應(yīng)步長遞減。其他因素取單因素最佳水平，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，接近芽孢產(chǎn)量最大值區(qū)域。

1.2.8Box-Behnken 試驗(yàn)。Box-Behnken 法可用于 2～5 個(gè)因素的優(yōu)化試驗(yàn)，每個(gè)因素取 3 個(gè)水平。根據(jù)試驗(yàn)表得到結(jié)果后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到帶交互項(xiàng)和平方項(xiàng)的二次多項(xiàng)回歸模型，對(duì)該模型進(jìn)行方差和回歸分析，在一定水平范圍內(nèi)得到芽孢產(chǎn)量的最佳值。用篩選出的影響芽孢產(chǎn)量最顯著的3個(gè)因素進(jìn)行三水平的中心組設(shè)計(jì)。根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)結(jié)果，對(duì)預(yù)測模型斜率是正值的因素，適當(dāng)提高其水平，斜率是負(fù)值的因素，適當(dāng)降低其水平，不顯著的單因素取單因素試驗(yàn)最佳值。

表1　Plackett-Burman 試驗(yàn)因素與水平

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果由圖1可知，以玉米粉為碳源，濃度為1%時(shí)芽孢產(chǎn)量最高；豆粕粉濃度為2%時(shí)，芽孢產(chǎn)量最高；過高過低的C/N都不利于芽孢的積累；CaCO3、MnSO4、KH2PO4、NaCl對(duì)芽孢產(chǎn)量影響顯著；裝液量為在50 mL、轉(zhuǎn)速為220 r/min時(shí)，芽孢產(chǎn)量最高，但與200 r/min時(shí)相比芽孢產(chǎn)量增幅不大，所以選擇200 r/min為最佳轉(zhuǎn)速；芽孢產(chǎn)量先增后減，當(dāng)pH為7.2、溫度為30 ℃、接種量為2%時(shí)芽孢產(chǎn)量最高。單因素試驗(yàn)只考慮各因素的最優(yōu)值，未考慮因素之間相互作用，所得發(fā)酵條件未必為最優(yōu)條件。

圖1　單因素對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響Fig.1　Effect of single factors on spore production yield

2.2Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果由表2可知，整個(gè)模型顯著，A(玉米粉)、B(豆粕粉)、D(KH2PO4)、E(CaCO3)、H(MnSO4)5個(gè)因素影響顯著。由p-value值可知，影響重要性大小依次為B(豆粕粉)、A(玉米粉)、E(CaCO3)、D(KH2PO4)、H(MnSO4)，選取前3個(gè)影響較大因素進(jìn)一步試驗(yàn)。

表2　Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，以芽孢產(chǎn)量的梯度方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)T值可知各因素對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響，玉米粉為負(fù)效應(yīng)，豆粕粉和CaCO3為正效應(yīng)，其余3個(gè)因素均取最低水平。由表3可知，第2組試驗(yàn)芽孢產(chǎn)量最高，說明最優(yōu)點(diǎn)在第2組試驗(yàn)附近。選擇第2組為響應(yīng)面中心點(diǎn)，即玉米粉10.5 g/L、豆粕粉24.0 g/L、CaCO37.5 g/L，進(jìn)一步試驗(yàn)。

表3　最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

2.4響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果由最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果所得中心點(diǎn)，運(yùn)用minitab.V17.1.0創(chuàng)建Box-Benhnken進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

以芽孢產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值，各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響可用下列函數(shù)表示：

表4　Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

芽孢產(chǎn)量(Y)響應(yīng)值最大時(shí)的各因素水平為：X1=10.697 0，X2=24.378 8，X3=7.434 3，此時(shí)芽孢產(chǎn)量預(yù)測值為7.638 1×109cfu/mL。

發(fā)酵最優(yōu)條件為：玉米粉10.7g/L,豆粕粉24.4g/L,CaCO37.4g/L,NaCl5.0g/L,MnSO40.4g/L,KH2PO41.0g/L,裝液量50mL/250mL,轉(zhuǎn)速200r/min,初始pH7.2,溫度30 ℃,接種量2.0%。在上述條件下對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測和分析。優(yōu)化發(fā)酵條件試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵條件優(yōu)化后的芽孢產(chǎn)量比優(yōu)化前大大提高(表5)。

運(yùn)用minitab.V17.1.0軟件可得到3個(gè)重要因子之間的響應(yīng)面曲面圖及其等高線圖。等高線的形狀反映因子交互作用的強(qiáng)弱，橢圓表示交互作用顯著，圓形表示交互作用不顯著。

由圖2可知，CaCO3濃度一定時(shí)，隨著玉米粉和豆粕粉的不斷增加，芽孢產(chǎn)量開始不斷提高，后期小幅度下降。一定程度上增加玉米粉有利于芽孢產(chǎn)生，但過多的玉米粉導(dǎo)致C/N過高，不利于芽孢產(chǎn)量的提高。

表5發(fā)酵條件優(yōu)化前后芽孢產(chǎn)量對(duì)比

Table5Comparisonofsporeproductionbeforeandafterfermentationoptimization

×109 cfu/mL

圖2　玉米粉、豆粕粉與芽孢產(chǎn)量的響應(yīng)面和等高線Fig.2　Response surface and contour plot of corn flour and soybean meal powder

由圖3可知，當(dāng)豆粕粉一定時(shí)，芽孢產(chǎn)量隨玉米粉和CaCO3的不斷增加而先增加后減少，說明碳源的過高或過低都不利于芽孢的積累。CaCO3對(duì)芽孢產(chǎn)量影響較顯著，表現(xiàn)為較陡的曲面，玉米粉對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響較小，曲面平滑。

由圖4可知，豆粕粉與CaCO3的交互作用影響小于玉米粉與CaCO3。在玉米粉一定時(shí)，隨著豆粕粉和CaCO3的不斷增加，芽孢產(chǎn)量呈現(xiàn)開始上升，到達(dá)最高點(diǎn)后下降。豆粕粉和CaCO3對(duì)芽孢產(chǎn)量都有較大影響，合適的豆粕粉和CaCO3濃度有利于芽孢的積累。

圖3　玉米粉、CaCO3與芽孢產(chǎn)量的響應(yīng)面和等高線Fig.3　Response surface and contour plot of corn flour and CaCO3

圖4　豆粕粉、CaCO3與芽孢產(chǎn)量的響應(yīng)面和等高線Fig.4　Response surface and contour plot of soybean meal powder and CaCO3

2.5模型的驗(yàn)證綜合響應(yīng)面結(jié)果分析，應(yīng)用minitab.V17.1.0軟件分析得出芽孢產(chǎn)量的最佳發(fā)酵條件為X1=10.697 0，X2=24.378 8，X3=7.434 3，此時(shí)芽孢產(chǎn)量預(yù)測值為7.638 1×109cfu/mL。采用上訴最優(yōu)條件進(jìn)行試驗(yàn)，得到芽孢產(chǎn)量為7.4×109cfu/mL與預(yù)測值7.638 1×109cfu/mL接近，表明該模型能較好地預(yù)測實(shí)際芽孢產(chǎn)量情況。

3　結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Plackett-Burman試驗(yàn)從眾多因素中篩選出顯著因素分別為玉米粉、豆粕粉、CaCO3。用爬坡試驗(yàn)靠近最大值范圍，通過Box-Behnken試驗(yàn)得到顯著因素的最佳水平，最終得出最佳發(fā)酵條件為：玉米粉10.7 g/L、豆粕粉24.4 g/L、CaCO37.4 g/L、NaCl 5.0 g/L、MnSO40.4 g/L、KH2PO41.0 g/L、裝液量50 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速為200 r/min、初始pH 7.2、溫度30 ℃、接種量2.0%。實(shí)際得到芽孢產(chǎn)量為7.4×109cfu/mL，比優(yōu)化前提高了80.49%，與預(yù)測值接近，表明預(yù)測模型可用于實(shí)際生產(chǎn)中。

[1] 李俊，姜昕，李力，等.微生物肥料的發(fā)展與土壤生物肥力的維持[J].中國土壤與肥料，2006(4)：1-5.

[2] 王曉閣.枯草芽孢桿菌研究進(jìn)展與展望[J].中山大學(xué)研究生學(xué)刊(自然科學(xué)·醫(yī)學(xué)版)，2012(3)：14-23.

[3] 錢銘庸.發(fā)酵工程最優(yōu)化控制[M].南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1998.

[4] 張?jiān)撇?，孫謐，王躍軍，等.黃海黃桿菌YS-9412-130產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].海洋水產(chǎn)研究，2000，21(4)：26-35.

[5] GREENE H C.Colony organization of certain bacteria with reference to sporulation[J].J Bacteriol，1938，35(3)：261-273.

[6] 張彥杰，羅俊彩，武燕萍，等.生防枯草芽孢桿菌研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)儀器，2009(4)：19-23.

[7] 劉濤，黃保華，石天虹，等.一株發(fā)酵床接種用枯草芽孢桿菌的分離鑒定[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(11)：71-73.

[8] 紀(jì)明山，王建坤，王芳，等.枯草芽孢桿菌B36菌株可濕性粉劑防治番茄灰霉病的田間藥效[C]//中國化工學(xué)會(huì)農(nóng)藥專業(yè)委員會(huì)第十四屆年會(huì).沈陽，2010.

[9] 王星云，宋卡魏，張榮意.枯草芽孢桿菌菌劑的開發(fā)應(yīng)用[J].廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2007(2)：32-35.

[10] MRUDULA S，REDDY G，SEENAYYA G.Optimization of medium components using response surface methodology for production of thermostable amylopullulanase in submerged fermentation byClostridiumthermosulfurogenesSVM17[J].Malaysian journal of microbiology，2011，7(4)：181-191.

[11] DASARI V R R K，DONTHIREDDY S R R，NIKKU M Y，et al.Optimization of medium constituents for Cephalosporin C production using response surface methodology and artificial neural networks[J].Journal of biochemical technology，2009，1(3)：69-74.

[12] 王西祥，丁延芹，杜秉海，等.響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌 NS178產(chǎn)芽孢發(fā)酵工藝[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015(4)：59-65.

[13] 梁昌聰，郭立佳，劉磊，等.響應(yīng)面法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌C101發(fā)酵培養(yǎng)基[J].生物技術(shù)通報(bào)，2014(8)：169-174.

[14] 杜連祥.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2005.

Optimization of Fermentation Condition for Spore Production of Plant Growth PromoterBacillussubtilisCK15 by Response Surface Methodology

HUANG Shi-hai, PAN Hui-qun, HUANG Guang-shang, BAI Xian-fang*et al

(College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530004)

[Objective] To optimize the fermentation condition ofBacillussubtilisCK15 and to enhance the Spore Production yield. [Method] Single factor test was used to optimize the type and concentration of carbon source, type and concentration of nitrogen source, the type of inorganic salt, loaded liquid volume, shaker speed, initial pH, temperature and inoculum size. The optimal concentrations of three factors were determined by Plackett-Burman design; and the optimal concentrations of three factors were obtained by Box-Behnken test. [Result] The spore production was 7.4 × 109cfu/mL under the conditions of 10.7 g/L corn flour, 24.4 g/L soybean meal powder, 7.4 g/L CaCO3, 5 g/L NaCl, 0.4 g/L MnSO4, 1.0 g/L KH2PO4, 50 mL/250 mL loaded liquid volume, 200 r/min rotation speed, initial pH 7.2, 30 ℃ temperature, and 2 % inoculation amount. Thus, the spore production increased by 80.49% than before. [Conclusion] The response surface method effectively improves the spore production ofBacillussubtilisCK15.

Bacillussubtilis; Spore; Response surface method

黃時(shí)海(1967-)，男，廣西南寧人，教授，博士，從事食品與發(fā)酵工程研究。 *通訊作者，教授，碩士生導(dǎo)師，從事生物技術(shù)研究。

2016-04-08

S 144

A

0517-6611(2016)20-025-05